水稻新生組織特異啟動(dòng)子p-EMA1及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種水稻新生組織特異啟動(dòng)子p-EMA1及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的啟動(dòng)子，來(lái)源于普通野生稻（O.rufipogon?Griff.），為如下1）或2）或3）或4）：1）序列1自5’末端第1至1841位核苷酸所示的DNA分子；2）序列1所示的DNA分子；3）與1）或2）限定的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；4）與1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。本發(fā)明對(duì)于水稻早熟分子機(jī)制的研究，水稻早熟品種的選育具有重要的理論及實(shí)際意義。本發(fā)明對(duì)于水稻新生組織特異表達(dá)的分子機(jī)制的研究，以及水稻新生組織特異表達(dá)特征分子育種具有重要的理論及實(shí)際意義。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用和市場(chǎng)前景。
【專利說(shuō)明】水稻新生組織特異啟動(dòng)子P-EMA1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種水稻新生組織特異啟動(dòng)子P-EMAl及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物新生組織(器官)均由原基分化發(fā)育而成，并且植物具有持續(xù)發(fā)育新生組織(器官)的能力，因此新生組織的生長(zhǎng)發(fā)育狀況對(duì)于整個(gè)植株的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。
[0003]水稻是世界上最重要的糧食作物之一，其種子可供人類食用。水稻籽粒產(chǎn)量的決定因素主要包括有效穗、結(jié)實(shí)率、每穗粒數(shù)和粒重，而有效穗數(shù)和每穗粒數(shù)均于新生組織的生長(zhǎng)狀態(tài)緊密相關(guān)。因此，設(shè)計(jì)水稻新生組織特異表達(dá)的啟動(dòng)子對(duì)于水稻產(chǎn)量分子育種至關(guān)重要。
[0004]普通野生稻是亞洲栽培稻的祖先種，野生稻在演化成栽培稻的過(guò)程中，經(jīng)過(guò)自然選擇和人工選擇，基因多樣性降低，等位基因數(shù)減少。據(jù)統(tǒng)計(jì)，栽培稻的等位基因數(shù)約為野生稻的60%,從而導(dǎo)致當(dāng)前水稻品種選育所面臨的遺傳瓶頸(geneticbottleneck)問(wèn)題。因此從水稻的近緣野生種(普通野生稻Oryza rufipogon Griff.)基因組中發(fā)掘和利用在栽培稻中已丟失或削弱的優(yōu)異基因，并把它們應(yīng)用于水稻育種生產(chǎn)中具有十分重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值，也是解決當(dāng)前水稻育種難題的一條行之有效的途徑。
[0005]我國(guó)野生稻資源豐富，從野生稻中發(fā)掘、定位、克隆水稻新生組織特異啟動(dòng)子，將對(duì)水稻生產(chǎn)具有重要意義。[0006]云南元江普通野生稻是中國(guó)生長(zhǎng)位置海拔最高(780m)的普通野生稻，其生長(zhǎng)環(huán)境與栽培稻的隔離條件好，沒(méi)有栽培稻基因的滲入。Sun等(2002)對(duì)元江普通野生稻核基因組及線粒體、葉綠體基因組的遺傳分化的研究表明，元江普通野生稻是一個(gè)非常特殊的普通野生稻群體，是研究亞洲野生稻起源演化和拓寬水稻遺傳基礎(chǔ)的重要材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種水稻新生組織特異啟動(dòng)子P-EMAl及其應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明提供了一種具有啟動(dòng)子功能的DNA片段，命名為P-EMAl (或ρ_ΕΜΑ1)，來(lái)源于普通野生稻(0.rufipogon Griff.),為如下I)或2)或3)或4):
[0009]I)序列表中序列I自5’末端第I至1841位核苷酸所示的DNA分子；
[0010]2)序列表中序列I所示的DNA分子；
[0011]3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；
[0012]4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。
[0013]上述嚴(yán)格條件可為在0.1XSSPE(或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0014]含有所述DNA片段的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。[0015]所述重組載體可為在植物表達(dá)載體pCambial381的多克隆位點(diǎn)插入所述DNA片段得到重組質(zhì)粒。所述重組載體具體可為將所述DNA片段插入植物表達(dá)載體pCambial381的BamHI和HindIII酶切識(shí)別位點(diǎn)間得到的重組質(zhì)粒。
[0016]擴(kuò)增所述DNA片段的全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0017]本發(fā)明還保護(hù)所述DNA片段在啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。所述啟動(dòng)目的基因表達(dá)可為啟動(dòng)目的基因的特異性表達(dá)。所述特異性表達(dá)具體可為組織特異表達(dá)。所述組織特異表達(dá)可為新生組織特異表達(dá)。所述新生組織為幼芽(特別是幼芽基部)、根的生長(zhǎng)點(diǎn)，新生葉或新生穗。
[0018]本發(fā)明還保護(hù)所述DNA片段在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體可為水稻，如水稻品種“日本晴”。
[0019]本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是在出發(fā)植物中用所述DNA片段啟動(dòng)目的基因的表達(dá)，得到表達(dá)所述目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。所述出發(fā)植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體可為水稻，如水稻品種“日本晴”。所述目的基因具體可為GUS基因。所述方法具體可為將所述重組載體導(dǎo)入所述出發(fā)植物，從而在所述出發(fā)植物中用所述DNA片段啟動(dòng)⑶S基因的表達(dá)。
[0020]本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)水稻新生組織特異啟動(dòng)子P-EMAl及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的DNA片段具有啟動(dòng)子的功能，具有特異表達(dá)的特性。本發(fā)明對(duì)于水稻早熟分子機(jī)制的研究，水稻早熟品種的選育具有重要的理論及實(shí)際意義。本發(fā)明對(duì)于水稻新生組織特異表達(dá)的分子機(jī)制的研究，以及水稻新生組織特異表達(dá)特征分子育種具有重要的理論及實(shí)際意義。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用和市場(chǎng)前景。 【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1為目的片段在滲入系YIL23和特青不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)譜分析。
[0022]圖2A為融合⑶S基因載體不意圖。
[0023]圖2B為P-EMAl的PCR擴(kuò)增策略。
[0024]圖3為轉(zhuǎn)基因植株⑶S組織染色結(jié)果；a為5d幼苗；b為15天苗的幼葉；c_i為穗發(fā)育不同時(shí)期的染色結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。所用引物合成及測(cè)序工作均由北京奧科生物科技有限責(zé)任公司完成。
[0026]水稻品種“日本晴”:中國(guó)作物種質(zhì)資源信息網(wǎng)(http://icgr.caas.net.cn/),庫(kù)編號(hào)為I1A13071。
[0027]水稻品種“特青”:中國(guó)作物種質(zhì)資源信息網(wǎng)(http://icRr.caas.net, cn/),庫(kù)編號(hào)為 I1A40810。
[0028]植物表達(dá)載體pCambial381 即 NCBI 中的 Binary vector pCAMBIA-1381,為環(huán)形質(zhì)粒，其核苷酸序列見(jiàn)NCBI中的如下序列:GenBank:AF234302.1 ;VERSION:AF234302.1 ；G1:7638091 ο植物表達(dá)載體pCambial381的核苷酸序列中，第9810至10590位核苷酸為CaMV35S啟動(dòng)子(組成型啟動(dòng)子)，用來(lái)啟動(dòng)潮霉素基因；第2-1855位核苷酸為GUS基因(質(zhì)粒中沒(méi)有用于啟動(dòng)GUS基因的啟動(dòng)子)；第7214-8008位核苷酸為aadA基因(卡那霉素抗性基因)；第8749-9774位核苷酸為hptll基因(潮霉素抗性基因)。
[0029]實(shí)施例1、水稻新生組織特異啟動(dòng)子P-EMAl的發(fā)現(xiàn)
[0030]一、EMAl基因的發(fā)現(xiàn)
[0031]從以云南元江普通野生稻(Orzya rufipogon Griff.)為供體親本和秈稻品種特青(Oryza sativa ssp.1ndica)為受體親本構(gòu)建的滲入系群體中分離了一個(gè)早熟滲入系HL23，比特青提前約28天抽穗，通過(guò)圖位克隆的策略克隆了該早熟基因EMA1。分析雙親EMAl基因的表達(dá)顯示，苗期EMAl基因在葉中的表達(dá)量逐漸升高，到頂點(diǎn)后迅速降低，但EMAl基因在滲入系HL23中表達(dá)量升高的速度比在特青中要快(見(jiàn)圖1，TQ代表特青，YIL23代表早熟滲入系YIL23)。即在苗期，滲入系YIL23中EMAl的表達(dá)比特青中EMAl的表達(dá)更強(qiáng)，且隨著幼苗長(zhǎng)大，雙親中EMAl的表達(dá)量逐漸升高。
[0032]二、水稻新生組織特異啟動(dòng)子P-EMAI的發(fā)現(xiàn)
[0033]由于候選基因EMAl的第I內(nèi)含子長(zhǎng)約30kb，因此無(wú)法直接從基因組序列擴(kuò)增目的基因。我們采取如下策略進(jìn)行擴(kuò)增(見(jiàn)圖2B):(1)用P1/P2引物從YIL23的基因組DNA擴(kuò)增片段1，該片段包含EMAl的啟動(dòng)子區(qū)域(約ATG上游2kb)、5’UTR和第I外顯子的部分序列。其中，P2引物位于第I外顯子；(2)以P3/P4引物從HL23的第I鏈cDNA擴(kuò)增片段2，該片段包含EMAl ORF的大部分序列和3’UTR的部分序列。其中，P3引物與P2引物反向互補(bǔ)；(3)將擴(kuò)增的片段I和片段2混合，加入除引物外的PCR反應(yīng)組分進(jìn)行如下程序:預(yù)變性95° C 5分鐘；變性95° C I分鐘，退火55° C I分鐘，延伸72° C I分鐘，循環(huán)5次；過(guò)度延伸7分鐘；然后加入`引物P1/P4進(jìn)行正常的PCR擴(kuò)增獲得片段3，該片段包含EMAl的啟動(dòng)子區(qū)域、5’ UTR和ORF序列。其中，Pl和P4引物的5’端分別含有內(nèi)切酶BamHI和HindIII的識(shí)別位點(diǎn)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物具有序列表的序列I所示的DNA片段。
[0034]將序列表的序列I所示的DNA片段命名為P-EMAl (新生組織特異啟動(dòng)子)(序列I中，第I至1841位核苷酸為預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子序列，余下的核苷酸為CDNA序列)。
[0035]實(shí)施例2、P-EMAl轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及其鑒定
[0036]一、植物表達(dá)載體的構(gòu)建
[0037]1、合成序列表的序列I所示的雙鏈DNA分子。
[0038]2、以步驟I合成的雙鏈DNA分子為模板，用Pl和P4組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0039]Pl:5，-ATGGATCC ATCACCGCAAATACTCTCCC-3，；
[0040]P4:5，-GCAAGCTT ACGCAGAGATCCAGCTTATTCC-3，。
[0041 ] Pl中，帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BamHI識(shí)別位點(diǎn)；
[0042]P4中，帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶HindIII的識(shí)別位點(diǎn)。
[0043]3、用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0044]3、用限制性內(nèi)切酶BamHI和Hindi 11雙酶切植物表達(dá)載體pCambial381，回收載體骨架(約 10650bp)。
[0045]4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pCambial381-pEMAlo根據(jù)測(cè)序結(jié)果,對(duì)重組質(zhì)粒pCambial381_pEMAl進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在植物表達(dá)載體pCambial381的BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列I所示的DNA片段。
[0046]二、pCambial381_pEMAl 轉(zhuǎn)基因水稻的獲得
[0047]1、將水稻品種“日本晴”的成熟胚愈傷組織作為基因槍轟擊的受體，用基因槍將重組質(zhì)粒pCambial381-pEMAl轟擊到愈傷組織,具體步驟如下:
[0048](I)將水稻品種“日本晴”的成熟胚愈傷組織在高滲透培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基+91.2g/L甘露醇)上進(jìn)行滲透處理4-6h (28°C，暗培養(yǎng))。
[0049](2)用重組質(zhì)粒 pCambial381_pEMAl 包裹直徑 110 μ m 金粉，采用 PDS-1000/He 基因槍(Bio-Red公司生產(chǎn))，選擇IlOOPsi的可裂膜，載樣距靶材料6cm進(jìn)行轟擊。
[0050](3)轟擊后的愈傷組織繼續(xù)在原培養(yǎng)基上培養(yǎng)16h (28°C，暗培養(yǎng))。[0051]2、將完成步驟I的愈傷組織轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基+2mg/L 2，4_D)上，恢復(fù)培養(yǎng)I周(28°C，暗培養(yǎng))。
[0052]3、將完成步驟2的愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基+50mg/L潮霉素)上，28°C暗培養(yǎng)30天。
[0053]4、將完成步驟3的愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基+50mg/L潮霉素)上，28°C暗培養(yǎng)30天。
[0054]5、將步驟4得到的愈傷組織轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基上(NB培養(yǎng)基+5mg/L脫落酸+50mg/L潮霉素+2mg/L萘乙酸+lmg/L 6-節(jié)氨基嘌呤),28?暗培養(yǎng)15天。
[0055]6、將步驟5得到的愈傷轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上(NB培養(yǎng)基+2mg/L 6_芐氨基嘌呤+lmg/L萘乙酸+lmg/L激動(dòng)素+50mg/L潮霉素),28°C光照培養(yǎng)15天。
[0056]7、將步驟6中幼苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上(1/2MS培養(yǎng)基+0.5mg/L萘乙酸+0.09g/L肌醇+30g/L蔗糖)，28°C光照培養(yǎng)30天。
[0057]8、將步驟7中苗高7-8cm且根系發(fā)達(dá)的植株移栽到花盆，放置于溫室中培養(yǎng)3周，成活的植株即為Ttl代植株。Ttl代植株自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株用T1代表示。
[0058]9、將Ttl代植株進(jìn)行PCR鑒定(靶序列為潮霉素抗性基因，引物對(duì)由IF和IR組成，靶序列約為lOOObp)，PCR鑒定為陽(yáng)性的植株即為轉(zhuǎn)基因植株。
[0059]IF:5，-tacttctaca cagccatc-3，；
[0060]IR，5， -cgtctgtcga gaagtttc-3，。
[0061]三、轉(zhuǎn)空載體植株的獲得
[0062]將植物表達(dá)載體pCambial381代替重組質(zhì)粒pCambial381_pEMAl進(jìn)行步驟二的操作，得到轉(zhuǎn)空載體植株。
[0063]四、轉(zhuǎn)基因水稻的組織表達(dá)特異性分析
[0064]取步驟二得到的轉(zhuǎn)基因植株或步驟三得到的轉(zhuǎn)空載體植株分別進(jìn)行如下鑒定:
[0065]觀察染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常培養(yǎng)T1代植株，在不同的發(fā)育階段取轉(zhuǎn)基因植株的幼苗整株、葉片和穗等進(jìn)行GUS染色分析。萌發(fā)5天的幼苗的GUS染色照片見(jiàn)圖3a，轉(zhuǎn)基因幼苗中呈現(xiàn)了明顯的⑶S染色，且多集中在幼芽基部和根的生長(zhǎng)點(diǎn)等部位。觀察第15天(生長(zhǎng)15天的幼苗)幼苗的GUS染色結(jié)果見(jiàn)圖3b，轉(zhuǎn)基因幼苗在葉上能觀察到比先前更為明顯的GUS染色，在新生葉上尤為顯著。孕穗期的照片見(jiàn)圖3c-1，在穗發(fā)育的不同時(shí)期，轉(zhuǎn)基因植株獲得的小穗(新生穗)均能觀察到明顯的GUS染色。
[0066]因此，無(wú)論是在苗期葉片還是在進(jìn)入孕穗期的穗，P-EMAl在新生組織和細(xì)胞旺盛分裂的部位(如生長(zhǎng)點(diǎn)、幼穗)表達(dá)量較高。
[0067]轉(zhuǎn)空載體植株在各個(gè)相應(yīng)時(shí)期的各個(gè)組織部位均不具有GUS表達(dá)活性。
[0068]實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行`三次，都得到同樣的結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1.一種DNA片段，為如下I)或2)或3)或4): 1)序列表中序列I自5’末端第I至1841位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列I所不的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子； 4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。
2.含有權(quán)利要求1所述DNA片段的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
3.如權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為在植物表達(dá)載體pCambial381的多克隆位點(diǎn)插入權(quán)利要求1所述DNA片段得到重組質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為將權(quán)利要求1所述DNA片段插入植物表達(dá)載體pCambial381的BamHI和HindIII酶切識(shí)別位點(diǎn)間得到的重組質(zhì)粒。
5.擴(kuò)增權(quán)利要求1所述DNA片段的全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)。
6.權(quán)利要求1所述DNA片段在啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述啟動(dòng)目的基因表達(dá)為啟動(dòng)目的基因特異性表達(dá)。
8.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是在出發(fā)植物中用權(quán)利要求1所述DNA片段啟動(dòng)目的基因的表達(dá)，得到表達(dá)所述目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103834655SQ201210482822
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月23日
【發(fā)明者】孫傳清, 謝道昕, 彭文, 譚祿賓, 葉盛, 張永生, 單曉昳, 劉鳳霞 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)