專利名稱：Ⅱ型登革病毒kmb17細胞適應株及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種病毒株的制備方法，尤其是II型登革病毒在KMB17細胞上的適應株的分離、篩選、選育、純化以及培養方法，屬于病毒疫苗技術領域。
背景技術：
登革病毒是以埃及伊蚊和白紋伊蚊等進行傳播的蟲媒病毒，廣泛流行于世界100多個熱帶和亞熱帶國家及地區，能引起登革熱、登革出血熱及更為嚴重的登革出血休克征。依抗原性不同可將登革病毒分為I、II、III、IV四個血清型，其中II型傳播最廣泛。近年來， 由于全球氣候變暖、人口流動頻繁等因素，登革熱在全世界的發病率提高了近30倍。在過去兩年中全球登革熱感染人群的數量持續增長，在東南亞中部和南部地區、美國以及南太平洋地區，每年約8000萬人感染登革病毒，估計24000人死亡，超過100個國家的30億人受到威脅。登革熱是過去50年間世界上最為嚴重的傳染病之一，已經成為嚴重的全球公共衛生問題。登革熱不僅嚴重危害人民的健康，而且還為國家和個人帶來嚴重的經濟負擔。由于還沒有可供使用的登革熱疫苗用于預防，登革熱的防控形式日趨嚴峻，因此登革熱疫苗相關的應用基礎研究是一項迫在眉睫的任務。現有的滅活和減毒活疫苗，主要以Vero、PDK、PGMK和FrhL等非人源性細胞為基質進行生產的，其殘余DNA存在潛在的致病危險。普遍認為比較安全且免疫效果好的，仍然是用人源性細胞基質(如KMB17細胞)生產的疫苗，但已知的人源性登革病毒宿主細胞非常局限，能用于疫苗生產的還未發現。人胚肺二倍體細胞KMB17用于人用疫苗具有很多優點無致癌性，且安全性高于其它細胞，易于規模化生產，而且對多種病毒具有廣泛的敏感性，用其制備病毒性疫苗，還可克服使用原代細胞時在其培養物中可能存在的各種潛在致病因子的危險，作為人源性細胞基質生產人用疫苗時，引入的外源因子較少，比動物來源的細胞基質具有更好的安全性，是當前病毒性疫苗生產較為理想的細胞基質，且能穩定實現大規模疫苗生產。人胚肺二倍體細胞KMB17，已經成功應用于甲肝疫苗、脊髓灰質炎疫苗的生產，其安全性和細胞穩定性都得到了廣泛驗證，但目前還沒有成功應用于II型登革病毒中國株的報導。

發明內容
本發明的目的在于提供一種II型登革病毒KMB17細胞適應株及其制備方法，為將人胚肺二倍體細胞KMB17應用于II型登革病毒疫苗的生產提供技術支持。本發明提供的II型登革病毒KMB17細胞適應株通過下列步驟獲得
I)、按Iml病毒液/瓶的量，將濃度為4. OMOI的II型登革病毒液接種到生長致密，透明度好的白紋伊蚊細胞C6/36上，于溫度為28±2°C、C02體積濃度為5% (v/v)的環境中，恒溫吸附I小時，于相同環境中，按1:9的體積比,補加下列病毒維持液RPMI_1640培養基+ 2%體積比(v/v)的小牛血清+ 2%體積比(v/v)的質量濃度為6.6% (w/v)的碳酸氫鈉溶液，培養至第5天，于相同環境中，按2%體積比補加質量濃度為6. 6%(w/v)的碳酸氫鈉溶液，培養至第8 9天，當白紋伊蚊細胞C6/36病變CPE達++++時，收集細胞液，于4°C，3500 X g尚心分尚5min,收獲上清，即得病毒液；
2)、將步驟I所得病毒液，按Iml病毒液/瓶的量，接種到生長致密，透明度好的白紋伊蚊細胞C6/36上，于溫度為28±2°C、CO2體積濃度為5% (v/v)的環境中，恒溫吸附I小時，于相同環境中，按1:9的體積比，補加下列病毒維持液RPMI-1640培養基+ 2%體積比(v/v)的小牛血清+ 2%體積比(v/v)的質量濃度為6. 6% (w/v)的碳酸氫鈉溶液，培養至第5天，于相同環境中，按2%的體積比補加質量濃度為6. 6%(w/v)的碳酸氫鈉溶液，培養至第8 9天，當白紋伊蚊細胞C6/36病變CPE達++++時，收集細胞液，于4°C，3500Xg離心分離5min，收獲上清，即得病毒液；如此連續傳代培養三代以上，直至獲得傳代穩定的II型登革病毒液；
3)、按Iml病毒液/瓶的量，將步驟2所得傳代穩定的II型登革病毒液，接種到鋪滿單層、生長狀態良好且致密的人胚肺二倍體細胞KMB17上，同時按1:9的體積比，加入下列病 毒維持液MEM培養基+ 5%體積比(v/v)的小牛血清+ 2%體積比(v/v)的質量濃度為
6.6% (w/v)的碳酸氫鈉，于溫度為37土O. 50C XO2體積濃度為5% (v/v)的環境中，恒溫培養至第4天，于相同環境下，按2%的體積比補加質量濃度為6. 6% (w/v)的碳酸氫鈉溶液，培養至第7天，當人胚肺二倍體細胞KMB17病變CPE達++++時，收獲已出現細胞病變CPE的病毒液，并于-70°C下保存；
4)、將步驟3的病毒液反復凍融2次，于4°C，3500Xg離心分離5min，收獲上清，得病毒液，將該病毒液按Iml病毒液/瓶的量接種到鋪滿單層、生長狀態良好且致密的人胚肺二倍體細胞KMB17上，同時按1:9的體積比，加入下列病毒維持液MEM培養基+ 5%體積比(v/v)的小牛血清+ 2%體積比(v/v)的質量濃度為6. 6% (w/v)的碳酸氫鈉；于溫度為37土O. 5°C、CO2體積濃度為5% (v/v)的環境中，恒溫培養至第4天，于相同環境下，按2%的體積比補加質量濃度為6. 6% (w/v)的碳酸氫鈉溶液，培養至人胚肺二倍體細胞KMB17病變CPE達++++時，獲得能夠在KMB17細胞上增殖的登革病毒毒種，并于_70°C下保存；如此連續傳代培養三代以上，直至獲得傳代穩定的II型登革病毒液，即得到在人胚肺二倍體細胞KMB17上適應的II型登革病毒適應株。所述每瓶的細胞數量為I I. 7X 106。所述步驟I)的白紋伊蚊細胞C6/36經過下列傳代培養按常規在細胞中加入下列細胞生長液RPMI-1640培養基加10%體積比(v/v)的小牛血清；放置于溫度為28土2°C，二氧化碳體積濃度為5% (v/v)的環境中，恒溫培養，培養2-3天換液一次，培養4-5天細胞長成形態良好致密單層。所述步驟3)的人胚肺二倍體細胞KMB17經過下列培養按常規細胞培養方法對KMB17細胞進行培養，所用細胞生長液為MEM培養液加10%體積比(v/v)的小牛血清，細胞傳代培養2-3天，使細胞長成形態良好致密單層。通過本發明能將流行的II型登革病毒株在人胚肺二倍體細胞KMB17上適應，從而得到能穩定傳代且病毒擴增量高的細胞適應株，經噬斑純化獲得毒力較強、純度較高的純化株，經鑒定，該病毒純化株保持了原始毒株的基本生物學特性，且具有較好的抗原性。能夠以人胚肺二倍體細胞KMB17為基質，進行II型登革病毒擴增，打破了 II型登革病毒宿主細胞的局限性，為具有我國地域特色的預防登革病毒疫苗的研發開拓新的思路，為研發II型登革病毒滅活和減毒活疫苗奠定基礎，同時也具備大規模生產的可行性，此疫苗的研發將產生巨大的經濟價值和社會效益。


圖I為正常KMB17細胞(顯微鏡放大40倍)；
圖2為登革病毒感染KMB17細胞后的細胞病變(CPE)(顯微鏡放大40倍)；
圖3為不同條件下II型登革病毒中國株感染KMB17細胞的感染性滴度；
圖4為II型登革病毒中國株I 10代的感染性滴度； 圖5為正常KMB17細胞的免疫熒光觀察(X 100);
圖6為II型登革病毒中國株感染KMB17細胞的免疫熒光觀察(X100)；
圖7為登革病毒特異基因片段；
圖8為Tl型登革病毒特異基因
片段；
圖9為II型登革病毒細胞適應株在KMB17細胞中的第一次噬斑純化；
圖10為II型登革病毒細胞適應株在KMB17細胞中的第二次噬斑純化；
圖11為II型登革病毒細胞適應株在KMB17細胞中的第三次噬斑純化；
圖12為透射電鏡觀察純化的II型登革病毒KMB17細胞適應株；
圖13為Real-time檢測II型登革病毒細胞適應株在KMB17細胞中的擴增曲線；
圖14為Real-time檢測II型登革病毒細胞適應株在KMB17細胞中的溶解曲線。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明做進一步描述。實施例I
1)、白紋伊蚊細胞C6/36經過下列傳代培養按常規在細胞中加入下列細胞生長液RPMI-1640培養基加10%體積比(v/v)小牛血清；放置于溫度為28±2°C，二氧化碳體積濃度為5% (v/v)的環境中，恒溫培養，培養2-3天換液一次，培養4-5天細胞長成形態良好致密
單層；
2)、按Iml病毒液/瓶的量，將濃度為4.Omol的II型登革病毒液接種到步驟I)的生長致密，透明度好的白紋伊蚊細胞C6/36上，每瓶的細胞數量為I 1.7X106，于溫度為28土2°C、CO2體積濃度為5% (v/v)的環境中，恒溫吸附I小時，于相同環境中，按1:9的體積比，補加下列病毒維持液RPMI-1640培養基+ 2%體積比(v/v)的小牛血清+ 2%體積比(v/v)的質量濃度為6. 6% (w/v)的碳酸氫鈉溶液，培養至第5天，于相同環境中，按2%的體積比補加質量濃度為6. 6% (w/v)的碳酸氫鈉溶液，培養至第8天，當白紋伊蚊細胞C6/36病變CPE達++++時，收集細胞液，于4°C，3500 X g離心分離5min，收獲上清，即得病毒液；
3)、將步驟2)所得病毒液，按Iml病毒液/瓶的量接種到生長致密，透明度好的白紋伊蚊細胞C6/36上，每瓶的細胞數量為I I. 7 X 106，于溫度為28±2°C、CO2體積濃度為5%(v/v)的環境中，恒溫吸附I小時，于相同環境中，按1:9的體積比，補加下列病毒維持液RPMI-1640培養基+ 2%體積比(v/v)的小牛血清+ 2%體積比(v/v)的質量濃度為6. 6%(w/V)的碳酸氫鈉溶液，培養至第5天，于相同環境中，按2%的體積比補加體積濃度為6. 6%(w/V)的碳酸氫鈉溶液，培養至第8天，當白紋伊蚊細胞C6/36病變CPE達++++時，收集細胞液，于4°C，3500 X g離心分離5min，收獲上清，即得病毒液；如此連續傳代培養三代，獲得傳代穩定的II型登革病毒液；
4)、人胚肺二倍體細胞KMB17經過下列培養按常規細胞培養方法對KMB17細胞進行培養，所用細胞生長液為MEM培養液加10%體積比(V /v)的小牛血清，細胞傳代培養2-3天，使細胞長成形態良好致密單層；
5)、按Iml病毒液/瓶的量，將步驟3)所得傳代穩定的II型登革病毒液，接種到步驟
4)的鋪滿單層、生長狀態良好且致密的人胚肺二倍體細胞KMB17上，每瓶的細胞數量為I I. 7X106，同時按1:9的體積比，加入下列病毒維持液MEM培養基+ 5%體積比(v/v)的小牛血清+ 2%體積比(v/v)的質量濃度為6. 6% (w/v)的碳酸氫鈉，于溫度為37土O. 5°C、C02體積濃度為5% (v/v)的環境中，恒溫培養至第4天，于相同環境下，按2%的體積比補加質量濃度為6. 6%(w/v)的碳酸氫鈉溶液，培養至第7天，當人胚肺二倍體細胞KMB17病變CPE達++++時，收獲已出現細胞病變CPE的病毒液，并于_70°C下保存；
6)、將步驟5)的病毒液反復凍融2次，于4°C，3500Xg離心分離5min，收獲上清，得病毒液，將該病毒液按Iml病毒液/瓶的量接種到鋪滿單層、生長狀態良好且致密的人胚肺二倍體細胞KMB17上，每瓶的細胞數量為I I. 7X 106，同時按1:9的體積比，加入下列病毒維持液MEM培養基+ 5%體積比(v/v)的小牛血清+ 2%體積比(v/v)的質量濃度為6. 6%(w/v)的碳酸氫鈉；于溫度為37±0. 50CXO2體積濃度為5% (v/v)的環境中，恒溫培養至第4天，于相同環境下，按2%的體積比補加質量濃度為6. 6%(w/v)的碳酸氫鈉溶液，培養至人胚肺二倍體細胞KMB17病變CPE達++++時，獲得能夠在KMB17細胞上增殖的登革病毒毒種，并于-70°C下保存；如此連續傳代培養三代，獲得傳代穩定的II型登革病毒液，即得到在人胚肺二倍體細胞KMB17上適應的II型登革病毒適應株。登革病毒KMB17細胞適應株毒種檢測
I)病毒滴定檢測
采用微量滴定法測定每代病毒液感染性滴度，檢測結果顯示，II型登革病毒中國株在KMB17細胞上連續傳代10代，病毒滴度呈持續升高直至穩定的適應過程，傳第1、2代最低，細胞無明顯病變，傳至第3代時，細胞開始有明顯病變，病毒的感染滴度達到3. 00lgCCID50/ml，至第9、10代滴度最高，達到5. O lgCCID50/ml。病毒通過10代連續傳代，選育出良好的KMB17細胞適應株。2) II型登革病毒KMB17細胞適應株在KMB17細胞中的噬斑純化
利用KMB17細胞對選育出的II型登革病毒細胞適應株進行噬斑篩選純化棄去6孔板中已生長成單層的KMB17細胞的培養液，用Hanks液漂洗2次。隨后用不含血清的維持液將病毒稀釋后以4. OMOI濃度接種細胞，置37±0. 5 °C孵育4h，每隔15min輕輕水平晃動培養板數次，以保證病毒與細胞充分接觸。吸附完畢后吸出病毒液，加ImL含O. I %中性紅及5%胎牛血清的MEM瓊脂糖培養基，倒置于37土O. 5 °C，5 %C02 (w/v)恒溫培養箱中培養。2天之后每天觀察2次，記錄蝕斑出現和生長情況，直至大小適宜時吸取斑點，以維持液稀釋后接種96孔板，收集病變孔的培養液，以上述方法進行3輪噬斑純化。通過實驗，3輪噬斑·純化均在3天后出現微小斑點，至5-6天斑點直徑長至約8-lOum，以此方法篩選出純化的II型登革病毒適應株。3)病毒的純化和電鏡檢測
在KMB17細胞中大量培養擴增病毒，將收獲的病毒液以4°C，8000rpm*15min離心后取上清液，加入PEG6000至終濃度為8%，4°C搖晃18h后，4°C，12000rpm*30min離心并棄掉上清液，沉淀以原體積1/30的O. 01mol/L PBS液進行溶解，隨后以12000rpm*15min離心并取上清液，上清液置于蔗糖墊最上層，通過蔗糖密度梯度離心法純化病毒，再經過38000rpm*2h超速離心并棄上清，沉淀以原體積1/100的O. 01mol/L PBS液進行溶解并收集，最終獲得濃縮的純化病毒。經濃縮純化后收獲到體積濃縮100倍的病毒液。登革病毒KMB17細胞適應株毒種鑒定
I、登革病毒的免疫熒光檢測 用免疫熒光法檢測II型登革病毒純化株抗原性。以KMB17細胞接種放有玻片的6孔板，長至單層后，其中4孔細胞接種IOOul/孔(2. (MOI)Tl型登革病毒，2孔作陰性對照，用含5%血清MEM培養基于37°C、5% CO2條件下培養。在種毒后第72小時取出孔里的玻片進行熒光染色。一抗為 1型登革病毒抗血清，二抗為FITC標記的羊抗人IgG。II型登革病毒中國株在KMB17細胞上傳代10代后，以II型登革病毒抗血清進行免疫熒光染色。結果顯示，在接種病毒的細胞內可見明亮的綠色熒光，而對照組細胞內未見綠色熒光，表明選育出的適應株在KMB17細胞中可以增殖并具有良好的抗原性。2、RT-PCR擴增登革病毒特異性基因
將收獲的II型登革病毒液接種KMB17細胞后72小時，裂解細胞提取總RNA，根據衛生部發行的《登革熱診斷標準》中所述的“RT-PCR技術檢測登革病毒RNA及型別鑒定”方法，合成登革病毒通用檢測引物D1、D2及登革病毒型特異性引物TS2，通過RT-PCR對II型登革病毒特異性基因進行擴增。反應條件50°C 30分鐘合成cDNA ;94°C預變性2分鐘；然后以94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸I分鐘條件進行PCR循環，共35個循環；最后72°C延伸7min。引物序列見表I :經瓊脂糖凝膠電泳分析，分別獲得511bp的登革病毒特異基因片段和119bp的 1型登革病毒特異性片段。表I登革病毒特異性引物
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3、純化登革病毒的電鏡檢測
純化的病毒經磷鎢酸負染后，通過日立H-7650透射電鏡觀察病毒顆粒形態。透射電鏡觀察可見經純化后登革病毒顆粒仍保持正常形態，直徑約為51nm。4、適應株在KMB17細胞中增殖動力學檢測
收獲II型登革病毒細胞適應株第3 7天的病毒培養物，提取病毒RNA為模板檢測登革病毒在細胞中的增殖動態，Real-time PCR顯示病毒接種KMB17細胞后第3天已經開始增殖，在第5至6天增殖最為迅速，在第7天病毒增殖達到最高峰。
結論通過本專利中所提供的系列技術方案，選育出了能穩定傳代且病毒擴增量高的II型登革病毒KMB17細胞的適應株，并對適應株在KMB17細胞上的培養條件進行優化。通過噬斑純化獲得毒力較強、純度較高的純化株，經各項檢測及鑒定證明病毒純化株保持了原始毒株的基本生物學特性，且具有較好的抗原性。上述工作證實了以KMB17細胞為基 質進行登革病毒擴增的可行性，打破了登革病毒宿主細胞局限性，為具有我國地域特色的預防性登革病毒疫苗的研發開拓新的思路，為研發我國擁有自主知識產權的登革病毒滅活和減毒活疫苗奠定基礎，同時也具備大規模生產的可行性，此疫苗的研發將產生巨大的經濟價值和社會效益。
權利要求
1.一種II型登革病毒KMB17細胞適應株，其特征在于通過下列步驟獲得 1)、按Iml病毒液/瓶的量，將濃度為4.OMOI的II型登革病毒液接種到生長致密，透明度好的白紋伊蚊細胞C6/36上，于溫度為28土2°C、CO2體積濃度為5%的環境中，恒溫吸附I小時，于相同環境中，按1:9的體積比，補加下列病毒維持液RPMI-1640培養基+ 2%體積比的小牛血清+ 2%體積比的質量濃度為6. 6%的碳酸氫鈉溶液，培養至第5天，于相同環境中，按2%的體積比補加質量濃度為6. 6%的碳酸氫鈉溶液，培養至第8 9天，當白紋伊蚊細胞C6/36病變CPE達++++時，收集細胞液，于4°C，3500 X g離心分離5min，收獲上清，即得病毒液； 2)、將步驟I所得病毒液，按Iml病毒液/瓶的量，接種到生長致密，透明度好的白紋伊蚊細胞C6/36上，于溫度為28±2°C、C02體積濃度為5%的環境中，恒溫吸附I小時，于相同環境中，按1:9的體積比，補加下列病毒維持液RPMI-1640培養基+ 2%體積比的小牛血清+ 2%體積比的質量濃度為6. 6%的碳酸氫鈉溶液，培養至第5天，于相同環境中，按2%的體積比補加質量濃度為6. 6%的碳酸氫鈉溶液，培養至第8 9天，當白紋伊蚊細胞C6/36病變CPE達++++時，收集細胞液，于4°C，3500 X g離心分離5min，收獲上清，即得病毒液；如此連續傳代培養三代以上，直至獲得傳代穩定的II型登革病毒液； 3)、按Iml病毒液/瓶的量，將步驟2所得傳代穩定的II型登革病毒液，接種到鋪滿單層、生長狀態良好且致密的人胚肺二倍體細胞KMB17上，同時按1:9的體積比，加入下列病毒維持液MEM培養基+ 5%體積比的小牛血清+ 2%體積比的質量濃度為6. 6%的碳酸氫鈉，于溫度為37土O. 5°C、CO2體積濃度為5%的環境中，恒溫培養至第4天，于相同環境下，按2%的體積比補加質量濃度為6. 6%的碳酸氫鈉溶液，培養至第7天，當人胚肺二倍體細胞KMB17病變CPE達++++時，收獲已出現細胞病變CPE的病毒液，并于_70°C下保存； 4)、將步驟3的病毒液反復凍融2次，于4°C，3500X g離心分離5min，收獲上清，得病毒液，將該病毒液按Iml病毒液/瓶的量接種到鋪滿單層、生長狀態良好且致密的人胚肺二倍體細胞KMB17上，同時按1:9的體積比，加入下列病毒維持液MEM培養基+ 5%體積比的小牛血清+ 2%體積比的質量濃度為6. 6%的碳酸氫鈉；于溫度為37±0. 5°C、CO2體積濃度為5%的環境中，恒溫培養至第4天，于相同環境下，按2%的體積比補加質量濃度為6. 6%的碳酸氫鈉溶液，培養至人胚肺二倍體細胞KMB17病變CPE達++++時，獲得能夠在KMB17細胞上增殖的登革病毒毒種，并于_70°C下保存；如此連續傳代培養三代以上，直至獲得傳代穩定的II型登革病毒液，即得到在人胚肺二倍體細胞KMB17上適應的II型登革病毒適應株。
2.如權利要求I所述的II型登革病毒KMB17細胞適應株，其特征在于所述每瓶的細胞數量為I I. 7X106。
3.如權利要求I所述的II型登革病毒KMB17細胞適應株，其特征在于所述步驟I)的白紋伊蚊細胞C6/36經過下列傳代培養按常規在細胞中加入下列細胞生長液RPMI-1640培養基加10%體積比的小牛血清；放置于溫度為28±2°C，C02體積濃度為5%的環境中，恒溫培養，培養2-3天換液一次，培養4-5天細胞長成形態良好致密單層。
4.如權利要求I所述的II型登革病毒KMB17細胞適應株，其特征在于所述步驟3)的人胚肺二倍體細胞KMB17經過下列培養按常規細胞培養方法對KMB17細胞進行培養，所用細胞生長液為MEM培養液加10%體積比的小牛血清，細胞傳代培養2-3天，使細胞長成形態良好致密單層。
全文摘要
本發明公開一種Ⅱ型登革病毒KMB17細胞適應株及其制備方法，能將流行的Ⅱ型登革病毒株在人胚肺二倍體細胞KMB17上適應，從而得到能穩定傳代且病毒擴增量高的細胞適應株，經噬斑純化獲得毒力較強、純度較高的純化株，經鑒定，該病毒純化株保持了原始毒株的基本生物學特性，且具有較好的抗原性。能夠以人胚肺二倍體細胞KMB17為基質，進行Ⅱ型登革病毒擴增，打破了Ⅱ型登革病毒宿主細胞的局限性，為具有我國地域特色的預防登革病毒疫苗的研發開拓新的思路，為研發Ⅱ型登革病毒滅活和減毒活疫苗奠定基礎，同時也具備大規模生產的可行性，此疫苗的研發將產生巨大的經濟價值和社會效益。
文檔編號C12R1/93GK102911920SQ20121044649
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月9日 優先權日2012年11月9日
發明者孫強明, 趙玉嬌, 潘玥, 陳俊英, 楊麗娟, 岳耀斐, 黃新偉, 施海晶, 丁曉潔 申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所