專利名稱：通過敲除基因構(gòu)建高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶蘇云金芽胞桿菌的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過敲除yvoA基因提高蘇云金芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的方法，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)是一種革蘭氏陽性菌,其在生長周期的穩(wěn)定期形成的芽胞及伴胞晶體使其獨具特性。由于蘇云金芽胞桿菌制劑對靶標昆蟲有特異性毒殺作用，且對人畜安全、不危害環(huán)境，在農(nóng)業(yè)、林業(yè)和衛(wèi)生害蟲的防治上得到了廣泛應用。許多Bt菌除了合成殺蟲晶體蛋白夕卜，也能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。Bt幾丁質(zhì)酶不僅具有殺蟲增效作用，對病原真菌也有抑制作用，具有防治農(nóng)作物病蟲害的作用(Liu D, Cai J, Xie CC, Liu C，Chen YH. Purification and partial characterizationof a 36-kDa chitinase from Bacillus thuringiensis subsp. colmeri, and itsbiocontrol potential. Enzyme and Microbial Technology, 2010, 46(34): 252 - 256.Xiao L, Xie CC, Cai J, Lin ZJ, Chen YH. Identification and characterization ofa chitinase-produced Bacillus showing significant antifungal activity.Current Microbiology, 2009, 58(5) :528 - 533. ) 此外，由幾丁質(zhì)酶分解產(chǎn)生的幾丁寡糖有明顯的抗腫瘤作用，可激活巨噬細胞和淋巴細胞，增強機體免疫力，已用于抗癌的臨床治療以及藥物及保健食品的開發(fā)領域(Khoushab F, Yamabhai M. Chitin researchrevisited. Marine Drugs, 2010, 8(7):1988 - 2012. ；Zhao Y, Park RD, Muzzarelli RAA.Chitin deacetylases!properties and applications. Marine Drugs, 2010, 8(I):24-46.；Zhou Z, Zheng T, Homer R J, Kim Y, Chen N Y, Cohn L, Hamid Q and Elias J A. AcidicMammalian Chitinase in AsthmaticTh2 Inflammation and IL-13Pathway Activation.Science, 2004，304:1678 1682.)。因此幾丁質(zhì)酶在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、食品、醫(yī)藥等領域展現(xiàn)出良好前景，具有重要的經(jīng)濟價值。但由于Bt菌株幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量普遍較低，制約了其在實際生產(chǎn)中的應用。因此，提高Bt幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量是幾丁質(zhì)酶開發(fā)應用的關鍵問題之一。目前，國內(nèi)外提高Bt幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的方法主要是篩選高產(chǎn)菌株，優(yōu)化發(fā)酵條件，而甚少應用分子生物學技術對菌株進行改良來提高其產(chǎn)量。YvoA蛋白(Gene ID: JQ579452)，作為芽孢桿菌中的一種調(diào)控蛋白，在N-乙酰葡糖胺的代謝過程中發(fā)揮著關鍵的作用，相關研究表明，YvoA蛋白對幾丁質(zhì)酶的合成具有一定的阻遏作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有Bt菌株幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量普遍較低的問題，提供一種通過敲除基因構(gòu)建高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶蘇云金芽胞桿菌的方法及應用。本方法利用分子生物學技術，首先以溫度敏感型載體PKSV7為骨架構(gòu)建一個基因敲除載體pKSV-ued，經(jīng)過電轉(zhuǎn)化導入蘇云金芽胞桿菌ATCC35646菌株中。利用同源重組原理，通過雙交換過程敲除蘇云金芽胞桿菌ATCC35646基因組yvoA基因，從而構(gòu)建一種高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的蘇云金芽胞桿菌CJ212 (見圖I)。本發(fā)明提供的通過敲除yvoA基因構(gòu)建高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis) CJ212 的方法包括第I、yvoA基因敲除載體pKSV_ued的構(gòu)建(見圖2)第I. I、設計序列表中SEQ ID No. I所示的引物yvoAup-F和SEQ ID No. 2所示的引物yvoAup-R，以蘇云金芽胞桿菌ATCC35646基因組DNA為模版PCR擴增yvoA基因上游序列，獲得1059bp的yvoAup核酸片斷；第I. 2、設計序列表中SEQ ID No. 3所示的引物yvoAdown-F和SEQ ID No. 4所示 的引物yvoAdown-R，以蘇云金芽胞桿菌ATCC35646基因組DNA為模版PCR擴增yvoA基因下游序列，獲得1033bp的yvoAdown核酸片斷；第I. 3、設計序列表中SEQ ID No. 5所示的引物erm_F和SEQ ID No. 6所示的引物erm-R,以pHT315質(zhì)粒為模版PCR擴增包括啟動子和終止子的紅霉素抗性基因表達框，獲得1197bp的erm基因片斷。PCR擴增體系如下
total DNA5 μL
I OxPCR Buffer5 liL
MgCl2 (25mM )5‘uL
dNTP Mixture ( γ 2.5 mM )2.5 iiL
引物 I (10 μΜ)1.0 μ
引物 2 (10μΜ)1.0 μ
Taq 酶(5U々L)0.5 μ
無菌CldH2O補足至:50 μ PCR 程序擴增erm基因的程序94°C預變性4min ;94°C變性40s，48°C復性35s，72°C延伸I. lmin，共計30個循環(huán)，72°C延伸IOmin0擴增yvoAup序列和yvoAdown序列的程序94°C預變性4min ;94°C變性40s,50°C 47°C復性50s，72°C延伸I. lmin，每個循環(huán)降低1°C，循環(huán)4次；然后，94°C變性40s，50°C復性50s，72。。延伸I. lmin，循環(huán)26次，共計30個循環(huán)；72°C延伸IOmin0第I. 4、將第I. 3步獲得的erm基因片斷和載體pKSV7用SalI和Xba I雙酶切后，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建pKSV-e載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，提質(zhì)粒，酶切驗證正確后于-20°C保存?zhèn)溆茫坏贗. 5、yvoAup核酸片斷和載體pKSV-e用SalI和Hind III雙酶切后，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建pKSV-ue載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，提質(zhì)粒，酶切驗證正確后于_20°C保存?zhèn)溆茫坏贗. 6、將第I. 2步獲得的yvoAdown核酸片斷和第I. 5步獲得的pKSV-ue載體用XbaI和Kpn I雙酶切后，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建pKSV-ued載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，提質(zhì)粒，酶切驗證正確后于-20°C保存?zhèn)溆谩５?、CJ 212突變菌株的構(gòu)建(見圖3)以蘇云金芽胞桿菌ATCC35646為出發(fā)菌制備感受態(tài)細胞，采用電轉(zhuǎn)化方法，將第I步獲得的yvoA基因敲除載體pKSV-ued轉(zhuǎn)化入蘇云金芽胞桿菌ATCC35646，在基因組yvoA位點發(fā)生雙交換，ERM抗性平板上篩選得到紅霉素抗性菌株，命名為CJ212 ;該菌株的yvoA基因被紅霉素抗性基因所取代，成為缺失了 yvo A基因的突變菌株，即為所得到的菌株。所述敲除yvoA基因的蘇云金芽胞桿菌株CJ212可以在生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶中應用。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果蘇云金芽胞桿菌除了合成殺蟲晶體蛋白外，也能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。幾丁質(zhì)酶不僅具有殺蟲增效作用，對病原真菌也有抑制作用，具有防治農(nóng)作物病蟲害的作用。此外，由幾丁質(zhì)酶分解產(chǎn)生的幾丁寡糖有明顯的抗腫瘤作用，可激活巨噬細胞和淋巴細胞，增強機體免疫力，已用于抗癌的臨床治療以及藥物及保健食品的開發(fā)領域。因此幾丁質(zhì)酶在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、食品、醫(yī)藥等領域展現(xiàn)出良好前景，具有重要的經(jīng)濟價值。目前，國內(nèi)外在幾丁質(zhì)酶發(fā)酵條件和分離技術方面進行了大量研究，對于提高幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量有一定的效果，但發(fā)酵產(chǎn)量仍然難于滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的要求。因此利用基因工程技術，從分子水平對菌株進行改良將成為提高幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的手段。本發(fā)明通過分子生物學技術，成功構(gòu)建一株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株CJ212。與原始菌株ATCC35646相比，經(jīng)過改良的菌株CJ212幾丁質(zhì)酶量提高5. 23倍(見圖5)。此外，還可以通過這種方法，對其他蘇云金芽孢桿菌進行基因改造，以獲得相應的改良菌株，達到提高幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的目的。


圖I為本發(fā)明技術方案流程圖。圖2為yvoA基因敲除載體的構(gòu)建。圖3為yvoA基因敲除菌株的構(gòu)建。圖4 為 yvoA 基因敲除菌株 PCR 驗證，I DNAMarker, 2 ERM-F/Jiance-R 負對照，3 ERM-F/Jiance-R PCR產(chǎn)物，4 : Jiance-F/ERM-R PCR產(chǎn)物，5 : Jiance-F/ERM-R負對照。圖5為BtATCC35646和Bt CJ212幾丁質(zhì)酶活力比較。
具體實施例方式實施例I、構(gòu)建高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的蘇云金芽胞桿菌CJ 212本發(fā)明首先構(gòu)建yvoA基因敲除載體pKSV-ued,經(jīng)過電轉(zhuǎn)化將pKSV-ued載體轉(zhuǎn)化入蘇云金芽胞桿菌ATCC35646，經(jīng)過雙交換重組過程將其基因組內(nèi)的yvoA基因用紅霉素抗性基因代替，達到敲除yvoA基因的目的，從而構(gòu)建了一株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的蘇云金芽胞桿菌CJ212(見圖I)。通過PCR方法對突變菌株進行鑒定并測序；利用測定幾丁質(zhì)酶活的方法對菌體所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的量進行鑒定。
具體實施方式
如下(l)yvoA基因敲除載體pKSV-ued的構(gòu)建(見圖2)根據(jù)蘇云金芽胞桿菌yvoA基因(Gene ID: JQ579452)設計引物yvoAup-F (SEQID No. I)和 yvoAup-R (SEQ ID No. 2),以蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)ATCC35646基因組DNA為模版PCR擴增yvoA基因上游基因，獲得1083bp的yvoAup核酸片斷；設計引物yvoAdown-F (SEQ ID No. 3)和 yvoAdown-R (SEQ ID No. 4),以蘇云金芽胞桿菌ATCC35646基因組DNA為模版PCR擴增yvoA基因下游基因，獲得1033bp的yvoAdown基因片斷；設計引物erm-F (SEQ ID No.5Werm_R (SEQ ID No. 6)，以 pHT315 質(zhì)粒為模版PCR擴增包括啟動子和終止子的紅霉素抗性基因表達框，獲得1197bp的erm基因片斷。PCR擴增體系如下
total DNA5 μ
IOxPCR Buffer5 μL
MgCl2 (25 mM〕5 μ
dNTP Mixture (各 2.5 mM )2.5 μL
引物 I (10 μΜ)1.0 μ
引物 2 (10 μΜ)1.0 μ
Taq 酶(5U4iL)0.5 μι
無菌ddH20補足至50 μιvPCR 程序擴增yvoAup序列和yvoAdown序列的程序94°C預變性4min ;94°C變性40s,50°C 47°C復性50s，72°C延伸I. lmin，每個循環(huán)降低1°C，循環(huán)4次；然后，94°C變性40s，50°C復性50s，72。。延伸I. lmin，循環(huán)26次，共計30個循環(huán)；72°C延伸IOmin0擴增erm基因的程序94°C預變性4min ;94°C變性40s，48°C復性35s，72°C延伸I. lmin,共計30個循環(huán)，72°C延伸IOmin0erm基因片斷和載體pKSV7用Sal I和Xba I雙酶切后，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建pKSV-e載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，提質(zhì)粒，酶切驗證正確后與_20°C保存?zhèn)溆茫粂voAup核酸片斷和載體pKSV-e用Sal I和Hind III雙酶切后，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建pKSV-ue載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，提質(zhì)粒，酶切驗證正確后與_20°C保存?zhèn)溆茫粂voAdown核酸片斷和pKSV-ue載體用Xba I和Kpn I雙酶切后，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建pKSV-ued載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，提質(zhì)粒，酶切驗證正確后與_20°C保存?zhèn)溆谩?2) CJ 212突變菌株的構(gòu)建以蘇云金芽胞桿菌ATCC35646制備感受態(tài)細胞，采用電轉(zhuǎn)化方法，將獲得的yvoA基因敲除載體pKSV-ued轉(zhuǎn)化入蘇云金芽胞桿菌ATCC35646，在基因組yvoA位點發(fā)生雙交換，紅霉素抗性平板上篩選得到抗性菌株，命名為CJ212 ;該菌株的yvoA基因被紅霉素抗性基因erm所取代，成為了缺失了 yvoA基因的突變菌株，即為所得到的菌株(見圖3)。(3)缺失yvoA基因的突變菌株的驗證對蘇云金芽胞桿菌CJ212突變菌是否缺失了 yvoA基因進行分子驗證。由于菌株內(nèi)的yvoA基因被紅霉素抗性基因所取代，所以我們在yvoAup片段上游設計引物Jiance-F(SEQ ID N0·7)，在yvoAdown片段的下游設計引物Jiance-R(SEQ ID NO. 8)，以得到的蘇云金芽胞桿菌CJ212突變菌基因組DNA為模版，以引物Jiance-F和erm-R為一對引物，erm-F和Jiance-R為一對引物分別進行PCR擴增，擴增出與預期結(jié)果大小一致的產(chǎn)物(見圖4)。PCR 程序PCR 程序94 V 預變性 4min ；94 V 變性 40s，50 V 47 °C 復性 50s，72 V 延伸I. lmin，每個循環(huán)降低1°C，循環(huán)4次;然后，94°C變性40s，50°C復性50s，72°C延伸I. lmin,循環(huán)26次，共計30個循環(huán)；72°C延伸lOmin。同時，PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果(SEQ ID NO. 9)也表明原始菌株蘇云金芽胞桿菌CJ212菌株中的yvoA基因確實被紅霉素抗性基因所代替。結(jié)果證實我們成功得到了缺失yvoA基因的突變菌株蘇云金芽胞桿菌CJ212。實施例2、蘇云金芽胞桿菌CJ 212在生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶中應用 改良菌株蘇云金芽胞桿菌CJ212幾丁質(zhì)酶活力的測定取ImL菌體培養(yǎng)液于I. 5mL離心管中，8000rpm離心lOmin。取200 μ L上清液加入200 μ L含10%膠體幾丁質(zhì)的磷酸鹽緩沖液(pH 6. 0)，50°C水浴lh。加入200 μ L l%NaOH溶液終止反應，混勻后8000rpm離心IOmin ;取上清400 μ L于新的離心管中，加入等體積的DNS試劑溶液，混勻后沸水浴IOmin ;以沒有反應的培養(yǎng)液作對照，測0D535值。一個酶活力單位定義為50°C、pH 6. O條件下反應Imin產(chǎn)生I μ gN_乙酰_D_氨基葡萄糖(GlcNAc)所需要的酶量。酶活力測定結(jié)果均為3次以上實驗結(jié)果的平均值。GlcNAc標準曲線的制作將500 μ g/mLGlcNAc貯液稀釋成不同的濃度梯度，以不含GlcNAc為空白對照。取幾支干凈的試管，分別加入ImL稀釋好的不同濃度的GlcNAc溶液，再在各試管中加入ImL磷酸鹽緩沖液(pH 6. O)、ImL 1%的NaOH溶液和3mL DNS試劑溶液，混勻后在沸水浴中保溫IOmin0取出試管，冷卻后測定各溶液的0D535值，繪制標準曲線。經(jīng)過幾丁質(zhì)酶活測定，發(fā)現(xiàn)改良后的菌株蘇云金芽胞桿菌CJ212與原始菌株蘇云金芽胞桿菌ATCC35646相比，酶活從O. 832IU/mL提高到4. 357IU/mL，提高了 5. 23倍(見圖5)。
權(quán)利要求
1.一種通過敲除yvoA基因構(gòu)建高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)的方法,其特征在于該方法包括 第I、yvoA基因敲除載體pKSV-ued的構(gòu)建 第I. I、設計序列表中SEQ ID No. I所示的引物yvoAup-F和SEQ ID No. 2所示的引物yvoAup-R,以蘇云金芽胞桿菌ATCC35646基因組DNA為模版PCR擴增yvoA基因上游序列，獲得1059bp的yvoAup核酸片斷； 第I. 2、設計序列表中SEQ ID No. 3所示的引物yvoAdown-F和SEQ ID No. 4所示的引物yvoAdown-R，以蘇云金芽胞桿菌ATCC35646基因組DNA為模版PCR擴增yvoA基因下游序列，獲得1033bp的yvoAdown核酸片斷； 第I. 3、設計序列表中SEQ ID No. 5所示的引物erm-F和SEQ ID No. 6所示的引物erm-R,以pHT315質(zhì)粒為模版PCR擴增包括啟動子和終止子的紅霉素抗性基因表達框，獲得1197bp的erm基因片斷； 第1.4、將第1.3步獲得的沈111基因片斷和載體？1 ￥7用3&1 I和Xba I雙酶切后，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建pKSV-e載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，提質(zhì)粒，酶切驗證正確后于-20°C保存?zhèn)溆茫? 第I. 5、yvoAup片斷和載體pKSV-e用Sal I和Hind III雙酶切后，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建pKSV-ue載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，提質(zhì)粒，酶切驗證正確后于_20°C保存?zhèn)溆茫? 第I. 6、將第I. 2步獲得的yvoAdown片斷和第I. 5步獲得的pKSV_ue載體用Xba I和Kpn I雙酶切后，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建pKSV-ued載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，提質(zhì)粒，酶切驗證正確后于-20°C保存?zhèn)溆茫? 第2、CJ 212突變菌株的構(gòu)建 以蘇云金芽胞桿菌ATCC35646制備感受態(tài)細胞，采用電轉(zhuǎn)化方法，將第I步獲得的yvoA基因敲除載體pKSV-ued轉(zhuǎn)化入蘇云金芽胞桿菌ATCC35646，在基因組yvoA位點發(fā)生雙交換，紅霉素抗性平板上篩選得到紅霉素抗性菌株，命名為CJ212 ;該菌株的yvoA基因被紅霉素抗性基因所取代，成為缺失了 yvoA基因的突變菌株，即為所構(gòu)建的菌株。
2.—種權(quán)利要求I所述方法構(gòu)建的高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的蘇云金芽胞桿菌CJ212。
3.—種權(quán)利要求2所述敲除yvoA基因的蘇云金芽胞桿菌菌株CJ212在生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶中的應用。
全文摘要
通過敲除(yvoA)基因構(gòu)建高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶蘇云金芽胞桿菌的方法屬于生物工程技術領域。本方法首先以蘇云金芽胞桿菌ATCC35646為出發(fā)菌株，以溫度敏感型載體pKSV7為骨架構(gòu)建一個基因敲除載體pKSV-ued，利用同源重組原理，通過雙交換過程敲除蘇云金芽胞桿菌ATCC35646菌株基因組yvoA基因的方法，構(gòu)建了一個高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株CJ212。經(jīng)過幾丁質(zhì)酶活測定，確定改良菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的能力大大提高。
文檔編號C12N15/75GK102899347SQ20121044695
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月9日
發(fā)明者蔡峻, 陳建, 李麗娜, 石天威, 陳月華 申請人:南開大學