專利名稱：增強cik細胞增殖能力及提高殺死腫瘤細胞的方法
技術領域：
本發明涉及細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK細胞)的培養方法。
背景技術：
腫瘤是危害人類生命和健康的一大疾病，目前已列人群疾病死亡病因的第二位。 據世界衛生組織統計，全世界每年有900萬新發癌癥，500萬人死亡。目前腫瘤的治療方法主要是手術、放療和化療。其中，外科手術治療只適用于早期腫瘤，而放化療毒副作用較大。 因此，開發安全有效的新一代抗腫瘤生物療法將有著極其重要的社會效益和經濟效益。
美國Stanford大學首先報道了一類由多種細胞因子誘導的殺傷細胞，即細胞因子誘導的殺傷細胞(cy to kine-induced killer cells, CIK),是目前所知殺傷活性最強的一種免疫效應細胞。CIK免疫細胞在骨髓凈化和腫瘤過繼免疫治療中的作用已在動物實驗中得到證實，CIK免疫細胞的臨床實驗也已開始進行。(Ortaldo J R, Winkler-Pickett R T，Yagita H，et al. Comparat ive studies of CD3+and CD3+CD56+cells:Exam_ination of morphology,functions, T cellreceptor rearrangement, and por e-forming protein expression. Cell Immunol, 1991, 136:486-495. ) ；(S chmidt-WolfI G，Negrin R Sj Kiem H P，et al. Us e ofa SCIDm ou se/human I ymphoma model t o evalu at e cyt okine-in duced killer cells with pot ent ant itumor cell act ivit y[J]. J E xp Medj 1991，174(1) :139-149.)
然而就目前培養CIK免疫細胞的方法所得到的CIK細胞的數量和活性較低，因此對腫瘤細胞的殺傷率低，治療效果較差。發明內容
為此，本發明所要解決的技術問題是提供一種增強CIK細胞增殖能力及細胞毒作用的方法。
于是，本發明提供了增強CIK細胞增殖能力及細胞毒作用的方法，包括無菌采集并分離健康人外周血單個核細胞，將得到的單個核細胞用Q007培養基重懸細胞，加入 24-26ug/ml的PHA-L型植物血凝素，并在培養基中至少培養15天。
優選地，PHA-L型植物血凝素的用量為25ug/ml。
優選地，用Q007培養基重懸細胞后調整細胞密度在(2-3) *106個/ml。
具體地，所述培養基為含有重組人IFN- Y、重組人IL-I以及重組人IL_2的培養基，其培養方法為，在第O天加入250IU/ml的重組人IFN-Y，在第I天加入25ug/ml的 PHA-L型植物血凝素和2. 5ng/ml的重組人IL-1，在第2天加入1000IU/ml的重組人IL-2 進行培養。
優選地，在培養過程中每隔2-3天加入一次1000IU/ml的新鮮重組人IL-2。
優選地，將得到的單個核細胞經洗滌后用Q007培養基重懸細胞。
本發明的有益效果是
I、通過在CIK細胞的培養過程中加入24-26ug/ml的PHA-L型植物血凝素，PHA-L 植物血凝素相對于其他類型的植物血凝素具有更高的促有絲分裂作用，刺激T細胞增殖分化產生大量效應T細胞和細胞毒T細胞；效應T細胞分泌產生大量細胞因子(如干擾素等) 殺傷腫瘤細胞；細胞毒T細胞可直接殺傷腫瘤細胞；PHA-L植物血凝素同時可刺激B細胞轉化為漿母細胞然后增殖分化為漿細胞，漿細胞產生大量的非特異性抗體來中和腫瘤抗原， 從而極大地提高了 CIK細胞的增殖能力和細胞毒作用，經實驗驗證，本發明培養的CIK細胞增殖率達到140-150%ο
2、前期采用Q007培養基重懸細胞，其有益效果是更有利用CIK免疫細胞的分化及增加細胞毒作用


圖I為實施例I中CIK細胞增生率的對比圖2為實施例I中CIK細胞對體外培養癌癥細胞(hela，h印g2，ovar3，K562)的殺傷率對比圖；具體實施方式
下面，結合具體實施例對本發明進行詳細描述。
首先，本發明在具體實施過程需要用到的試劑和耗材如下
表I主要試劑
權利要求
1.增強CIK細胞增殖能力及細胞毒作用的方法，包括無菌采集并分離健康人外周血單個核細胞，其特征在于將得到的單個核細胞用Q007培養基重懸細胞，加入24-26ug/ml的PHA-L型植物血凝素，并在培養基中至少培養15天。
2.根據權利要求I所述的增強CIK細胞增殖能力及細胞毒作用的方法，其特征在于，PHA-L型植物血凝素的用量為25ug/ml。
3.根據權利要求I所述的增強CIK細胞增殖能力及細胞毒作用的方法，其特征在于，用Q007培養基重懸細胞后調整細胞密度在(2-3) *106個/ml。
4.根據權利要求2所述的增強CIK細胞增殖能力及細胞毒作用的方法，其特征在于，所述培養基為含有重組人IFN-Y、重組人IL-I以及重組人IL-2的培養基，其培養方法為，在第O天加入250IU/ml的重組人IFN- Y，在第I天加入25ug/ml的PHA-L型植物血凝素和2. 5ng/ml的重組人IL-I，在第2天加入1000IU/ml的重組人IL-2進行培養。
5.根據權利要求4所述的增強CIK細胞增殖能力及細胞毒作用的方法，其特征在于，在培養過程中每隔2-3天加入一次1000IU/ml的新鮮重組人IL-2。
6.根據權利要求I所述的增強CIK細胞增殖能力及細胞毒作用的方法，其特征在于，將得到的單個核細胞經洗滌后用Q007培養基重懸細胞。
全文摘要
本發明提供了增強CIK細胞增殖能力及殺死腫瘤細胞的方法，包括無菌采集并分離健康人外周血單個核細胞，將得到的單個核細胞用Q007培養基重懸細胞，加入24-26ug/ml的PHA-L型植物血凝素，并在培養基中至少培養15天。其有益效果是通過在CIK細胞的培養過程中加入24-26ug/ml的PHA-L型植物血凝素，增強CIK細胞增殖能力及細胞毒作用，進而提高對腫瘤細胞的殺傷率和治療效果。
文檔編號C12N5/0783GK102978159SQ20121047704
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月22日 優先權日2012年11月22日
發明者李曉祥, 沈政, 黃謀珍 申請人:深圳市中美康士生物科技有限公司