專利名稱：一種高純度甘油三酯型pufa的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種高純度甘油三酯型PUFA的制備方法。
背景技術：
多不飽和脂肪酸(PUFA) —般是指含有兩個或兩個以上雙鍵且碳鏈長度為18 22個碳原子的直鏈脂肪酸。重要的PUFA包括二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(DPA)、花生四烯酸(AA)、十八碳四烯酸(SDA)、α -亞麻酸(ALA)、Y -亞麻酸(GLA)。PUFA因具有獨特的生物活性，已經進入生物制藥和營養保健品領域。這些PUFA多來源于海產魚油和植物，在過去二十年中人們越來越多地意識到PUFA的缺乏與某些疾病相關，除了其潛在的制藥應用以外，PUFA在食物源中的存在和公眾 對健康食品的重視，而使這些化合物引起消費者的廣泛關注。PUFA產品按活性成分不同的存在形式可以分為非甘油酯型(主要是乙酯型和游離脂肪酸型)和甘油酯型兩種。研究表明PUFA乙酯型不是人體吸收PUFA的有效形式，PUFA乙酯型在人體中消化和吸收比較困難，而且可能存在安全隱患；游離型PUFA雖然易于消化和吸收，但是容易氧化，而且有明顯的脂肪酸味，口感差，直接作為食用難以被人們接受。甘油三酯型PUFA性質穩定，易被人體消化吸收，而且是PUFA的天然存在形式，因此甘油三酯型PUFA是保健品和藥品的最佳產品形式。本課題組的研究表明，現有的PUFA甘油酯產品的合成方法中存在嚴重的缺陷；因為酶反應或者化學反應均存在反應平衡點，使得PUFA甘油酯產品中含有大量的甘油二酯和單甘油酯，而且PUFA的甘油二酯和單甘油酯與甘油三酯很難通過現有方法進行有效分離，導致產品中PUFA甘油三酯的含量不高，這是我們所不期望的。專利CN102277237A提供了一種高純度甘油酯型魚油的制備方法，該方法利用氮氣保護在180°C以上以鋅粉為催化劑催化魚油脂肪酸與甘油酯化反應合成甘油酯，所得甘油酯中的甘油三酯含量可以達到60%以上，其他的為甘油二酯和甘油單酯。專利EP0558112提供了一種快速去除油脂中DAG的方法，在反應體系中控制甘油和水分的含量，并且通過高速剪切攪拌的方式使得液滴的直徑均小于ΙΟΟμπι，可以將反應時間縮短到5 30min。盡管該方法改善了酶法水解偏甘油酯的反應速度，但由于反應體系中需要添加相對偏甘油酯質量100%，相對于油脂混合物質量8%的甘油，這就為后續的分離工藝增加了負擔，而且由于大量甘油的存在，MAG難以有效去除。

發明內容
針對現有合成方法得到的PUFA甘油酯產品中甘油三酯純度不高的缺點，本發明的目的是提供一種高純度甘油三酯型PUFA的制備方法。在本發明中，通過偏甘油酯脂肪酶選擇性地將PUFA甘油酯中的DAG和MAG轉化成非甘油酯成分，產品經分離回收后得到的甘油三酯型PUFA產品不僅保持了原有PUFA組成，而且甘油三酯的含量最高可以達到95%以上。本發明為實現上述目的，通過以下技術方案實現
一種高純度甘油三酯型PUFA的制備方法，包括如下步驟(I)以脂肪酶NOVOZym435為催化劑，PUFA的酰基供體與甘油進行反應，然后除去催化劑和剩余的甘油，得到甘油三酯型PUFA和偏甘油酯型PUFA的混合物；(2)再經偏甘油酯脂肪酶Lipase SMGl在不高于5°C時催化混合物中的偏甘油酯型PUFA與羥基供體進行水解或醇解反應；(3)分離反應產物，回收油相，最后對油相進行純化，獲得高純度的甘油三酯型PUFA0優選地，步驟(2)所述水解或醇解反應的溫度為(T5°C。優選地，所述羥基供體為水或低碳鏈的一元醇。
優選地，步驟(I)所述酰基供體為富含PUFA的脂肪酸或脂肪酸短鏈醇酯。所述的選擇性地催化PUFA偏甘油酯轉化成非甘油酯型PUFA所使用的偏甘油酯脂肪酶Lipase SMGl可以催化單甘油酯和甘油二酯與羥基供體發生反應，不能催化甘油三酯反應。分離過程可以是分子蒸餾、溶劑萃取、堿中和、也可以是一種以上上述分離方法的聯
口 ο本課題組研究發現，利用脂肪酶的選擇性可以將PUFA甘油酯產品中的甘油二酯和甘油單酯轉化成易分離的非甘油酯型PUFA，經過分離可以提高甘油三酯的純度。但是由于PUFA與水等極性物質在一起暴露在空氣中長時間攪拌時，非常容易氧化；在真空下反應可以隔離空氣避免氧化，但由于水等極性物質的沸點較低，使得反應不能在真空下進行。避免PUFA氧化的另一個方法是降低反應溫度，大量研究表明，溫度是促進PUFA氧化的關鍵因素，降低反應溫度可以有效避免反應過程中PUFA的氧化。但是偏甘油酯脂肪酶需要在一定的溫度范圍內反應才能達到理想的催化效果，而且其催化特異性受溫度的影響非常顯著。如有研究表明，Lipase G在5°C時只能合成單甘油酯，不能催化脂肪酸合成甘油二酯。本發明研究發現，相對于其他脂肪酶Lipase SMGl在低溫下可以更有效地催化甘油二酯和單甘油酯與其他底物進行水解或酯交換反應。將偏甘油酯脂肪酶Lipase SMGl應用于催化PUFA偏甘油酯與羥基供體在5°C以下進行反應時，可以將單甘油酯和甘油二酯完全地轉化為非甘油酯形式，同時避免PUFA氧化。與現有技術相比，本發明的有益效果在于(I)本發明首先合成PUFA甘油酯混合物，其中甘油三酯的含量在60%以上；然后利用偏甘油酯脂肪酶的選擇性將甘油二酯和單甘油酯轉化成非甘油酯形式，實現了高純度甘油三酯型PUFA產品的酶法合成。(2)用本發明方法制造的甘油酯三酯型PUFA產品中甘油三酯的含量在95 100%之間，與天然來源的PUFA甘油酯形式是一致的。(3)本方法由于使用了偏甘油酯脂肪酶在較低的溫度下選擇性地去除PUFA甘油酯中非甘油三酯組分，避免PUFA產品的氧化，具有更好的經濟性和環保性。
具體實施例方式以下通過實施例更詳細地介紹本發明的實施。在所述實施例中，所有百分比均以質量計。實施例1
在反應容器中加入甘油100g，PUFA濃縮物IOOOg (來自金槍魚油，PUFA組成為ALA1. 6%, AA 9. 8%, EPA 7. 8%, DPA 16. 4%, DHA 50. 8%)，IOg 脂肪酶 Novozym435，20g 分子篩(除去酯化反應生成的水分)，在50°C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進行酯化反應。待反應結束后，將反應混合物離心或過濾分離Novozym435,離心去除未反應的甘油，回收酯化反應產物。經液相色譜分析酯化產物中甘油三酯含量為69. 7%,甘油二酯含量為
11.2% ;甘油單酯含量為4. 7% ;剩余的脂肪酸為14. 4%。經檢測，油相的過氧化值為2.1meq/Kgo在酯化產物中添加IOOg水，IOg偏甘油酯脂肪酶Lipase SMGl (Wang ff-f, Li T1QinX-1j Ning Ζ-χ, Yang B, Wang Y-h. Production of lipase SMGl and its applicationin synthesizing diacylglyecrol[J]. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic 2012:77:87-91 )，在2°C的恒溫磁力攪拌器中以200印111的攪拌速度進行水解反應。待反應結束后，將反應混合物離心去除水相，回收水解反應產物中的油相。經檢測，油相的過氧化值為2. 3meq/Kg。在真空度為IPa，蒸發溫度為160°C的條件下用分子蒸餾分離除去水解產物中的游離脂肪酸，即得到PUFA甘油酯。經液相色譜分析PUFA甘油酯中甘油三酯含量為99. 3%，甘油二酯含量為0. 69%，單甘酯和脂肪酸未檢出。經氣相色譜分析甘油三酯的脂肪酸組成為 ALA1. 7%, AA 9. 6%, EPA 7. 9%, DPA 16. 1%，DHA 51. 2%。實施例2在反應容器中加入甘油100g，PUFA濃縮物IOOOg(來自金槍魚油，PUFA組成為ALA
1.6%, AA 9. 8%, EPA 7. 8%, DPA 16. 4%, DHA 50. 8%)，IOg 脂肪酶 Novozym435，20g 分子篩除去反應生成的水分，在50°C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進行酯化反應。待反應結束后，將反應混合物離心或過濾分離Novozym435,離心去除未反應的甘油，回收酯化反應產物。經液相色譜分析酯化產物中甘油三酯含量為69. 7%，甘油二酯含量為11. 2% ;甘油單酯含量為4. 7% ;剩余的脂肪酸為14. 4%。經檢測，油相的過氧化值為2. lmeq/Kg0在酯化產物中添加IOOg水，IOg偏甘油酯脂肪酶Lipase SMG1，在2°C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進行水解反應。待反應結束后，將反應混合物離心去除水相，回收水解反應產物中的油相。經檢測，油相的過氧化值為2. 2meq/Kg。水解產物用10%的NaOH溶液堿煉脫酸至酸價為0. 2mgK0H/g，50°C保溫沉降除去產生的皂，回收中性油脂；經液相色譜分析PUFA甘油酯中甘油三酯含量為99. 4%,甘油二酯含量為0. 6%,單甘酯和脂肪酸未檢出。經氣相色譜分析甘油三酯的脂肪酸組成為ALA 1.8%，AA 9.7%，EPA 7. 7%, DPA 16. 3%, DHA 50.8%。實施例3在反應容器中加入甘油100g，CLA乙酯濃縮物900g (CLA含量為80. 3%)，IOg脂肪酶Novozym435,在IOOPa的真空度下,50°C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進行酯化反應。待反應結束后，將反應混合物離心或過濾分離Novozym435,離心去除未反應的甘油，回收酯化反應產物。經液相色譜分析酯化產物中甘油三酯含量為70. 5% ;甘油二酯含量為11. 5% ;甘油單酯含量為4. 4% ;剩余的脂肪酸為13. 6%。經檢測，油相的過氧化值為
2.0meq/Kg。在酯化產物中添加IOOg水，IOg偏甘油酯脂肪酶Lipase SMG1，在2°C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進行水解反應。待反應結束后，將反應混合物離心去除水相，回收水解反應產物中的油相。經檢測，油相的過氧化值為2. lmeq/Kg。水解產物用10%的NaOH溶液堿煉脫酸至酸價為0. 2mgK0H/g，50°C保溫沉降除去產生的皂，回收中性油脂；經液相色譜分析CLA甘油酯中甘油三酯含量為99. 3%，甘油二酯含量為0. 7%，單甘酯和脂肪酸乙酯均未檢出。經氣相色譜分析甘油三酯脂肪酸組成中CLA的含量為80. 3%。實施例4在反應容器中加入甘油100g，PUFA濃縮物IOOOg(來自金槍魚油，PUFA組成為ALA1. 6%, AA 9. 8%, EPA 7. 8%, DPA 16. 4%, DHA 50. 8%)，IOg 脂肪酶 Novozym435，20g 分子篩除去反應生成的水分，在50°C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進行酯化反應。待反應結束后，將反應混合物離心或過濾分離Novozym435,離心去除未反應的甘油，回收酯化反應產物。經液相色譜分析酯化產物中甘油三酯含量為69. 7%，甘油二酯含量為11. 2% ;甘油單酯含量為4. 7% ;剩余的脂肪酸為14. 4%。經檢測，油相的過氧化值為2. lmeq/Kg。在酯化產物中添加IOOg水，IOg偏甘油酯脂肪酶Lipase SMG1,在I °C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進行水解反應。待反應結束后，將反應混合物離心去除水相，回收水解反應產物中的油相。經檢測，油相的過氧化值為2. 3meq/Kg。水解產物用10%的NaOH溶液堿煉脫酸至酸價為O. 2mgK0H/g，50°C保溫沉降除去產生的皂，回收中性油脂；經液相色譜分析PUFA甘油酯中甘油三酯含量為99. 7%，甘油二酯含量為O. 28%，單甘酯和脂肪酸未檢出。經氣相色譜分析甘油三酯的脂肪酸組成為ALA 1.7%，AA 9.8%，EPA 7. 9%，DPA 16. 2%, DHA 50.6%。 實施例5在反應容器中加入甘油100g，PUFA濃縮物IOOOg(來自金槍魚油，PUFA組成為ALA1.6%, AA 9. 8%, EPA 7. 8%, DPA 16.4%, DHA 50. 8%)，IOg 脂肪酶 Novozym435，20g 分子篩除去反應生成的水分，在50°C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進行酯化反應。待反應結束后，將反應混合物離心或過濾分離Novozym435,離心去除未反應的甘油，回收酯化反應產物。經液相色譜分析酯化產物中甘油三酯含量為69. 7%，甘油二酯含量為11. 2% ;甘油單酯含量為4. 7% ;剩余的脂肪酸為14. 4%。經檢測，油相的過氧化值為2. lmeq/Kg ο在酯化產物中添加IOOg乙醇，IOg偏甘油酯脂肪酶Lipase SMGI, Ig蒸餾水，在2°C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進行醇解反應。待反應結束后，將反應混合物離心去除脂肪酶，回收水解反應產物中的油相經檢測，油相的過氧化值為1.9meq/Kg。。在真空度為IPa，蒸發溫度為160°C的條件下用分子蒸餾分離除去醇解產物中的非甘油酯組分，即得到PUFA甘油酯。經液相色譜分析PUFA甘油酯中甘油三酯含量為99. 5%，甘油二酯含量為O. 47%，單甘酯和脂肪酸未檢出。經氣相色譜分析甘油三酯的脂肪酸組成為ALA 1.8%，AA 9.8%，EPA
7.6%, DPA 16. 3%, DHA 50. 7%。對比實施例1在反應容器中加入甘油100g，PUFA濃縮物IOOOg(來自金槍魚油，PUFA組成為ALA1.6%, AA 9. 8%, EPA 7. 8%, DPA 16. 4%, DHA 50. 8%)，IOg 脂肪酶 Novozym435，20g 分子篩除去反應生成的水分，在50°C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進行酯化反應。待反應結束后，將反應混合物離心或過濾分離Novozym435,離心去除未反應的甘油，回收酯化反應產物。經液相色譜分析酯化產物中甘油三酯含量為69. 7%，甘油二酯含量為11. 2% ;甘油單酯含量為4. 7% ;剩余的脂肪酸為14. 4%。經檢測，油相的過氧化值為2. lmeq/Kg。在酯化產物中添加IOOg水，IOg偏甘油酯脂肪酶Lipase SMG1，在30°C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進行水解反應。待反應結束后，將反應混合物離心去除水相，回收水解反應產物中的油相。經檢測，油相的過氧化值為9. 5meq/Kg。水解產物用10%的NaOH溶液堿煉脫酸至酸價為O. 2mgK0H/g，50°C保溫沉降除去產生的皂，回收中性油脂；經液相色譜分析PUFA甘油酯中甘油三酯含量為99. 7%，甘油二酯含量為O. 28%，單甘酯和脂肪酸未檢出。經氣相色譜分析甘油三酯的脂肪酸組成 為ALA 1.7%，AA 9.8%，EPA 7. 9%，DPA 16. 2%，DHA50. 6%。
權利要求
1.一種高純度甘油三酯型PUFA的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(O以脂肪酶NOVOZym435為催化劑，PUFA的酰基供體與甘油進行反應，然后除去催化劑和剩余的甘油，得到甘油三酯型PUFA和偏甘油酯型PUFA的混合物；(2)再經偏甘油酯脂肪酶LipaseSMGl在不高于5°C時催化混合物中的偏甘油酯型 PUFA與羥基供體進行水解或醇解反應；(3)分離反應產物，回收油相,最后對油相進行純化,獲得高純度的甘油三酯型PUFA。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述水解或醇解反應的溫度為 0^5 0C ο
3.根據權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述羥基供體為水或低碳鏈的一元醇。
4.根據權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述酰基供體為富含 PUFA的脂肪酸或脂肪酸短鏈醇酯。
全文摘要
本發明公開了一種高純度甘油三酯型PUFA的制備方法，包括如下步驟(1)以脂肪酶Novozym435為催化劑，PUFA的酰基供體與甘油進行反應，然后除去催化劑和剩余的甘油，得到甘油三酯型PUFA和偏甘油酯型PUFA的混合物；(2)再經偏甘油酯脂肪酶Lipase SMG1在不高于5℃時催化混合物中的偏甘油酯型PUFA與羥基供體進行水解或醇解反應；(3)分離反應產物，回收油相，最后對油相進行純化，獲得高純度的甘油三酯型PUFA。本方法由于使用了偏甘油酯脂肪酶在較低的溫度下選擇性地去除PUFA甘油酯中非甘油三酯組分，可以獲得過氧化值低，甘油三酯含量在95~100%的PUFA甘油酯產品，具有更好的經濟性和環保性。
文檔編號C12P7/64GK102994580SQ20121050684
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月30日 優先權日2012年11月30日
發明者王永華, 王衛飛, 楊博, 藍東明, 李志剛 申請人:華南理工大學