專利名稱：特異于流感病毒h5亞型或者n1亞型的血凝素和神經氨酸酶的單克隆抗體及其應用的制作方法
特異于流感病毒H5亞型或者NI亞型的血凝素和神經氨酸酶的單克隆抗體及其應用
本申請為申請日為2008年9月12日、申請號為200880115546.4、發明名稱為“特異于流感病毒H5亞型或者NI亞型的血凝素和神經氨酸酶的單克隆抗體及其應用”的發明專利申請的分案申請。發明領域
本發明涉及檢測和治療禽流感病毒(“AIV”)的抗體和相關的結合蛋白。更具體地，本發明涉及可用于檢測和治療AIV的高致病性H5和NI亞型的單克隆抗體及相關的結合蛋白，以及涉及診斷、監視和治療動物和人體內AIV感染的方法和產品。
發明背景
H5N1禽流感病毒也許成為下一次流感流行的原因。每年甲型流感感染的爆發是持續的公共健康威脅，新的流感毒株可以周期性呈現，人對于其具有較低的免疫性，導致破壞性流行。1918年由HlNl流感病毒引起的“西班牙流感”爆發導致世界范圍內超過4千萬人死亡。HlNl的來源也許是從鳥類直接傳染人，或者也許潛伏于中間宿主如豬或者仍未鑒別的另一動物宿主中(I)(在本文結尾處提供參考書目)。分別由H2N2和H3N2流感病毒引起的1957年和1968年流感流行,可能源自重配事件(reassortment),其中一或兩種適應人的病毒表面蛋白由禽流感毒株的蛋白質置換(2)。
H5N1病毒具有感染史無前例范圍的宿主的能力，包括食肉動物。1997年證實第一例感染的人。高致病性H5N1感染在禽類和人類中均發生。這是已發現的首次禽流感病毒從鳥類直接傳播至人類。之后，根據世界衛生組織(WHO)報告，人H5N1感染病例總數從2003年在東南亞開始爆發至今已經有281例，死亡169例。印度尼西亞在2005年6月報道其首例人H5N1病毒所致禽流感病例。迄今為止，這是唯一一個給出2007年報道的國家，截至2007年3月共81例證實的人感染病例，其中63例死亡。
流感病毒根據其核蛋白和基質蛋白抗原特異性分類。這些病毒主要被分為A、B和C血清型，A型具有8個RNA節段，其編碼十個病毒蛋白。所有已知的A型流感病毒均源自鳥類。這個類別的病毒可以感染其它物種，如馬、豬、貓頭鷹和海豹，并且對人類造成威脅(23)。根據包膜糖蛋白的抗原性性質，可以將A型流感病毒進一步分為亞型，根據血凝素(“HA”)分為Hl至H16亞型，根據神經氨酸酶(“NA”)分為NI至N9亞型(24，25，26)。據信在HA1-HA2連接處的HA蛋白質的蛋白酶解與禽流感毒株的病原性相關，而且在這個裂解位點周圍疏水性氨基酸的存在是H5亞型的特點。此外，據信HA蛋白質介導與宿主細胞sialoside受體附著，隨后通過膜融合進入細胞(27), HA蛋白質被認為作為中和抗體的主要靶位(26)。
在急性呼吸系統疾病爆發期間進行檢測可以確定流感是否是爆發原因。在流感季節，檢測呈現與流感一致的呼吸系統疾病的選擇患者可幫助確定流感是否存在于特定患者群中，并且幫助衛生保健人員確定怎樣使用其臨床判斷診斷和治療呼吸系統疾病。快速流感檢測幫助確定是否使用抗病毒藥物。 一些檢測如病毒培養、逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)以及血清學檢測是常規方法，但是不能及時獲得結果而為臨床醫生提供幫助(3)。目前常用的大多數快速診斷檢測是基于單克隆抗體的免疫測定(3，4，5)。免疫熒光測定(熒光抗體染色)是另一種快速流感病毒診斷檢測法，其可用于許多醫院實驗室中，且通常可以在2-4小時內產生結果。首要的是特異性單克隆抗體產生是大多數常用的快速、靈敏性和有成本效益的診斷方法的基礎。
區域性獨特的亞系的鑒別表明H5N1病毒是地理學廣泛分布的，具有遺傳和抗原性差異。種系發生學研究示出來自印尼的所有病毒形成H5N1基因型Z病毒的一個獨特亞系，提示這種爆發可能由于單一引入傳播遍及整個國家造成的(14，15)。獲得特異性識別印尼流感分離株的單克隆抗體是非常有益的。獲得也覆蓋越南和新加坡流感分離株的這種mAb也是非常有益的。
發明目的
本發明的目的是提供特異性結合AIV的H5和NI亞型的、特別是結合H5和NIIndonesia AIV分離株的單克隆抗體(mAb)及相關的結合蛋白。單克隆抗體應答的特異性為有效診斷試劑提供基礎。衍生自其中的mAb和結合蛋白也可以用作治療劑。
發明概述
根據本發明，提供了特異于H5亞型血凝素糖蛋白的線性和構象表位或者NI亞型神經氨酸酶糖蛋白的線性和構象表位的單克隆抗體及相關的結合蛋白。線性H5表位的mAb能以良好的特異性和靈敏性檢測變性的樣品如福爾馬林固定的組織樣品中的H5N1及其它H5亞型病毒毒株，而靶向H5或者NI構象表位的那些mAb用于檢測未進行預處理的組織如冷凍組織樣品及其它生物學組織和體液中的H5N1及其它NI亞型病毒。H5表位的mAb和NI表位的mAb可以組合使用，以特異性診斷H5N1病毒分離株。
具體地，稱作5A5的mAb靶向H5亞型血凝素的線性表位。稱作5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1和3H11的其它mAb靶向H5亞型血凝素的構象表位。稱作8H12的mAb靶向NI亞型神經氨酸酶的線性表位，稱作6C6和3D4的兩個抗體靶向NI亞型神經氨酸酶的構象表位。因此,本發明包含基本上具有如mAb 5A5對于線性H5亞型血凝素表位的免疫學結合特性的結合蛋白，以及基本上具有如mAb 8H12對于線性NI亞型神經氨酸酶表位的免疫學結合特性。本發明進一步包含基本上具有如mAb 5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1和3H11對于H5亞型血凝素構象表位的免疫學結合特性的結合蛋白。本發明還包含基本上具有如mAb 6C6或3D4對于NI亞型神經氨酸酶構象表位的免疫學結合特性的結合蛋白。
另一方面，本發明包含檢測樣品中H5亞型AIV的方法，包括檢測AIV與基本上具有mAb 5A5、5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1或者3H11的免疫學結合特性的mAb或者結合蛋白的結合。本發明還包含檢測樣品中NI亞型AIV的方法，包括檢測AIV與基本上具有mAb6C6、3D4或者8H12的免疫學結合特性的mAb或者結合蛋白的結合。具體地，本發明涉及利用這種結合蛋白的免疫熒光測定、免疫組織化學測定以及ELISA方法。識別H5亞型AIV的抗體可以與識別NI亞型AIV的抗體組合使用，以檢測H5N1病毒。
另一方面，本發明涉及檢測AIV的試劑盒，其包含基本上具有mAb5A5、5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1、3H11、8H12、3D4和/或6C6的免疫學結合特性的結合蛋白。
本發明進一步涉及治療感染H5 AIV毒株如H5N1 AIV毒株的對象的方法，包括給予這種對象有效量的一或多種基本上具有mAb 5C5、2D9、4F8、2F11、9C1、3H11、 3D4或者6C6的免疫學結合特性的單克隆抗體或者結合蛋白。
附圖簡述


圖1A-1D示出感染AIV H5N1的MDCK細胞與無病毒感染的MDCK細胞的IFA圖像對比。圖1A是在MDCK細胞中檢測到H5N1的圖像。在圖1B中，紫外光與正常光的合并示出由病毒感染的各個細胞與未感染細胞的對比。如圖1C所示，在無病毒感染的MDCK細胞上無熒光信號。圖1D示出在與圖1C相同的細胞上紫外光與正常光的合并。
圖2A和2B示出MDCK細胞上流感病毒的單克隆抗體中和活性。在圖2A中，在單克隆抗體中和H5N1病毒感染后用FITC熒光染色MDCK細胞。在圖2B中，用FITC熒光染色MDCK細胞而無H5N1病毒感染的單克隆抗體中和。
圖3A和3B示出SDS-PAGE和蛋白印跡，用以鑒別mAb與線性化重組HAl之間的結合。在圖3A中，在SDS-PAGE凝膠中，HAl為大約37kD，表達的GST-標記的HAl為大約61kD。單獨GST為26kD。在圖3B中，蛋白印跡示出重組HAl與mAB 5A5反應。除了在61kD的主要條帶之外還存在較小的條帶，提示當GST-HAl在大腸桿菌中表達時的降解。泳道I,無IPTG-誘導表達的大腸桿菌樣品；泳道2和3，大腸桿菌中IPTG-誘導的GST-HAl表達；泳道4，純化的GST樣品。
圖4A和4B例證了 mAb 5A5的線性表位作圖。圖4A是血凝素蛋白HAl的示意圖，示出表達不同長度HAl片段的克隆構建體以及其與mAb5A5的反應性。圖4B是突變的血凝素HAl片段的示意圖，示出表達HAl片段上不同突變的克隆構建體以及其與mAb 5A5的反應性。
圖5A和5B示出mAb 6C6或3D4與表達的重組NI之間的典型反應。圖5A示出在Sf9細胞中檢測的表達的重組NI。在圖5B中，紫外光與正常光的合并示出各個細胞。
圖6A和6B示出SDS-PAGE和蛋白印跡以驗證表達的NA。
圖7A、7B和7C示出MDCK細胞上流感病毒的單克隆抗體中和活性。在圖7A中，在單克隆抗體中和H5N1病毒感染之后通過顯微鏡觀測MDCK細胞。在圖7B中，在作為CPE陽性對照的未經單克隆抗體中和H5N1病毒感染的條件下，通過顯微鏡觀測MDCK細胞。在圖7C中，在作為CPE陰性對照的不存在病毒和mAb的條件下示出MDCK細胞。
發明詳述
本發明涉及特異性結合AIV H5亞型血凝素糖蛋白或者AIV NI亞型神經氨酸酶糖蛋白的mAb及相關的抗原結合蛋白。具體地，所述mAb或者相關的抗原結合蛋白具有如下抗體的免疫學結合特性:mAb 5A5，由在2007年7月10日在美國典型培養物保藏中心(ATCC)保藏的保藏號為PTA-8528的雜交瘤5A5產生，mAb 5C5，由在2007年7月10日在ATCC中保藏的保藏號為PTA-8529的雜交瘤5C5產生，mAb 6C6，由在2007年7月10日在ATCC中保藏的保藏號為PTA-8526的雜交瘤6C6產生，mAb 2D9，由在2008年7月29日在ATCC中保藏的保藏號為PTA-9396的雜交瘤2D9產生，mAb 4F8，由在2008年7月29日在ATCC中保藏的保藏號為PTA-9397的雜交瘤4F8產生，mAb ICl，由在2008年7月29日在ATCC中保藏的保藏號為PTA-9398的雜交瘤ICl產生，mAb 3B6,由在2008年7月29日在ATCC中保藏的保藏號為PTA-9399的雜交瘤3B6產生，mAb 3D4，由在2008年7月29日在ATCC中保藏的保藏號為PTA-9395的雜交瘤3D4產生，mAb8H12,由在2008年7月29日在ATCC中保藏的保藏號為PTA-9394的雜交瘤8H12產生， mAb 2F11，由在2008年7月16日在ATCC中保藏的保藏號為PTA-9373的雜交瘤2F11產生，mAb 9C1，由在2008年7月16日在ATCC中保藏的保藏號為PTA-9372的雜交瘤9C1產生，或mAb 3H11，由在2008年7月16日在ATCC中保藏的保藏號為PTA-9374的雜交瘤3H11產生。所有保藏物均根據布達佩斯條約的規定而進行。本發明進一步包含這些雜交瘤，且提供了本發明的mAb和結合蛋白的持續來源。
本發明進一步涉及檢測和診斷H5亞型AIV感染的方法以及包含本發明mAb或者結合蛋白的試劑盒。本發明進一步涉及通過給予有效量的本發明的一或多種抗體或者相關的結合蛋白治療H5或者NI AIV毒株感染對象的方法。具體地，在這個實施方案中，所述對象感染H5N1亞型AIV印尼分離株。本發明的抗體也可以作為預防措施給予處于可能發生流感流行事件中的對象。在這種情況中，給予抗體的有效量是用于治療H5或者NI AIV感染的量的大約一半。
在本文中使用的各個術語具有如下含義。
所有語法形式的術語mAb或者相關的結合蛋白的“免疫學結合特性”是指所述mAb或者結合蛋白對其抗原的特異性、親和性和交叉反應性。
術語“線性表位”是指形成抗體結合位點的具有大約4-12個氨基酸的連續序列。本發明mAb的線性表位優選在由HAl病毒基因編碼的血凝素蛋白的大約第260至大約第269位氨基酸的區域中。結合mAb或者結合蛋白形式的線性表位可以是變性蛋白質，其基本上沒有三級結構。
術語構象表位是指在H5亞型血凝素糖蛋白或者NI亞型神經氨酸酶糖蛋白中以其天然三維形式存在的mAb或者相關的結合蛋白的結合位點。
術語結合蛋白是指包括如下所述那些的蛋白質，所述蛋白質包括本發明mAb的抗原結合位點或者具有本發明mAb的免疫學結合特性的mAb的抗原結合位點。
本發明有利地提供了通過用AIV亞型H5N2 (A/chicken/Singapore/98)免疫動物制備具有mAb 5A5的結合特性的單克隆抗體、通過用AIV亞型H5N2 (A/chicken/Singapore/98)免疫動物制備具有mAb 5C5的結合特性的單克隆抗體、或者通過用AIV亞型H7N1 (A/chicken/Singapore/94)免疫動物制備具有mAb 6C6的結合特性的單克隆抗體的方法。本發明進一步有利地提供了通過用AIV亞型H5N2 (A/chicken/Singapore/98)免疫動物制備具有mAb2D9和mAb 3B6的結合特性的單克隆抗體的方法。本發明還提供了通過用親代禽流感病毒A/Vietnam/1203/2004/H5Nl在第205位氨基酸具有由賴氨酸突變為甲硫氨酸的逃逸突變株免疫動物制備具有mAb 2F11或者9C1的結合特性的單克隆抗體的方法,或者通過用AIV亞型A/Indonesia/CDC669/2206/H5N1免疫動物制備具有mAb 3H11的結合特性的單克隆抗體的方法。本發明另外提供了通過用AIV亞型H7N1 (A/chicken/Singapore/94)免疫動物制備具有mAb 3D4和mAb 8H12的結合特性的單克隆抗體的方法，以及通過用AIV亞型H5N2 (A/chicken/Singapore/98)免疫動物制備mAb 4F8和ICl的方法。任何這種抗原均可用作免疫原以產生具有希望的免疫學結合特性的抗體。這種抗體包括但不限于包含 mAb 5A5、5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1、3H11、8H12、6C6 或者 3D4 的抗原結合序列的單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和蛋白質。
本發明的mAb可以通過持續培養細胞系產生抗體分子的任何技術產生。這種方法包括但不限于最初由Kohler and Milstein (Nature 256:495-497)在1975年揭示的雜交瘤技術，以及三源雜交瘤技術、 人B-細胞雜交瘤技術(Kozbor et al., 1983, ImmunologyToday 4:72)以及EBV-雜交瘤技術以產生人單克隆抗體(Cole et al., MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy Alan R.Liss, Inc.，pp77_96 (1985))。可以使用人抗體且其可以通過使用人雜交瘤獲得(Cote et al.，1983，Proc.Nat’ 1.Acad.Sc1.U.S.A.，80:2026-2030)或者通過用EBV病毒在體外轉化人B細胞獲得(Cole etal., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, pp.77-96)。此夕卜，可以使用產生“嵌合抗體”或者“人源化抗體”的技術(Morrison et al.，1984，J.Bacteriol.159-870;Neuberger et al., 1984,Nature 312:604-608;Takeda etal.，1985，Nature314:452-454)，通過導入來自本發明小鼠抗體分子如mAb 5C5、5A5、6C6、2D9、4F8、1C1、3B6、3D4、8H12、2F11、9C1或者3H11的序列與來自具有合適生物學活性的人抗體分子的基因產生所述抗體。嵌合抗體是含有人Fe部分和小鼠(或者其它非人動物)Fv部分的那些抗體。人源化抗體是在人抗體中摻入小鼠(或者其它非人動物)互補決定簇(CDR)的那些抗體。嵌合抗體和人源化抗體均是單克隆抗體。優選這種人或者人源化嵌合抗體用于人類疾病的體內診斷或者治療中。
根據本發明，可以對產生單鏈抗體的技術(美國專利4，946，778)加以調整，以提供本發明的單鏈抗體。本發明的另一實施方案利用構建Fab表達文庫的技術(Huse etal.，1989，Science 246:1275-1281)，以快速及簡便地鑒別對于本發明的抗體具有希望的特異性的單克隆Fab片段或者其衍生物或者類似物。
含有抗體分子獨特型的抗體片段可以通過已知技術產生。例如，這種片段包括但不限于:F(ab’ )2片段，其可以通過胃蛋白酶消化抗體分子而產生；Fab’片段，其可以通過還原F (ab’)2片段的二硫鍵而產生；以及Fab片段，其可以通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子而產生。這種抗體片段可以從本發明的任何多克隆或者單克隆抗體中產生。
在抗體的產生中，可以通過本領域已知技術篩選希望的抗體，所述技術例如放射免疫測定、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、“夾心”免疫測定、免疫放射測定、凝膠擴散沉淀反應、免疫擴散測定、原位免疫測定(例如使用膠體金、酶或者放射性同位素標記)、蛋白印跡、沉淀反應、凝集試驗(例如凝膠凝集試驗、凝血試驗)、免疫熒光測定以及免疫電泳測定。在一個實施方案中，通過檢測一抗上的標記檢測抗體結合。在另一個實施方案中，通過檢測二抗或者其它試劑與一抗的結合檢測一抗。在再一個實施方案中，二抗是標記的。本領域已知在免疫測定中檢測結合的方式，且包含在本發明范圍內。
前述抗體可用于本領域已知關于檢測或者定位H5或者NI亞型AIV的方法中，例如蛋白印跡、ELISA、放射性免疫測定、免疫熒光測定、免疫組織化學測定等。本文揭示的技術可用于定性和定量確定H5亞型AIV，以及用于診斷和監視病毒感染的動物或者人。
本發明還包括定性和/或定量確定H5亞型AIV的測定和檢測試劑盒。這種測定系統和檢測試劑盒可包含標記的成分，所述標記的成分例如通過用放射性原子、熒光基團或者酶標記、與本發明的mAb或者相關的結合蛋白或者其結合配體結合而制備。這種測定或者檢測試劑盒進一步可包含試劑、稀釋劑和使用說明書，這些為免疫測定技術領域技術人員熟知。
在本發明的某些實施方案中，根據選擇的方法如“競爭性”、“夾心”、“DASP”等方法，這種試劑盒至少含有本發明的mAb或者相關的結合蛋白、檢測所述mAb或者相關的結合蛋白與生物學樣品中的AIV免疫特異性結合的工具， 以及使用說明書。所述試劑盒也可以含有陽性和陰性對照物。它們可以被設計為與自動分析儀或者自動免疫組織化學玻片染色設備一起使用。
本發明的測定試劑盒可進一步包含可以被標記或者可以被提供用于附著于固體支持物(或者附著于固體支持物)的二抗或者結合蛋白。這種抗體或者結合蛋白可例如是結合AIV的抗體或結合蛋白。這種二抗或者結合蛋白可以是多克隆或者單克隆抗體。
H5亞型血凝素或者NI亞型神經氨酸酶蛋白的單克隆抗體可以通過用AIV或者其H5或NI蛋白或片段免疫動物而制備。制備H5亞型血凝素蛋白的抗體的優選方法是擴增H5亞型HAl基因，隨后表達該基因，回收并純化H5亞型重組蛋白以及將該純化的蛋白質用作免疫原。例如,通過用可獲得的毒株接種雞胚以增殖H5N1 AIV，隨后分離該病毒RNA。通過逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)擴增HAl基因，然后將其克隆進桿狀病毒載體中，用于在昆蟲細胞中表達H5蛋白質。然后可將如此產生的蛋白質用于免疫小鼠或者其它合適物種，以產生雜交瘤。相似的程序可用于獲得NI蛋白質以產生雜交瘤。
篩選雜交瘤產生能特異性結合H5或NI蛋白質的高親和性mAb的能力，并將其與其它AIV亞型區分。根據本發明，發現具有病毒中和能力的抗體能識別H5亞型血凝素蛋白中的構象表位。這個發現得自在Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞或者雞胚中1_2次選擇循環之后在存在每種中和mAb的條件下病毒逃逸突變株的產生。通過RT-PCR從這些中和逃逸突變株中克隆所述HAl基因并測序，以鑒別點突變。在這組抗體中，在mAb 5C5、2F11、9C1和3H11中發現中和表位。使用凝血抑制試驗證實中和逃逸能力。
HAl含有338個氨基酸，包括具有16個氨基酸的信號肽。為了研究線性表位在蛋白質上的分布，有利地檢測截短的和突變的片段與mAb的結合，例如通過蛋白印跡或者相似技術檢測。可以鑒別線性表位，其是mAb的結合靶位，在使用免疫組織化學染色方法檢測如在福爾馬林固定的組織中存在的變性的H5亞型蛋白中具有良好性能。以這種方式對H5亞型mAb作圖提供了進一步研究和更有效地臨床診斷感染性H5N1 AIV的平臺。
本發明還提供了對于AIV H5血凝素和NI神經氨酸酶分子的抗原性結構的更好的了解。本發明的mAb及相關的結合蛋白提供了在冷凍切片和生物學樣品中檢測這種高致病性病毒的方式和方法。
檢測石蠟切片中的病毒的能力具有重要意義。在大多數情況中，感染的組織切片中的AIV抗原由于固定過程而被破壞。福爾馬林和乙醇具有除去脂質包膜和包膜糖蛋白包括血凝素的潛力，因此增加了病毒抗原檢測的難度。因此，本發明這種形式的診斷具有提供更安全和更精確診斷AIV感染的動物和人體組織的潛力。
如在下文實施例中例證，mAb 5A5對于福爾馬林固定的組織中的病毒抗原是是高效且靈敏的。這種抗體使得感染區域易于在光學顯微鏡下被觀測到。抗體5A5不具有血凝素抑制作用或者病毒中和活性；然而其在免疫熒光測定和蛋白印跡分析中呈現出陽性結果，觀測到相應于重組H5N1-HA蛋白(MW 36kDa)的強條帶。
MAb 8H12對于福爾馬林固定的組織中的病毒抗原也是高效和靈敏的。這個抗體也使得感染區域易于在光學顯微鏡下被觀測到。
相反，mAb5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、6C6、3D4、2F11、9C1 和 3H11 對于冷凍組織切片是高效的，但是在福爾馬林固定的組織中未檢測到抗原。這些結果提示著兩組mAb與不同的病毒表位反應。通過表位作圖， 確定mAb 5A5和8H12靶向線性表位。僅當對組織進行強力熱處理時，它們可以檢測病毒抗原。在這種嚴苛的抗原提取方法中，病毒的表面蛋白被破壞，使得病毒的核蛋白被暴露。因此，靶向線性表位的mAb對于冷凍組織切片不起作用。
確定單克隆抗體5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、6C6、3D4、2F11、9C1 和 3H11 靶向 H5N1 病毒的構象表位。表位作圖用于對mAb 5C5、2D9、4F8、2F11、9C1和3H11作出這種確定J^mAb6C6和3D4的確定是基于所述抗體不能識別來自SDS-PAGE的變性的神經氨酸酶。這些抗體能結合且識別病毒抗原，而不用對組織切片進行預先處理。
本發明提供了檢測AIV的H5和NI亞型的便利的高特異性且靈敏的方式和方法。一種這樣的方式和方法是ELISA。在優選的實施方案中，mAb5A5、5C5、2D9、4F8、lCl、3B6、2F11、9C1和3H11單獨或者組合地用作捕獲抗體。已經發現mAb 5A5與5C5的組合與單獨使用抗體或者本文所述其它組合相比在檢測H5亞型AIV中提供高光密度讀數。不受理論的約束，對于這些結果的一種可能的解釋是這兩種抗體與HAl蛋白上的不同表位反應且是不同的抗體亞類，因此提供多個結合位點。
如果單獨使用抗體，可以使用選擇的抗體例如作為捕獲抗體，且與辣根過氧化物酶(HRP)綴合的相同抗體可用作檢測抗體。6C6、3D4和8H12抗體可相似地用作捕獲抗體以檢測AIV的NI亞型毒株。
構象表位的單克隆抗體保持重要的生物學功能，如凝血抑制作用和中和活性，而針對線性表位的mAb也有利于診斷應用。因此，使用分別針對線性和構象表位的mAb 5A5以及mAb 5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1和3H11，可以明顯提高ELISA方法的靈敏性。相似地，使用分別針對NI神經氨酸酶的線性和構象表位的mAb 8H12以及mAb 6C6和3D4，可以明顯提高ELISA方法的靈敏性。使用兩種mAb的方法也可以用于開發檢測H5和NI病毒的其它免疫學方法，例如通過點-印跡(dot-blot)和原位雜交方法。
本發明的優選ELISA測試在印尼H5N1 AIV感染的禽類和人體中能檢測出HA抗原，表明本發明在檢測禽和人H5N1感染中的用途。
本發明的H5亞型和NI亞型mAb具有優于目前作為診斷工具的其它方法的優勢。首先，mAb 5A5、5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1 和 3H11 對于高感染性 H5 亞型 AIV 具有高特異性，且除了 9C1 mAb之外所有mAb均示出識別所有或者幾乎所有已知的H5N1印尼株。此外，mAb6C6、3D4和8H12對于NI亞型AIV是高特異性的，且可以用于診斷NI亞型病毒感染，包括所有或者幾乎所有已知的H5N1印尼株。這種高特異性單克隆抗體代表禽流感診斷領域的突破。在本發明之前，未報到有單克隆抗體可以檢測所有或者幾乎所有印尼H5N1病毒。而除了一種抗體之外，本發明的所有單克隆抗體均示出識別在最近兩年內在印尼收集的所有或者基本所有H5N1病毒。MAb 6C6、3D4或者8H12可以與mAb 5A5、5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11或者3H11組合使用(一起或相繼使用)，以確認一特定的分離株是H5N1分離株。此外，所述mAb在感染的福爾馬林固定組織以及血清學檢測如HI和IFA中檢測及精確定位H5病毒抗原的能力呈現出獨特優勢。再者，這些mAb提供了檢測H5和NI AIV感染的安全且便利的診斷方法。冷凍的切片玻片可以低溫長期貯存，且便于感染的進一步診斷和監視。本發明的抗體因此可用于診斷H5N1感染。如下文論述，本發明的mAb也可用于治療H5N1感染。因此，本發明的mAb在遏制潛在流感流行中是非常有效的工具。
本發明的另一實施方案涉及H5禽流感的中和逃逸突變株。術語中和逃逸突變株是指由在編碼血凝素的基因中的點突變產生的突變病毒，所述點突變導致H5或者NI病毒中抗原漂移，且影響中和表位。中和逃逸突變株可以逃避在中和其親代病毒中有效的某些單克隆抗體的中和作用。在逃逸突變株的人工篩選中，將親代病毒與某一中和抗體一起保溫并接種于宿主如MDCK細胞或者雞胚中。在2-3次篩選循環之后，克隆所述中和mAb的逃逸突變株，并對其進行HAl基因測序。突變的氨基酸通過與親代病毒序列對比而確定，且突變的位點精確示出包含由所述中和mAb識別的中和表位的氨基酸之一。在本發明中，通過5C5中和單克隆抗體從A/Indonesia/⑶C669/H5N1 AIV中產生5C5逃逸突變株。所述突變位點列于下文實施例3和表4中。通過2F11中和單克隆抗體從A/Vietnam/1203/2004/H5N1中產生2F11逃逸突變株。通過9C1中和單克隆抗體從A/Vietnam/1203/2004/H5Nl的K189M突變株中產生9C1逃逸突變株。此外，3H11、2F9和9C I逃逸突變株從A/Indonesia/⑶C669/2006/H5N1中產生。所述突變位點在下文實施例3和表4中列出。
中和逃逸突變株與其親代病毒不同，其不再可以由特異性結合親代病毒的某些中和抗體識別。鑒于此，根據上述教導，這些突變株可用于免疫小鼠以產生新的單克隆抗體。在新的mAb中，可以篩選出精確識別突變表位的單克隆抗體，并將其用于提供對于不同于親代病毒的禽流感病毒的互補監視。通過重復這種方法通過幾個世代，可以發現進一步的逃逸突變株，以及獲得進一步的中和抗。這些抗體可用于本發明的方法中。
在本發明的另一個實施方案中，可以給予本發明的抗體和相關的結合蛋白以治療受累于H5 AIV感染的對象，特別是AIV的H5N1亞型感染對象。本發明的抗體和相關的結合蛋白在流感流行或者潛在流行的情況中也可以作為預防措施給予對象。所述抗體及相關的結合蛋白可以以單一劑量或者重復給予，任選以緩釋形式給予。可以通過使所述抗體到達治療對象體內其作用部位的任何方式給予，例如通過靜脈內、肌內、皮內、口服或者經鼻給予。典型地，所述抗體在藥物可接受的稀釋劑或者載體如無菌水溶液中給予，且所述組合物可進一步包含一或多種穩定劑、佐劑、增溶劑、緩沖液等。在治療時根據治療對象的個體需要以及考慮到如對象的年齡、體重、一般狀況及其癥狀的性質和程度以及給予的治療頻率等因素，確定精確的給予方法、成分和特定劑量。一般地，當給予所述抗體治療受累于H5AIV感染的患者時,所述抗體的給予劑量在大約0.lmg/kg至大約lmg/kg體重范圍內。典型地，當作為預防措施給予時，給予劑量降低大約一半，即在大約0.05mg/kg至大約0.5mg/kg體重范圍內。
為了進行治療，可以給予本發明的單一中和抗體或者結合蛋白，或者可以給予兩或多種抗體的組合。如果已經產生中和逃逸突變株的一或多個世代的抗體，上述本發明的這些抗體可以作為治療性抗體混合物給予。優選用作治療劑的抗體包括5C5、2D9、2F11、9CU3H11 和 4F8mAb。
提供了如下實施例以例證本發明的優選實施模式。本發明不限于所述實施例，而是與所附權利要求書的整個范圍一致。
實施例1:雜交瘤的產生
除了 H5N1/PR8之外，所有活的野生型H5N1流感病毒均得自印尼。H5N1/PR8得自美國疾病控制中心。其是非病原性重組病毒，含有在越南感染人的AIV H5N1病毒的HA和NA 基因(A/Vietnam/1203/2004)。 H5N2(A/chicken/Singapore/98)和 H7N1(A/chicken/Singapore/94)得自新加坡農糧獸醫局(AVA)。這些病毒原種用于感染9天和11天齡的含胚雞卵(Chew’ s Poultry Farm,新加坡)， 并使其復制兩個世代。然后,吸取尿囊液并使用凝血試驗(HA)確定病毒效價。失活的H5N1 (A/goose/Guangdong/97)用于RNA提取，以通過 RT-PCR 擴增 HAl 基因。將 Madin Darby 腎細胞(MDCK, ATCC CCL34)在具有 10%FBS 的DMEM培養基中在37°C在具有5%C02條件下生長。
通過對含有病毒的尿囊液在10，OOOrpm離心30分鐘除去碎片，隨后在40，OOOrpm對上清超離心3小時，從而對病毒進行純化。將病毒沉淀懸浮于PBS中。
使用蛋白質A 親和性層析柱(Sigma Aldrich; St.Louis, MO, USA)和itnmiinopure IgM 純化試劑盒(Pierce Biotechnology; Rockford, IL, USA),根據廠商指導從澄清液中純化單克隆抗體。使用ND-1000分光光度計(NanoDropTechnologies; Wilmington, DE, USA)測量抗體濃度。
使用體積為0.2ml的失活的禽流感病毒H5N2 (A/chicken/Singapore/98)或者H7N1 (A/chicken/Singapore/94)以及油性佐劑Montanide ISA563 (Seppic,法國)對BALB/c小鼠進行免疫接種。在第0、14、28和42天通過腹膜內注射給予。收集來自經免疫的小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞(SP2/0)，并且如De St.Groth and Scheidigger所述融合產生雜交瘤(16)。在用次黃嘌呤-氨喋呤-胸苷(HAT)培養基選擇之后，通過免疫熒光測定(IFA)檢測在14天后示出明顯生長的雜交瘤的培養基中抗H5N1/PR8-感染的MDCK細胞的特異性抗體的存在情況。通過限制性稀釋克隆選擇的雜交瘤，再次鑒別，第二次克隆，以及通過IFA再次檢測。一旦確定，則將該雜交瘤在組織培養中增殖，并且在液氮中冷凍以進一步使用。
從中獲得本發明的每種特異性單克隆抗體的雜交瘤是根據這些一般程序制成的。
實施例2:通過IFA篩選mAb
使用免疫熒光測定檢測抗體與抗原靶之間的相互作用。將已經過夜感染流感病毒(H5N2 (A/chicken/Singapore/98)或者 H7N1 (A/chicken/Singapore/94)的 MDCK 細胞在 96孔平板中用PBS-T (在PBS中0.05%Tween-20，pH 7.4)漂洗。通過將細胞在預冷的100%乙醇中保溫10分鐘進行固定。將該細胞在PBS-T中洗滌3次，然后在1%BSA、PBS-T中保溫30分鐘以阻斷與抗體的非特異性結合。然后將其與100 μ L雜交瘤培養液在96孔平板中在室溫保溫2小時或者在4°C保溫過夜。將細胞用PBS-T洗滌并與1:100稀釋度的二抗-熒光標記的山羊/兔抗小鼠抗體(DakoCytomation, USA)-在1%BSA、PBS-T中在室溫保溫60分鐘。將該平板孔用PBS-T洗滌。棄去PBS-T并加入在PBS中的50%甘油。在顯微鏡下用紫外光檢測突光信號。
未感染的MDCK細胞用作陰性對照。來自用失活的H5N1病毒免疫接種的小鼠的血清用作陽性抗體對照。通過將與各個雜交瘤上清保溫的MDCK細胞與對照組進行對比，選擇產生陽性染色的雜交瘤上清，用于通過限制稀釋進行克隆。通過這種方法獲得穩定產生mAb的雜交瘤。
發現稱作mAb 5A5、5C5、2D9、4F8、1C1、2F11和3B6的抗體結合來自印尼所有25個分離株的H5N1血凝素，以及結合H5N1/PR8和H5N2。MAb 3H11結合來自幾乎所有25個印尼分離株的血凝素，但是不結合H5N1/PR8和H5N2。發現mAb 6C6、3D4和8H12結合來自所有印尼H5N1分離株的神經氨酸酶，以及H5N1/PR8和H7N1。mAb 9C1已經示出結合特異性H5N1印尼株，因為這個抗體從特定毒株的逃逸突變株中產生，其特異性結合在H5的第205位氨基酸是非賴氨酸的AIV毒株進化枝I毒株。 QClmAb的這個獨特性質使得其可以與其它205-賴氨酸特異性mAb組合用于治療而無需考慮病毒逃脫問題(evasion)。
與本發明的mAb反應的AIV毒株在下文表I中列出。
代表性IFA圖像在圖1中示出。
表I
權利要求
1.特異性結合H5亞型禽流感病毒血凝素包膜糖蛋白的構象表位的抗體，其基本上具有由雜交瘤3H11產生的單克隆抗體3H11的免疫學結合特性，所述雜交瘤以保藏號PTA-9374保藏在美國典型培養物保藏中心，其中所述免疫學結合特性包括結合由單克隆抗體3H11結合的表位。
2.權利要求1的抗體，其是單克隆抗體、單鏈抗體、抗體片段、嵌合抗體或者人源化抗體。
3.權利要求1的抗體，其是單克隆抗體。
4.由雜交瘤3H11產生的單克隆抗體3H11，所述雜交瘤保藏在美國典型培養物保藏中心，保藏號為PTA-9374。
5.權利要求1、2或3的抗體或權利要求4的單克隆抗體在制備用于檢測生物學樣品中H5亞型禽流感病毒的試劑盒中的用途。
6.檢測生物學樣品中H5亞型禽流感病毒的試劑盒，其包含權利要求1、2或3的抗體或者權利要求4的單克隆抗體，所述試劑盒還具有檢測所述抗體與所述包膜糖蛋白結合的至少一種試劑。
7.權利要求6的試劑盒，其還包含特異性結合H5亞型禽流感病毒的包膜糖蛋白的結合蛋白，其中所述抗體或單克隆抗體是捕獲抗體，所述結合蛋白是含有可檢測元件或者與可檢測元件綴合的檢測結合蛋白。
8.權利要求7的試劑盒，其包含所述單克隆抗體。
9.權利要求7的試劑盒，其中所述結合蛋白是單克隆抗體。
10.權利要求8的試劑盒，其中所述結合蛋白是單克隆抗體。
11.權利要求7的試劑盒，其中所述抗體或單克隆抗體固定化于固體表面上。
12.權利要求7的試劑盒，其中所述結合蛋白含有放射性原子，與熒光分子綴合，或者與酶綴合。
13.權利要求1、2或3的抗體或者權利要求4的單克隆抗體在制備用于治療感染H5亞型禽流感病毒的對象的藥物中的用途。
14.禽流感病毒株A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)的中和逃逸突變株，其包含位于由單克隆抗體3H11識別的所述毒株HA序列的表位內的突變，由此所述突變病毒不能被所述抗體中和。
15.權利要求14的中和逃逸突變株，其中所述突變在第155位氨基酸。
全文摘要
本發明提供了特異性結合禽流感病毒(AIV)H5亞型的包膜糖蛋白或者N1亞型的神經氨酸酶糖蛋白的單克隆抗體及相關的結合蛋白。所述單克隆抗體及相關的結合蛋白可用于檢測AIV的H5和N1亞型，包括H5N1亞型，本發明提供了危險病毒感染的診斷、監視和治療方法。
文檔編號C12R1/91GK103214570SQ20121050681
公開日2013年7月24日 申請日期2008年9月12日 優先權日2007年9月13日
發明者錢紅亮, F·和, H-S·康 申請人:淡馬錫生命科學研究院有限公司