專利名稱：雞高遷移率族蛋白b1抗原多肽和抗雞高遷移率族蛋白b1單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及細胞工程技術領域，具體涉及利用ChHMGBl抗原多肽制備抗chHMGBl單克隆抗體及其應用。
背景技術：
高遷移率族蛋白(HMG)最早由Johns于20世紀70年代在小牛胸腺中發現，是種幾乎存在于所有真核細胞內的非組蛋白染色體結合蛋白，因其分子質量小(<30kD)，在聚丙烯酰胺凝膠電泳快速遷移而被命名為高遷移率族蛋白(HMG蛋白)。根據分子質量大小及DNA結合特性，HMG族蛋白分為HMGA，HMGB, HMGN家族；HMGB又分為HMGBl和HMGB2。HMGBl在進化過程中高度保守，在所有哺乳動物中有99%同源性。HMGBl分子包括3個功能區含與DNA結合的結構域A盒(Iaa 79aa)和B盒(89aa 163aa)，及I個高度重復并富含帶負電荷的天冬氨酸和谷氨酸的C-末端(186aa 215aa)。其中，B盒前20個氨基酸是其發揮細胞因子活性的關鍵位點。A盒蛋白(A-box)能取代全長HMGBl而與相應受體結合，但不發揮生物學效應，故純化的A-box可作為HMGBl特異性拮抗劑。HMGBl廣泛分布于淋巴、心、肝、肺、腦、脾、腎等組織，在肝和腦組織中HMGBl主要存在于胞漿，而大多數其他組織中存在于細胞核內。在這些細胞核中，HMGBl和HMGB2結合于DNA雙螺旋小溝內，引起DNA構象變化。這種結合無序列選擇性，可以幫助特異性DNA結合蛋白正確裝配到其在染色體內的結合位點。高遷移率族蛋白BI (high mobility group boxBl,HMGBl),是一種典型的危險因子，正常情況下表達于胞核和胞漿內的非組蛋白染色體結合蛋白，參與多種生物學過程包括基因轉錄、DNA修復、V (D) J重組(胚系基因片段重組)、分化和發展。其功能主要為①使雙螺旋極度扭曲以便各種轉錄因子和染色質相互作用；②調節類固醇激素受體、NF-K B、p53及RAGl重組酶的轉錄活性；③與組蛋白作用而影響染色質結構，使染色質解螺旋。HMGBl非特異性與DNA結合，可通過核孔而穿梭于胞核與胞漿之間。HMGBl僅在危險信號出現時釋放至胞外發揮作用。胞外HMGBl不僅可直接充當炎性細胞因子參與固有免疫效應，也可作為內源性DAMP激活APC，從而啟動、增強適應性免疫應答，并參與多種疾病過程發生和發展。HMGBl過表達有抑制細胞凋亡，誘導細胞分化、細胞遷移、細胞增殖等作用。因此，HMGBl可能作為干預多種免疫相關疾病的重要靶標。目前已發現的HMGBl的重要受體包括晚期糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)、Toll樣受體2 (toll like rec^ptor2，TLR2)、TLR4。新近研究表明它也不但是一種轉錄因子和促生長因子，而且是一種重要的炎性細胞因子，并與腫瘤的發生、浸潤、轉移等生物學行為關系密切，有很重要的臨床價值。本課題組前期的蛋白質組學結果也顯示chHMGBl在J亞群禽白血病(ALV-J)感染的細胞中蛋白表達水平有差異，故推測chHMGBl在ALV-J感染致病過程中發揮一定的作用。目前對于chHMGBl的研究還處于起始階段，各種檢測chHMGBl表達的方法還很欠缺。為了深入研究chHMGBl的生物學功能，必須有相應的抗體工具，因此篩選合適的chHMGBl抗原多肽以及制備抗chHMGBl的單克隆抗體對進行相應研究具有重要作用。

發明內容
本發明的目的在于針對現有技術中的不足，提供一種chHMGBl抗原多肽，它的氨基酸序列為VDAGKKVVAKAEKSKK，該多肽能誘導動物產生抗雞chHMGBl抗體。本發明的另一目的是提供一株能分泌抗chHMGBl抗原多肽的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。本發明的又一目的是提供chHMGBl抗原多肽的單克隆抗體，這些多肽制備的單克隆抗體能夠與融合蛋白表達的chHMGBl反應，也能與禽類巨噬細胞系HDll和CEF、DF1細胞中天然的chHMGBl特異性反應，還可以應用于免疫蛋白印跡反應，檢測細胞受到刺激后分泌到培養上清中的chHMGB I。本發明通過以下技術方案實現上述目的篩選合適的chHMGBl多肽序列，獲得良好的免疫原，以此制備抗chHMGBl的單克隆抗體。具體技術方案如下一種ChHMGBl抗原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。chHMGBl蛋白共有16個氨基酸，經過對其進行親水區，疏水區，抗原性等多方面的研究，最終篩選確定16個氨基酸序列即VDAGKKVVAKAEKSKK，作為抗原多肽。一株雜交瘤細胞株2G1是由上述chHMGBl抗原多肽作為抗原制備得到，能夠分泌抗chHMGBl的單克隆抗體，2012年10月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址中國.北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所；保藏編號為 CGMCC No. 6708。一種抗chHMGBl的單克隆抗體是由上述雜交瘤細胞株2G1得到的。該抗chHMGBl的單克隆抗體的制備方法如下I. chHMGBl抗原多妝合成，與匙孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KHL)偶聯后免疫小鼠；2.雜交瘤細胞株制備與篩選取免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合,然后用常規ELISA檢測技術篩選，建立雜交瘤細胞株；3.單克隆抗體的純化對所得雜交瘤細胞株分泌的單抗利用Protein G層析柱純化，SDS-PAGE電泳分析純化結果。上述抗chHMGBl單克隆抗體可以與融合蛋白表達的chHMGBl反應，而且能夠與禽類巨噬細胞系HDll和CEF、DF1細胞中天然的chHMGBl特異性反應；該抗體還可以用于細胞刺激后培養上清中chHMGBl的分析，因此可以用于對chHMGBl分子生物學功能的深入研究，以及監測與chHMGBl分子相關的疾病。


圖IchHMGBl 融合蛋白 westernblot 鑒定M:蛋白 Marker; l:PET32a-chHMGBl;2:GST-chHMGBl。圖2細胞裂解物中chHMGBl蛋白的western blot鑒定
M:蛋白Marker; I: HD11細胞裂解上清；2: CEF細胞裂解上清。圖3HD11細胞培養上清中chHMGBl蛋western blot鑒定Μ:蛋白Marker; I: LPS刺激后I小時；2: LPS刺激后6小時；3: LPS刺激后12小時；4:LPS刺激后24小時。圖4雞高遷移率族蛋白BI間接免疫熒光鑒定(X100)A/D:DF1細胞陽性/陰性對照;B/E:CEF細胞陽性/陰性對照;C/F:HD11細胞陽性/陰性對照。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解這些實施例僅用于解釋發明，而不用于限制發明的范圍。在不背離本發明的技術方案的前提下，對本發明所做的本領域普通技術人員容易實現的任何改動都將落入本發明的權利要求范圍內。實施例IchHMGBl抗原多肽的設計I.雞高遷移率族蛋白BI抗原多肽的設計及合成根據已登錄的雞高遷移率族蛋白BI (GenBank:AF178849，Y17968)獲得chHMGBl蛋白序列，含有215個氨基酸。2.用DNAstar軟件分析chHMGBl蛋白特性、親疏水性、表露性、免疫原性及結構組成情況，最終獲得一段符合要求的序列VDAGKKVVAKAEKSKK位于168 183位(SEQ IDN0:l)o實施例2制備抗chHMGBl的單克隆抗體I.抗原多肽合成與動物免疫根據實施例I的設計抗合成原多肽，該多肽與KHL偶聯，免疫61周齡雌性BALB/c小鼠。采用腹腔直接注射，三免后采集血清進行ELISA實驗測定小鼠血清效價，選擇免疫效價高的小鼠進行加強免疫后準備細胞融合。2.細胞融合取加強免疫三天后的小鼠脾臟，分離脾臟細胞并計數。將分離的脾細胞與骨髓瘤細胞以5:1比例在PEG作用下融合，并分別加入到96孔細胞培養板。利用HAT選擇培養基培養，觀察細胞生長情況。3.陽性雜交瘤細胞的篩選當融合陽性細胞克隆生長出來時，采集細胞上清進行ELISA檢測，單抗分泌陽性孔保留，進一步經過有限稀釋法進行亞克隆篩選。4.單克隆抗體雜交瘤細胞建株經過三次亞克隆篩選，選高分泌特異性抗體的細胞擴大培養或凍存。反復凍存和復蘇的雜交瘤細胞系，經染色體分析穩定，抗體檢測保持陽性的細胞系進行建株命名2G1，同時送中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6708。實施例3chHMGBl單克隆抗體的應用I.檢測抗原制備免疫印跡所需抗原來自原核表達載體表達的chHMGBl融合蛋白、CEF和HDll細胞裂解上清，以及HDll細胞刺激物的培養上清。I. I原核表達載體表達的chHMGBl融合蛋白制備按照Axygen公司總RNA小量制備試劑盒步驟提取DF-I細胞的總RNA,并逆轉錄為cDNA。以新鮮制備的cDNA為模板進行HMGBl基因的擴增，反應體系為50 μ L cDNA模板I μ L，上游引物為5’-AG GAA TTC ATG GGC AM GGA GAT CCT AA_3’(SEQ ID NO:2)下游引物為 5’-GC CTC GAG TTA TTC ATC ATC ATC ATC TT-3’ (SEQ ID NO:3)上下游引物各 IyL(IOnM), dNTP4y L, IOXbuffer (含 MgCl2) 5 μ L，LA TaqDNA 聚合酶 0· 5 μ L，ddw37. 5μ L0PCR反應的循環參數95°C 5min ；95°C 30s,60°C (退火溫度根據不同基因有所調整)30s，72 °C 30s，30個循環；72°C延伸lOmin。反應結束后進行電泳，凝膠濃度1%上樣量5yL。膠回收上樣50 μ L電泳，按照膠回收試劑盒回收PCR產物-20°c保存備用。將目的基因片段與pGEM-T Easy載體(購于美國Promega公司)按說明書要求以3:1的摩爾比在16°C水浴中連接過夜(連接體系10 μ L 5X ligationbuffer2 μ L, pGEM-T載體3 μ L，目的片段3 μ L，T4連接酶I μ L，ddwl μ L)，連接產物5 μ L加入DH5 α大腸桿菌感受態細胞，將轉化后的感受態細胞均勻涂布于LB-Amp平板(添加X-Gal和IPTG)，37°C 過夜培養。挑取白色菌落進行培養，按常規方法提取質粒，用進行EcoRI單酶切鑒定(酶切體系10 μ L =Bufferl μ L, EcoRlO. 5 μ L,質粒3μ L，ddw5. 5μ L),篩選陽性質粒標記為pGEM-T-chHMGBlo利用引物兩端酶切位點EcoR I和XhO I酶切重組質粒pGEM-T_chHMGBI，回收目的條帶并亞克隆入PGEX-6P-1和PET-32a (購于美國羅氏公司)，構建重組原核表達質粒PGEX-chHMGBl和ΡΕΤ-chHMGBl。經IPTG誘導后，超聲波裂解細菌，按照GE公司的蛋白純化試劑盒純化融合蛋白，即為檢測用抗原。I. 2CEF和HDll細胞裂解上清制備CEF和HD11細胞用RIPA細胞裂解液置于冰上裂解I小時，13200rpm離心30分鐘，收集上清即為檢測用抗原。I. 3HD11細胞刺激物的培養上清制備HDll細胞利用400ng/ml的脂多糖(LPS)刺激，分別收集刺激后I小時，6小時，12小時和24小時的培養上清作為檢測用抗原。2. Western blot檢測抗體特異性將檢測用抗原原核表達載體表達的chHMGBl融合蛋白和HDll細胞刺激上清進行SDS-PAGE，然后按照Western印跡操作步驟轉移到硝酸纖維素膜，依次加一抗、二抗(AP標記的羊抗鼠IgG購于美國SIGMA公司)，觀察結果。Western blot結果顯示,2G1不僅可與chHMGBl融合蛋白反應(如圖I),還能與CEF、HD11細胞裂解上清中天然的chHMGBl反應(如圖2)，此外2G1還能與HDll細胞受LPS刺激后釋放到培養上清中的天然chHMGBl反應(如圖3)。3.共聚焦顯微鏡觀察將禽類巨噬細胞系HDll或CEF、DFl爬片培養24h后，取出爬片4%多聚甲醛固定并破膜，BSA封閉后分別孵育一抗,二抗，PBS洗漆五次,控干過量緩沖液,抗淬滅劑封片,然后用萊卡SP2共聚焦顯微鏡觀察chHMGBl在細胞中細胞定位情況。另設Isotype抗體孵育的細胞為陰性對照。共聚焦免疫熒光發現，單克隆抗體2G1能夠與禽類巨噬細胞系HD11、CFF、DF1細胞中天然chHMGBl特異性反應(如圖4)。
權利要求
1.一種能誘導抗雞高遷移率族蛋白BI抗體的抗原多肽，其特征在于氨基酸序列VDAGKKVVAKAEKSKKo
2.一株雜交瘤細胞株，其特征在于由權利要求I所述抗原多肽作為抗原制備得到，能夠分泌抗chHMGBl的單克隆抗體，保藏編號為CGMCC No. 6708。
3.一種抗chHMGBl的單克隆抗體，其特征在于由雜交瘤細胞株CGMCC No. 6708分泌得到。
全文摘要
本發明公開了雞高遷移率族蛋白B1(chHMGB1)抗原多肽和抗chHMGB1的單克隆抗體。該chHMGB1抗原多肽序列為VDAGKKVVAKAEKSKK。以該抗原多肽為免疫原免疫Balb/c小鼠，篩選得到一株雜交瘤細胞株2G1，保藏編號為CGMCCNo.6708。該細胞株能夠持續穩定地分泌抗chHMGB1的單克隆抗體。該單克隆抗體不僅能夠與融合蛋白表達的chHMGB1反應，而且能夠與禽類巨噬細胞系HD11和CEF、DF1細胞中天然的chHMGB1特異性反應；該抗體還可以用于細胞刺激后培養上清中chHMGB1的分析，因此可用于對chHMGB1分子生物學功能的深入研究。
文檔編號C12N5/20GK102924577SQ201210494560
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月28日 優先權日2012年11月28日
發明者錢琨, 秦愛建, 張娜, 朱明月, 高愛俊, 金文杰, 邵紅霞 申請人:揚州大學