專利名稱：一種鞘氨醇單胞菌及其在制備鼠李糖膠中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于發酵工程技術領域，涉及一種高產鼠李糖膠的微生物菌株鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp.)及其應用。
背景技術：
鼠李糖膠(Rhamsan Gum)是由鞘氨醇單胞菌產生的一種胞外多糖,是結冷膠類多糖的一種。結冷膠類多糖具有相同的四糖重復單元主鏈結構D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖，只是側鏈或其它結構有些細微的區別。鼠李糖膠結構如(I)所示。鼠李糖膠以其獨特的物理學和流變學特性以及使用安全性，可作為懸浮劑、穩定劑、增稠劑、乳 化劑、成膜劑等廣泛用于食品、石油、水泥、涂料行業，也用于油墨、食品、紡織印染、農藥、化妝品、醫藥等行業。
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a-D4ik>flH.....11-|1-OCrIc(I)目前，鼠李糖膠尚未被大規模開發，僅美國Kelco公司對其進行/小范圍研究，我國在該領域的研究尚屬空白，未見其產業化生產。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一株能夠高產鼠李糖膠的鞘氨醇單胞菌。本發明還要解決的技術問題，是提供上述鞘氨醇單胞菌的應用。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下發明人于江蘇省南京市老山國家森林國家公園選取的土樣中選育的微生物鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp. )PG_8,目前該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏地址北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，郵編100101。登記入冊的編號是CGMCCN0 :6833，保藏日期是2012年11月15日。以此菌作為生產菌株。CGMCCN0 6833菌株具有下述性質1、菌落形態學特征在蛋白胨瓊脂培養基上營養細胞為0. 5 1. 2X0.大小的桿菌，30° C培養2 3天。在上述培養基中30° C培養12h菌體可以大量生長。菌落呈淡黃色，圓形,表面光滑，粘狀，中間凸起，不透明。2、生理與生化特性(I)培養溫度25 38° C，最適溫度為30-32° C ；(2)在 pH5.(T9.0 范圍內生長;(3)革蘭氏染色陰性；
(4)甲基紅實驗陰性；(5)吲哚生產陰性;(6) H2S 生產陰性;(7)耐NaCl濃度7%濃度以上可以生長。3、1防rDNA序列分析測得16S rDNA大部分序列1443bp,如SEQ ID No :1所示。將所測序列從GeneBank數據庫中的相關種進行比較，構建16S rDNA全序列為基礎的系統發育樹。結果表明菌株與鞘氨醇單胞菌達到99. 9%同源。所以認定本發明使用的是鞘氨醇單胞菌，具體為鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp.)PG_8。
4、營養特征鞘氨醇單胞菌的培養基中不需要添加生長因子，可以利用多種化合物作為碳源，這些物質既可以單獨使用，也可以適當的比例復配充當碳源。有機氮或無機氮都可以作為氮源使用。培養基中各組分用量為碳源l(Tl00g/L，氮源f40g/L，無機鹽0. 0f50g/L，其余為水。碳源一般采用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、檸檬酸、甘油、淀粉和糖蜜中的任意一種或多種；氮源可采用酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、棉籽餅粉、尿素、(NH4)2SCVNH4C1、(NH4)2HPO4和NH4NO3中的任意一種或多種；培養基中還包括鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽、磷酸氫二鹽和鹽酸鹽等一種或多種常用的無機鹽類。上述鞘氨醇單胞菌在制備鼠李糖膠中的應用。具體的方法是將菌株CGMCC NO. 6833接種于含有碳源、氮源、無機鹽和水的無菌發酵培養基中，在合適生長的條件下進行好氧培養，生成的發酵液經提取可得到鼠李糖膠。其中，所述的發酵培養基包含如下組分碳源l(Tl00g/L，氮源f40g/L，無機鹽0. 01 50g/L，其余為水，pH5. 0 9. O。其中，所述的碳源為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、檸檬酸、甘油、淀粉和糖蜜中的任意一種或幾種的組合；氮源為酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、棉籽餅粉、尿素、(NH4)2SCVNH4C1、(順4)2即04和NH4NO3中的任意一種或幾種的組合；無機鹽為硫酸鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽、磷酸氫二鹽和鹽酸鹽中的一種或多種。其中，所述的合適生長的條件是初始pH為5. (T9. O、培養溫度為25 38° C、培養時間為24 72h。其中，發酵結束后，除去菌體的發酵液可提取鼠李糖膠。具體地說本發明提供的制備鼠李糖膠的方法，是將菌株CGMCC No. 6833接種到斜面廣4天后(斜面培養基采用牛肉膏蛋白胨培養基)，在含有碳源、氮源和無機鹽的培養基上培養24 72h，可以生成5 50g/L鼠李糖膠，通常發酵條件優選培養基為葡萄糖l(Tl00g/L，酵母膏 I 10g/L，(NH4)2SO4I 20g/L，K2HPO4I 30g/L，MgSO4 WH2OO. 2 3g/L。發酵溫度 25 38。C，較佳的為3(T32° C ;培養基的初始pH范圍為5. (T9. 0，較佳的為6. 5^8. 0 ;好氧培養。有益效果本發明具有如下優勢(I)本發明篩選到一株鼠李糖膠生產菌，該菌能利用多種碳源和氮源發酵生產鼠李糖膠，操作方便簡單，培養條件十分粗放。
(2)本發明篩選到一株鼠李糖膠生產菌，能夠獲得較高濃度的鼠李糖膠，鼠李糖膠含量最高可至約50g/L,遠高于目前報道的約15g/L[JerryA. Peik, San Diego ；SuzannaM. Steenbergen, Lakeside ；Harold R. Hayden, Escondido, all of Calif.HETEROPOLYSACCHARIDE S-194，美國專利申請號:313, 440，已于 1983 年 8 月 30 日公開]。(2)可以使用纖維素水解糖液(替代葡萄糖或蔗糖)、豆餅粉(替代酵母膏或蛋白胨)作為鼠李糖膠發酵培養基的碳源、氮源，使發酵原料成本大幅下降。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1 :500mL搖瓶發酵Sphingomonas sp. PG-8生產鼠李糖膠。 種子培養基葡萄糖10g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4 7H200. 5g/L，利用NaOH 溶液調 pH6. 8。發酵培養基葡萄糖40g/L,酵母膏 5g/L，(NH4) 2S045g/L, K2HPO4 3H202g/L,MgSO4 7H200. 5g/L，利用 NaOH 溶液調 pH6. 8。將銷氛醇單胞菌Sphingomonas sp. PG-8 (CGMCC N0:6833)接種于種子培養基中，30 ° C、200r/min的搖床條件下培養15h，將種子液按5%( v/v)的種子量接種于預裝有500mL滅菌后的發酵培養基的搖瓶中進行培養，培養條件30° C，200r/min，發酵72h，鼠李糖膠含量達到20. 6g/L。實施例2 3L發酵罐分批發酵Sphingomonas sp. PG-8生產鼠李糖膠。種子培養基及發酵培養基同實施例1。將鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp. PG-8 (CGMCC NO: 6833)接種于種子培養基中，30° C、200r/min的搖床條件下培養15h，將種子液按8%(v/v)的種子量接種于預裝有2.1L滅菌后的發酵培養基的發酵罐中進行培養，培養條件30° C，400r/min，通氣量3. 0L/min,發酵過程中開啟PH自動控制裝置，利用3mol/L HCl或10%氨水(v/v)控制發酵液pH值在
6.5-7. 5之間。發酵48h，鼠李糖膠含量達到23. 5g/L。實施例3 3L發酵罐分批發酵Sphingomonas sp. PG-8生產鼠李糖膠。種子培養基及發酵培養基同實施例1。將銷氛醇單胞菌Sphingomonas sp. PG-8 (CGMCC N0:6833)接種于種子培養基中，32° C、200r/min的搖床條件下培養15h，將種子液按5%(v/v)的種子量接種于預裝有2.1L滅菌后的發酵培養基的發酵罐中進行培養，培養條件30° C，600r/min，通氣量2. 3L/min,發酵過程中開啟PH自動控制裝置，利用3mol/L HCl或3mol/L NaOH溶液控制發酵液pH值在7. 0-7. 5之間。發酵48h，鼠李糖膠含量達到28. 9g/L。實施例4 3L發酵罐間隙補料分批發酵Sphingomonas sp. PG-8生產鼠李糖膠。種子培養基及發酵培養基同實施例1。補料培養基為葡萄糖500g/L，葡萄糖總量為 80g/L。將銷氛醇單胞菌Sphingomonas sp. PG-8 (CGMCC N0:6833)接種于種子培養基中，30° C、200r/min的搖床條件下培養16h，將種子液按10% (v/v)的種子量接種于預裝有2.1L滅菌后的發酵培養基的發酵罐中進行培養，培養條件30° C，400r/min，通氣量3. OL/min，發酵過程中開啟pH自動控制裝置，利用3mol/L HCl或3mol/L NaOH控制發酵液pH值在6. 8-7. 2之間。當發酵液中殘留總糖在10g/L時，打開補料裝置，分兩次(每次20g/L)將總量為40g/L的葡萄糖補入發酵液中，發酵72h，鼠李糖膠含量達到38. 9g/L。實施例5 100L發酵罐恒流補料發酵Sphingomonas sp. PG_8生產鼠李糖膠。種子培養基及發酵培養基同實施例1。補料培養基為葡萄糖500g/L，葡萄糖總量為 80g/L。將銷氛醇單胞菌Sphingomonas sp. PG-8 (CGMCC N0:6833)接種于種子培養基中，31° C、200r/min的搖床條件下培養16h，將種子液按10% (v/v)的種子量接種于預裝有
6.3L滅菌后的種子培養基的10L種子罐中，31° C、400r/min條件下培養8h，將其移種至100L發酵罐中，該發酵罐中預裝有63L滅菌后的發酵培養基。100L發酵罐發酵條件如下 31° C，300r/min，通氣量84L/min，發酵過程中開啟pH自動控制裝置，利用3mol/LHCl或3mol/LNa0H控制發酵液pH值在6. 8-7. 2之間，當發酵液中葡萄糖濃度低至5g/L時，利用補料泵將補料培養基泵入發酵液中，維持發酵罐中糖濃度5-10g/L之間，發酵72h，葡萄糖總量達80g/L，發酵液中鼠李糖膠含量達到50. 0g/L。實施例6 500mL搖瓶發酵Sphingomonas sp. PG-8生產鼠李糖膠。種子培養基同實施例1。發酵培養基葡萄糖50g/L，玉米漿50g/L，NH4C13g/L,K2HPO4 3H204g/L, MgSO4 7H200. 2g/L，利用 NaOH 溶液調 pH7. 0。將銷氛醇單胞菌Sphingomonas sp. PG-8 (CGMCC N0:6833)接種于種子培養基中，35° C、220r/min的搖床條件下培養12h，將種子液按8%(v/v)的種子量接種于預裝有500mL滅菌后的發酵培養基的搖瓶中進行培養，培養條件35° C，220r/min，發酵68h，鼠李糖膠含量達到29. 7g/L。實施例7 :3L發酵罐分批發酵Sphingomonas sp. PG-8生產鼠李糖膠。種子培養基同實施例1。發酵培養基鹿糖50g/L，棉籽餅粉25g/L，NH4N038g/L,K2HPO4 3H204g/L, MgSO4 7H205g/L，利用 NaOH 溶液調 pH8. 5。將銷氛醇單胞菌Sphingomonas sp. PG-8 (CGMCC N0:6833)接種于種子培養基中，38° C、220r/min的搖床條件下培養12h。將種子液按10% (v/v)的種子量接種于預裝有2.1L滅菌后的發酵培養基的發酵罐中進行培養，培養條件38° C，800r/min，通氣量3. OL/min，發酵過程中開啟pH自動控制裝置，利用3mol/LHCl或3mol/LNa0H控制發酵液pH值在
7.5-7. 8之間。當發酵液中殘留總糖在10g/L時，打開補料裝置，分兩次(每次15g/L)將總量為30g/L的蔗糖補入發酵液中，發酵72h，鼠李糖膠含量達到42. 5g/L。實施例8 100L發酵罐分批發酵Sphingomonas sp. PG-8生產鼠李糖膠。種子培養基同實施例1。發酵培養基葡萄糖50g/L，豆餅粉20g/L，NH4N038g/L,K2HPO4 3H204g/L, MgSO4 7H205g/L，利用 NaOH 溶液調 pH8. 5。將銷氛醇單胞菌Sphingomonas sp. PG-8 (CGMCC N0:6833)接種于種子培養基中，34° C、220r/min的搖床條件下培養10h，將種子液按12% (v/v)的種子量接種于預裝有6. 3L滅菌后的種子培養基的10L種子罐中，34° C、220r/min條件下培養10h，將其移種至100L發酵罐中，該發酵罐中預裝有63L滅菌后的發酵培養基。100L發酵罐發酵條件如下34° C，220r/min，通氣量84L/min，發酵過程中開啟pH自動控制裝置，利用3mol/LHCl或3mol/L NaOH控制發酵液pH值在7. 5-7. 8之間，當發酵液中葡萄糖濃度低至5g/L時，利用 補料泵將補料培養基泵入發酵液中，維持發酵罐中糖濃度5-10g/L之間，發酵72h，葡萄糖總量達80g/L，發酵液中鼠李糖膠含量達到48. 5g/L。
權利要求
1.一種鞘氨醇單胞菌其分類命名為鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp. )PG_8,已保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，登記入冊的編號是CGMCC NO. 6833，保藏日期是2012年11月15日。
2.權利要求1所述的鞘氨醇單胞菌在制備鼠李糖膠中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，將菌株CGMCCNO. 6833接種于含有碳源、氮源、無機鹽和水的無菌發酵培養基中，在合適生長的條件下進行好氧培養，生成的發酵液經提取可得到鼠李糖膠。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的發酵培養基包含如下組分碳源10 100g/L，氮源 I 40g/L，無機鹽 O. 01 50g/L，其余為水，pH5. 0^9. O。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的碳源為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、檸檬酸、甘油、淀粉和糖蜜中的任意一種或幾種的組合；氮源為酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、棉籽餅粉、尿素、(NH4)2SCVNH4C1、(NH4)2HPO4和NH4NO3中的任意一種或幾種的組合；無機鹽為硫酸鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽、磷酸氫二鹽和鹽酸鹽中的一種或多種。
6.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的合適生長的條件是初始pH為5.0 9. O、培養溫度為25 38° C、培養時間為24 72h。
全文摘要
本發明公開一種鞘氨醇單胞菌，其分類命名為鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp.)PG-8，已保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，登記入冊的編號是CGMCC NO.6833，保藏日期是2012年11月15日。本發明還公開鞘氨醇單胞菌在制備鼠李糖膠(Rhamsan Gum)中的應用。利用該菌株在含有碳源、氮源、無機鹽的培養基中培養，在優化條件下能積累鼠李糖膠5～50g/L。該菌株能利用多種碳源和氮源，培養條件粗放，操作方便簡單，鼠李糖膠產量高，生產成本低，能廣泛應用于食品添加、石油鉆井等領域。
文檔編號C12R1/01GK103013863SQ20121050446
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月30日 優先權日2012年11月30日
發明者徐虹, 徐曉瀅, 董淑浩, 李莎, 粱金豐 申請人:南京工業大學