專利名稱：一種編碼缺刻緣綠藻二酰甘油酰基轉移酶的dna序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體地說，涉及一種編碼缺刻緣綠藻二酰甘油酰基轉移酶(MiDGAT2)的DNA序列及其應用。
背景技術：
能源是人類社會發展的基礎，目前全球正面臨著能源危機，石油資源供應緊張。由于生物能源的可再生性，生物能源的開發越來越受到關注，而微藻生物柴油以其不與人爭糧、不與糧爭地、不與畜爭料的獨特優勢吸引了越來越多科研工作者的關注。不同種類的微藻合成三酰甘油(triacylglycerol, TAG)的能力各不相同。研究發現，綠藻、硅藻等真核微藻的油脂含量比較高，有希望成為生物柴油的生產藻種。缺刻緣綠藻incisa Reisigl H4301)是一種淡水單細胞微藻，隸屬綠藻門 (Chlorophyta),該藻能大量積累TAG，尤其是在缺氮條件下，是潛在的微藻生物柴油藻種。TAG是植物中最主要的貯存脂質，對植物的生長發育也起著重要作用。目前已經發現TAG的合成酶有二酰甘油?；D移酶(DGAT ；EC 2. 3. I. 20)、磷脂二酰甘油?；D移酶(PDAT ；EC 2. 3. I. 158)和二酰甘油轉?；?DGAT)。其中，DGAT是TAG合成的最主要酶，它沿著Kennedy途徑催化TAG合成的最后一步，也是該合成途徑中唯一的限速酶。到目前為止，發現DGAT有三個家族，分別為DGATl、DGAT2和DGAT3。2011年的《中國藻類學會第八次會員代表大會暨第十六次學術討論會論文摘要集》中的會議論文“缺刻緣綠藻甘油-3-磷酸酰基轉移酶基因克隆及原核表達”，作者基于 Ostreococcus tauri (GenBank 登錄號116061306)及萊茵衣藻(GenBank 登錄號159473711)的G3PAT氨基酸保守序列，根據缺刻緣綠藻密碼子的偏好性設ii 對簡并引物，以缺刻緣綠藻cDNA為模板進行PCR擴增，獲得一 321bp擴增產物，經序列分析，它與萊茵衣藻的G3PAT氨基酸序列有75%的同源性。利用SMART RACE技術擴增得到其5’ -端和3’ -端cDNA序列后，與所得片段序列拼接獲得長度為3284bp的缺刻緣綠藻甘油_3_磷酸?；D移酶(MiG3PAT)基因cDNA全長序列。但是目前關于缺刻緣綠藻二酰甘油酰基轉移酶基因全長還未見有人克隆。中國期刊《上海海洋大學學報》，2012年9月，第21卷第5期，刊出的論文“缺刻緣綠藻轉錄組測序及脂質代謝相關基因注釋”，該論文作者為了能深入地了解缺刻緣綠藻花生四烯酸和脂質的代謝過程，利用Roche 454 GS FLX測序儀對該藻轉錄組進行高通量的焦磷酸測序，得到高質量讀序(read) 382468條，占原始讀序的97. 14%，平均每條讀序長322bp，總大小達123Mb，再經CAP3軟件拼接得到22714條重疊群、25621條singleton。將這些序列與公共數據庫進行同源性搜索、比較、基因功能注釋和分類，并基于轉錄組中所注釋的基因構建了缺刻緣綠藻脂質代謝途徑。但是該論文并未披露缺刻緣綠藻二酰甘油?；D移酶的cDNA序列，而且本領域技術人員均知，高通量測序方法存在誤差，測出的cDNA序列并非100%準確，存在誤差的可能性極大。因此，如果需要獲得缺刻緣綠藻二酰甘油?；D移酶的準確的cDNA序列，則需要對其進行驗證，而引物序列的設計為關鍵步驟，決定能否成功克隆得到目的序列。獲得正確的缺刻緣綠藻二酰甘油?；D移酶的cDNA序列后，方可進一步獲得其DNA全長序列。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種分離的DNA序列。本發明的再一的目的是，提供一種上述分離的DNA序列的用途。本發明的另一的目的是，提供一種重組表達載體。本發明的第四個目的是，提供一種上述重組表達載體的用途。本發明的第五個目的是，提供一種基因工程化的宿主細胞。 本發明的第六個目的是，提供一種上述基因工程化的宿主細胞的用途。為實現上述目的，本發明采取的技術方案是
一種分離的DNA序列，所述的DNA序列包括
a)SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序列；或
b)與a)所述的核苷酸序列互補的核苷酸序列。為實現上述第二個目的，本發明采取的技術方案是
如上所述的DNA序列在編碼二酰甘油酰基轉移酶或生產三酰甘油中的用途。為實現上述第三個目的，本發明采取的技術方案是
一種重組表達載體，所述的載體是由如上所述的核苷酸序列與質?；虿《舅鶚嫿ǖ闹亟M表達載體。優選的,所述的質粒是pYES2質粒。為實現上述第四個目的，本發明采取的技術方案是
如上所述的重組表達載體在編碼二酰甘油?；D移酶或生產三酰甘油中的用途。為實現上述第五個目的，本發明采取的技術方案是
一種基因工程化的宿主細胞，所述的宿主細胞選自于下列中的一種
a)用如上所述的核苷酸序列轉化或轉導的宿主細胞及其后代細胞；
b)用如上所述的重組表達載體轉化或轉導的宿主細胞及其后代細胞。所述的宿主細胞可以是細菌細胞、真菌細胞、植物細胞或動物細胞，或這些宿主細胞的后代。優選的，所述的宿主細胞是酵母細胞。為實現上述第六個目的，本發明采取的技術方案是
如上所述的宿主細胞在編碼二酰甘油?；D移酶或生產三酰甘油中的用途。本發明優點在于
1、本發明基于缺刻緣綠藻轉錄組測序數據，篩選獲得正確的缺刻緣綠藻二酰甘油?；D移酶(MiDGAT2)基因的cDNA全長序列，通過同源比對分析確定該酶為DAGT2基因家族，并進一步獲得了的DNA全長序列；
2、本發明通過將該紛7 47^在酵母的TAG合成缺陷株H1246中表達，證實該基因編碼蛋白確實具有TAG的合成能力；
>、MiDGAT2 cDNA全長序列和DNA全長序列的獲得為利用該基因通過遺傳操作實現TAG的大規模合成創造了條件。
附圖I是pMD19T載體圖譜。附圖2是pYES2載體圖譜。附圖3是缺刻緣綠藻基因結構示意圖。圖中灰色線是非轉錄區，黑色線為內含子，黑色框為外顯子。附圖4是酵母油脂的TLC圖譜。從左側泳道至右側泳道依次為野生型酵母scy62、缺陷株Hl246、攜帶pYES2的缺陷株、轉#// U的缺陷株和TAG標準品。附圖5是酵母細胞的BODIPY染色圖片。從左至右依次為野生型酵母scy62、缺陷 株H1246、攜帶pYES2的缺陷株和轉的缺陷株。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式
作詳細說明。本發明的技術路線是
1)在溫度為25°C、光照強度為115μ mo I photons m_2 *s_1的條件下,于BG-11培養基中培養缺刻緣綠藻。收集藻細胞，并提取基因組DNA和RNA ；
2)自缺刻緣綠藻轉錄組測序數據中篩選得到缺刻緣綠藻二酰甘油?；D移酶(MiDGAT2)基因的cDNA全長序列，并用缺刻緣綠藻RNA反轉錄的cDNA為模板對#切似7^的cDNA全長序列進行驗證；
3)根據全長的cDNA序列設計引物，利用缺刻緣綠藻DNA作為模板進行PCR，得到Mf偏的DNA全長序列；
4)根據#切似7^的cDNA全長序列設計引物，利用PCR構建pMD19T/MiDGAT2質粒；
5)對pYES2載體和pMD19T/MiDGAT2質粒進行雙酶 VMHind
ΠΙ /EcoRl),回收目的片段，再用T4連接酶連接得到重組載體pY_MiDAGT2 ；
6)將重組載體pY-MiDAGT2用電穿孔儀電擊法轉化酵母缺陷株H1246，應用尿嘧啶缺陷的合成培養基(SC-U培養基)篩選轉化株，篩選得到轉基因酵母Y_MiDGAT2 ；
7)將轉基因、轉空載體和未轉基因的酵母H1246以及野生型酵母scy62接種于SC培養基，72h后收集酵母，冷凍干燥；
8)利用薄層色譜(TLC)檢測酵母總脂成分，觀察轉基因酵母Y_MiDGAT2是否含有三酰甘油。同時還利用油體特異熒光染料BODIPY對轉基因、缺陷型及野生型酵母進行細胞染色，確認轉基因酵母Y_MiDGAT2是否重建了油體，進一步證實編碼蛋白是否具有TAG的合成功能。實施例I
I、實驗材料
I)缺刻緣綠藻incisa Reisigl H4301)購自捷克布拉格查理斯大學藻類培養中心(CAUP)。在溫度為25°C、光照強度為115 μ mo I photons !!^”^光/暗比為12h/12h的條件下培養，培養基為BG-11，購自上海滬宇生物科技有限公司。
2)pMD19T載體(載體圖譜見圖I)、pYES2載體(載體圖譜見圖2)購自Invitrogen公司。酵母缺陷株H1246和野生型scy62購自瑞典農業科技大學Dr. Stymne實驗室。酵母在SC培養基，30°C，以200 rpm轉速振蕩培養。SC培養基購自上海酶聯生物科技有限公司。大腸桿菌DH5ci感受態細胞購自上海生工生物股份有限公司?；罱湍赣糜腕w特異熒光染料 BODIPY 購自 GENMED SCIENTIFICS INC. U. S. A。TAG 標準品購自英國 Nu-Chek 公司。2、實驗方法
I)取100 mg新鮮的缺刻緣綠藻細胞置于預冷的研缽中，加入液氮充分研磨。2) CTAB法提取基因組DNA和TRIzol法抽提總RNA，_20°C保存備用。3)期刊《上海海洋大學學報》，2012年9月，第21卷第5期，刊出的論文“缺刻緣綠藻轉錄組測序及脂質代謝相關基因注釋”，該論文作者為了能深入地了解缺刻緣綠藻花生四烯酸和脂質的代謝過程，利用Roche 454 GS FLX測序儀對該藻轉錄組進行高通量的焦磷酸測序，得到高質量讀序(read) 382468條，占原始讀序的97. 14%，平均每條讀序長322bp， 總大小達123Mb，再經CAP3軟件拼接得到22714條重疊群、25621條singleton。將這些序列與公共數據庫進行同源性搜索、比較、基因功能注釋和分類，并基于轉錄組中所注釋的基因構建了缺刻緣綠藻脂質代謝途徑。我們根據該文獻的方法篩選得到的cDNA全長序列(SEQ ID NO. 3)，并根據該#切似7^的cDNA全長序列設計以下引物
上游引物 F (SEQ ID NO. 4) CGAGCTTGTTGACAGCCACGGCAG ；
下游引物 R (SEQ ID NO. 5) CATCCCCAACCAAGGCAGCTCACGA,
然后以缺刻緣綠藻RNA反轉錄的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應程序為94°C預變性3 min，35個循環，每個循環包含94°C變性30 s、68°C退火30 S、72°C延伸2 min，最后72°C延伸7 min。PCR產物膠回收后連接到pMD19T載體，轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，藍白斑篩選，挑取陽性克隆，菌落PCR驗證，菌液送到上海生工生物工程有限公司測序，以證實和獲得準確的缺刻緣綠藻的cDNA全長序列。4)根據步驟3)最終得到的準確的#切似7^的cDNA全長序列(SEQ ID NO. I)設計引物，上下游引物序列分別如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示，以缺刻緣綠藻DNA為模板進行PCR擴增。擴增條件為94°C預變性5 min，35個循環，每個循環包含94°C變性30 S、69°C退火30 s、72°C延伸2 min，最后72°C延伸10 min。PCR產物按上述方法經膠回收、TA克隆連接到PMD19T載體，送上海生工生物工程公司測序，以獲得缺刻緣綠藻的DNA全長序列。5)根據MiDGAT2的cDNA全長序列(SEQ ID NO. I)設計引物
上游引物 F (SEQ ID NO. 6 ) aagcttAACATGCTACGCTGGTCGAGGGTCG,其中小寫字母為
Ζ/ /ΠΙ酶切位點，酶切位點后的AAC為酵母一致性序列；
下游引物 R (SEQ ID NO. 7) gaattcCTACTCGACCATGCGCAGCTCCTGC,其中小寫字母為&0RI酶切位點。上述引物含有歷iiZIII和&oRI的酶切位點，利用PCR方法構建pMD19T/MiDGAT2質粒。25μ 的PCR擴增反應體系包含2. 5μ 的Ex Taq緩沖液、2μ 的(1ΝΤΡ、2μ 的Mg2+、2PL的cDNA模板、引物各1PL、0. 25μ 的Ex Taq酶及14. 5μ 無菌水。擴增條件為94°C預變性5 min，35個循環，每個循環包含94°C變性30 s、69°C退火30 s、72°C延伸2 min，最后72°C延伸10 min。PCR產物經膠回收、TA克隆連接到pMD19T載體，送上海生工生物工程公司測序保證序列的準確性。6)從大腸桿菌DH5a中抽提pMD19T/MiDGAT2質粒，用限制性內切酶歷/ /ΠΙ和&oRl進行雙酶切消化反應，同時對pYES2質粒也進行歷/^ΠΙ /&oRl雙酶切反應。反應體
系為 4PL 的 IOXH 緩沖液，4PL 的 O. 1% BSA, DNA 2Pg，歷/ /ΠΙ及&oRl各 μ ，加無 RNase
水至20μ 。37°C消化反應4 h。割膠回收酶切后的目的片段，并用T4 DNA連接酶將酶切后飽MiDGAT2片段與pYES2片段連接得到重組載體pY_MiDGAT2。連接反應體系為2. 5μ 的緩沖液，DNA 六敵 iMiDGAT2、約 O. 3 pmol，載體 DNA (pYES2 片段)約 O. 03 pmol, Ιμ 的 Τ4DNA連接酶，加無RNase水至25PL。16°C連接過夜。連接后轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，按照前述方法進行克隆、菌落PCR驗證和測序。從大腸桿菌DH5a中抽提pY_MiDGAT2質粒，_20°C保存備用?！?br>
7)酵母感受態細胞制備。將酵母接種于SC培養基中，30°C復蘇培養過夜，然后按1:100放大培養，以200 rpm轉速振蕩培養至細胞密度約為IXlO8 cells/mL (約4 5 h)。冰上冷卻15 min使細胞停止生長，4°C條件下以5 000 rpm轉速離心5 min收集酵母細胞，預冷無菌水洗滌細胞2次，同樣條件下離心收集。20 mL預冷的I M山梨醇洗滌細胞I次，然后溶于O. 5 mL預冷的I M山梨醇，調整細胞的濃度在IXIOki cells/mL。冰上保存細胞，便于電擊使用。8)利用電穿孔儀(Bio-Rad)電擊，將重組的載體pY_MiDGAT2轉化酵母H1246感受態細胞。取在冰上預冷的待轉化的DNA (pY-MiDGAT2)約5 IOPL (5 200 ng)與感受態細胞混勻，并與O. 2 cm的電擊杯一起冰上預冷，然后將DNA-細胞混合液轉移到預冷的電擊杯輕輕混勻，冰浴5 min后，選擇程序Sc2電擊一次，移走電擊杯，立刻加入I mL預冷的I M山梨醇，輕輕轉移到新的YH)培養基中，30°C輕微振蕩5 h，將菌液涂布于含有I M山梨醇的尿嘧啶缺陷合成培養基(SC-U)上，30°C倒置靜置培養48 72 h，挑取菌落于液體SC-U培養基中培養。菌落PCR驗證后，用含2%葡萄糖或2%棉籽糖的SC-U培養基保存菌種。另外，按上述同樣方法將空載體PYES2電轉到H1246上。9)將保存的菌液接種至SC培養基中，30°C下以200 rpm轉速振蕩培養72 h，收集酵母，凍干。10)提取凍干后酵母的總脂。提取方法準確稱量50 mg酵母粉置于試管中，加入I mL氯仿甲醇(I: 2)，再加入200-300 yL玻璃珠，渦旋震蕩15 min，鏡檢觀察細胞壁是否破碎完全。4000 rpm離心15 min后,將上清液吸出至新試管中，加入400 μ L 50 mM朽1檬酸及600 μ L氯仿,充分混勻后,4000 rpm離心15 min,小心吸取下層溶液,放入酯化瓶
中用氮氣吹干。11)薄層色譜(TLC)驗證轉基因酵母的三酰甘油。所用展開劑為己烷乙醚冰醋酸(80/20/1，v/v/v)。顯色劑10% (w/v)CuS04 ·5Η20 加到 8% (ν/ν)磷酸溶液。在提取的酵母總脂中加入20 μ L氯仿，用毛細管點樣到硅膠60 F254板(Merck)上，將板放入層析缸中展開，取出，噴顯色劑，140°C烘焙10 min。12)將活酵母用油體特異熒光染料BODIPY染色，用激光共聚焦顯微鏡(Leica)觀察，拍照。3、實驗結果
I)從缺刻緣綠藻轉錄組測序數據中篩選到并經過PCR擴增產物的序列分析，得到準確的#切似7^的cDNA全長序列(SEQ ID NO. I);其5’ -非轉錄區長44 bp，3’-非轉錄區長873 bp,開讀框架長1056 bp,第45_47bp是起始密碼子，第1098_1100bp是終止密碼子。利用缺刻緣綠藻基因組DNA為模板進行PCR擴增反應，產物經序列分析后得到紛7 47^的DNA全長序列(SEQ ID NO. 2);其總長4251 bp，存在6個內含子，它們的長分別為213 bp(236-448bp)、763 bp (524_1286bp)、296 bp (1372_1667bp)、392 bp (1877_2268bp)、381
bp (2485-2865bp)和233 bp (3091_3323bp)，將該基因的編碼序列分成7段(見圖3);第45-47bp是起始密碼子，第3376-3378bp是終止密碼子。2)轉基因酵母Y_MiDGAT2經半乳糖誘導培養后，其脂肪的TLC檢測結果顯示，MiDGAT2表達產物能夠使TAG合成缺陷株酵母H1246中重新合成TAG (見圖4)。3)利用油體特異熒光染料BODIPY對酵母進行細胞染色，與TAG合成缺陷株酵母H1246相比較，發現轉基因酵母Y_MiDGAT2重建了油體(見圖5)，從而證明了編碼蛋白具有TAG的合成功能。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種分離的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列包括 a)SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序列；或 b)與a)所述的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
2.權利要求I所述的DNA序列在編碼二酰甘油酰基轉移酶或生產三酰甘油中的用途。
3.—種重組表達載體，其特征在于，所述的載體是由權利要求I所述的核苷酸序列與質?；虿《舅鶚嫿ǖ闹亟M表達載體。
4.根據權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于，所述的質粒是PYES2質粒。
5.權利要求3或4所述的重組表達載體在編碼二酰甘油?；D移酶或生產三酰甘油中的用途。
6.一種基因工程化的宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞選自于下列中的一種 a)用權利要求I所述的核苷酸序列轉化或轉導的宿主細胞及其后代細胞； b)用權利要求3或4所述的重組表達載體轉化或轉導的宿主細胞及其后代細胞。
7.根據權利要求6所述的宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞是細菌細胞、真菌細胞、植物細胞或動物細胞，或這些宿主細胞的后代。
8.根據權利要求6所述的宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞是酵母細胞。
9.權利要求6所述的宿主細胞在編碼二酰甘油?；D移酶或生產三酰甘油中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種分離的DNA序列，所述的DNA序列包括a)SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所述的核苷酸序列；或b)與a)所述的核苷酸序列互補的核苷酸序列。本發明還提供了含有上述核苷酸序列的重組表達載體和基因工程化的宿主細胞，以及上述核苷酸序列、重組表達載體、宿主細胞在編碼二酰甘油酰基轉移酶或生產三酰甘油中的用途。本發明優點在于篩選獲得了缺刻緣綠藻二酰甘油?；D移酶基因的cDNA全長序列和DNA全長序列，通過將該基因在酵母的TAG合成缺陷株H1246中表達，證實其編碼蛋白確實具有三酰甘油的合成能力，為利用該基因通過遺傳操作實現三酰甘油的大規模合成創造了條件。
文檔編號C12N1/21GK102943081SQ20121047750
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月22日 優先權日2012年11月22日
發明者周志剛, 房逢立 申請人:上海海洋大學