專利名稱：大胚齡神經(jīng)干細胞的高-低密度貼壁細胞培養(yǎng)方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領域的一種胚胎神經(jīng)干細胞培養(yǎng)方法，特別涉及一種大胚齡神經(jīng)干細胞的高-低密度貼壁細胞培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)是神經(jīng)科學領域的重大突破，為神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)組織移植等研究領域開辟了廣闊前景。神經(jīng)干細胞是一種具有自我更新及廣泛分化潛能的細胞，它處于分化的非終末狀態(tài)，可通過對稱或不對稱分裂出新的干細胞或分化潛能逐漸變小的子細胞，最終產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)的三種主要細胞，即神經(jīng)元細胞、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。一般認為神經(jīng)干細胞主要存在于哺乳動物胎腦的紋狀體、小腦半球、腦室區(qū)等，成年哺乳動物腦的側(cè)腦室壁和海馬等區(qū)。有關(guān)哺乳動物胚胎階段和成年動物在特定腦區(qū)存在神經(jīng) 干細胞已不斷得到證實，但大胚齡神經(jīng)干細胞的分離和培養(yǎng)較為困難。傳統(tǒng)的高密度懸浮細胞培養(yǎng)法克隆球形成和生長緩慢，存在高密度的抑制作用；低密度難以培養(yǎng)成功則可能是與細胞的密度依賴性和神經(jīng)干細胞的絕對數(shù)量過少有關(guān)；中等密度懸浮細胞培養(yǎng)2周后可見克隆球形成，但有其它細胞吸附現(xiàn)象。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決胚胎神經(jīng)干細胞較難培養(yǎng)的問題，本發(fā)明采用無血清培養(yǎng)和單細胞克隆技術(shù)13周人胚大腦皮層中分離和培養(yǎng)出具有自我更新和多分化潛能的神經(jīng)干細胞，采用先高密度而后密度逐漸遞減的高-低密度貼壁細胞培養(yǎng)法，在3周后可形成大量神經(jīng)干細胞，該細胞具有連續(xù)克隆能力，可傳達培養(yǎng)，表達神經(jīng)巢蛋白抗原；分化后的細胞表達神經(jīng)元細胞、膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的特異性抗原。具體的，本發(fā)明的大胚齡神經(jīng)干細胞的高-低密度貼壁細胞培養(yǎng)方法包括以下步驟皮層神經(jīng)干細胞的分離和培養(yǎng)，高-低密度貼壁細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，神經(jīng)干細胞的傳代培養(yǎng)，神經(jīng)干細胞的單細胞克隆，神經(jīng)干細胞的分化培養(yǎng)以及免疫熒光法檢測。其中，所述皮層神經(jīng)干細胞的分離和培養(yǎng)步驟包括取7周自然流產(chǎn)和13周水囊引產(chǎn)的人胚胎，無菌條件下分離出胚胎前腦和大腦皮層組織，制成單細胞懸液，加入無血清培養(yǎng)基中，臺盼藍染色計數(shù)活細胞，調(diào)整細胞濃度為1父107/!111，分別種植于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，371、體積濃度為5% CO2條件下靜置進行貼壁細胞培養(yǎng)；所述高-低密度貼壁細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的步驟包括應用高密度貼壁細胞培養(yǎng)5天后后吸出部分細胞改為低密度培養(yǎng)，培養(yǎng)2周時經(jīng)多次換液去除懸浮細胞繼續(xù)培養(yǎng)至4周時形成大量大小不等的克隆球；所述的神經(jīng)干細胞的傳代培養(yǎng)步驟包括待原代細胞培養(yǎng)出現(xiàn)大量懸浮克隆球后進行傳代培養(yǎng)，在嚴格無菌條件下操作，在倒置顯微鏡下用自制玻璃微針將其中的大于200 u m的大克隆球切成數(shù)塊，繼續(xù)培養(yǎng)，7 10天傳代I次，方法同上述的高-低密度貼壁細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的步驟；所述的神經(jīng)干細胞的單細胞克隆步驟包括在貼壁細胞培養(yǎng)中，當細胞密度降至IX IO4AiI時，挑選散在出現(xiàn)、明顯增大、具有強折光性的細胞，在培養(yǎng)瓶底面用記號筆分別標記，動態(tài)定點觀察并照相記錄；當單個細胞形成克隆球并逐漸增大即將懸浮脫離時，用玻璃微管逐個吸出克隆球進行分化試驗；將原代細胞制成單細胞懸液，稀釋至40個/ml，于96孔培養(yǎng)板中滴加稀釋的細胞懸液，每孔100 yl，選取僅有I個細胞的培養(yǎng)孔作標記；所述神經(jīng)干細胞的分化培養(yǎng)步驟包括將以上獲得的、來自單細胞的克隆球經(jīng)胰酶消化后，種植于預先用多聚賴氨酸包被的小培養(yǎng)皿中，用DMEM/F12+5% Fcs+EGF+bFGF培養(yǎng)基和經(jīng)過濾滅菌后的新鮮成人腦脊液中進行分化培養(yǎng)；所述免疫熒光法檢測步驟包括將上述獲得的克隆球種入包被的小培養(yǎng)皿中，用無血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12小時后行熒光檢測；經(jīng)分化培養(yǎng)后的細胞分別于2、7、14和21天行熒光檢測。
優(yōu)選的，所述皮層神經(jīng)干細胞的分離和培養(yǎng)步驟中的血清培養(yǎng)基為含B27(l 50)和 EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)的 DMEM/F12(1 I)無血清培養(yǎng)基。再優(yōu)選的，所述的高-低密度貼壁細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的步驟中，所述高密度貼壁細胞培養(yǎng)的細胞密度為I X 107/ml，所述低密度貼壁細胞培養(yǎng)的細胞密度為lX106/ml。


通過下面結(jié)合附圖的詳細描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點將變得顯而易見。其中圖1所示為本發(fā)明的大胚齡神經(jīng)干細胞的高-低密度貼壁細胞培養(yǎng)方法的步驟流程圖。
具體實施例方式如圖1所示的本發(fā)明的大胚齡神經(jīng)干細胞的高-低密度貼壁細胞培養(yǎng)方法的步驟流程圖，所述方法具體包括以下步驟S1、皮層神經(jīng)干細胞的分離和培養(yǎng)取7周自然流產(chǎn)和13周水囊引產(chǎn)的人胚胎，無菌條件下分離出胚胎前腦和大腦皮層組織，制成單細胞懸液，加入含B27(l 50)和EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)的DMEM/F12(l I)無血清培養(yǎng)基，臺盼藍染色計數(shù)活細胞，調(diào)整細胞濃度為I X 107/ml，分別種植于多聚賴氨酸包被的25cm2培養(yǎng)瓶(8ml細胞懸液/瓶)中，37°C、體積濃度為5% CO2條件下靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)方法為貼壁細胞培養(yǎng)法。S2、高-低密度貼壁細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)神經(jīng)干細胞首先應用高密度貼壁細胞培養(yǎng)I XlOVml，原代細胞聚集成團塊狀，團塊中可形成少量克隆球，但克隆球生長緩慢。培養(yǎng)5d后后吸出部分細胞改為IX 106/ml培養(yǎng)，克隆球形成和生長明顯增快。首次換液發(fā)現(xiàn)，每高倍鏡視野(倒置顯微鏡X 100倍)下大約有200個細胞貼壁，其中處于有絲分裂期的極強折光性大細胞平均大約有5個，少數(shù)散在的貼壁細胞出現(xiàn)分化現(xiàn)象；2周時極強折光性大細胞數(shù)量增多，至每高倍視野下大約有20個，多數(shù)貼壁未分裂的原代細胞和分化細胞開始脫落死亡，此時經(jīng)多次換液去除懸浮細胞，細胞密度由IXlOVml降至IXlOVml左右，無細胞聚集現(xiàn)象；3周時已經(jīng)有極強折光性大細胞開始形成緊密小克隆球(大約5 20個細胞組成，直徑約40 60 ii m) ;4周時已有大量大小不等的克隆球形成，許多大克隆球(直徑大于200 ym)已脫壁懸浮生長。S3、神經(jīng)干細胞的傳代培養(yǎng)待原代細胞培養(yǎng)出現(xiàn)大量懸浮克隆球后進行傳代培養(yǎng)。采用嚴格無菌操作，在倒置顯微鏡下用自制玻璃微針將其中的大克隆球(大于200i!m)切成數(shù)塊，小克隆球(小于100 u m)不作處理，繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)克隆球生長情況，7 IOd傳代I次，方法同前。S4、神經(jīng)干細胞的單細胞克隆在貼壁細胞培養(yǎng)法中，當細胞密度降至IXlOVml時，挑選散在出現(xiàn)、明顯增大、具有強折光性的細胞，在培養(yǎng)瓶底面用記號筆分別標記，動態(tài)定點觀察并照相記錄。能清楚地 觀察從單個細胞逐漸分裂增殖形成克隆球，無其它細胞吸附聚集現(xiàn)象，克隆球用微管吸出分離后活力仍很旺盛。當單個細胞形成克隆球并逐漸增大即將懸浮脫離時，用自制玻璃微管(內(nèi)徑約250 500 ym)逐個吸出克隆球進行分化試驗。(2)有限稀釋法將原代細胞制成單細胞懸液，稀釋至40個/ml,于96孔培養(yǎng)板中滴加稀釋的細胞懸液,每孔IOOii I,選取僅有I個細胞的培養(yǎng)孔作標記，僅少數(shù)單個細胞逐漸分裂增殖形成克隆球。S5、神經(jīng)干細胞的分化培養(yǎng)將以上獲得的、來自單細胞的克隆球經(jīng)胰酶消化后，種植于預先用多聚賴氨酸包被的、直徑3. 5cm的小培養(yǎng)皿中，用DMEM/F12+5% Fcs+EGF+bFGF培養(yǎng)基和經(jīng)過濾滅菌后的新鮮成人腦脊液中進行分化培養(yǎng)。神經(jīng)干細胞在DMEM/F12+50g/L Fcs有血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，12h后即可見部分細胞貼壁并有短小突起伸出，2d后可見大部分細胞貼壁生長，形態(tài)不規(guī)則，突起不斷增粗和伸長，I周后分化成形態(tài)不一的、分散成片的多突起星狀細胞和神經(jīng)元樣細胞，突起互相交織成網(wǎng)狀。2周后部分分化細胞開始衰退。在DMEM/F12+5%Fcs+EGF+bFGF培養(yǎng)基中，一部分細胞出現(xiàn)貼壁分化現(xiàn)象，另一部分細胞則繼續(xù)分裂增殖，最后細胞可以很快貼滿整個皿底。新鮮成人腦脊液中亦出現(xiàn)很好的分化現(xiàn)象，經(jīng)適時更換腦脊液，細胞可以長期存活。S6、免疫熒光法檢測將上述獲得的克隆球種入包被的小培養(yǎng)皿中，用無血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12h后行熒光檢測。經(jīng)分化培養(yǎng)后的細胞分別于2、7、14和21d行熒光檢測。每個培養(yǎng)皿用蠟筆畫五個圈，分別用抗NestinIgG、抗NSE IgG、抗GFAPIgG、抗CNP IgG和空白對照行免疫熒光染色，二抗為FITC熒光二抗。貼壁的克隆球呈巢蛋白(Nestin)抗原陽性，同時NSE、GFAP和CNP免疫熒光染色均呈陰性。在DMEM/F12+5% Fcs+EGF+bFGF培養(yǎng)基和新鮮成人腦脊液中分化的細胞，不同時間點均檢測到NSE、GFAP和CNP陽性細胞，2周后幾乎未找到Nestin陽性細胞。13周胚胎神經(jīng)干細胞較難培養(yǎng)，可能是由于13周胎腦中神經(jīng)干細胞的數(shù)量較小胚齡胎腦減少或者其生物學特性已有某些改變的緣故。高密度懸浮細胞培養(yǎng)法克隆球形成和生長緩慢，存在高密度的抑制作用；低密度難以培養(yǎng)成功則可能是與細胞的密度依賴性和神經(jīng)干細胞的絕對數(shù)量過少有關(guān)；中等密度懸浮細胞培養(yǎng)2周后可見克隆球形成，但有其它細胞吸附現(xiàn)象。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞具有一定的貼壁能力，在形成克隆球并長大至200 ii m前，能夠保持貼壁狀態(tài)，有利于在不改變細胞培養(yǎng)環(huán)境狀態(tài)下，定點動態(tài)觀察從單個干細胞分裂增殖形成克隆球的全過程。我們采用開始高密度而后密度逐漸遞減的貼壁細胞培養(yǎng)法，在3周后可形成大量克隆球，認為在原代首次培養(yǎng)時使用高密度，神經(jīng)干細胞和其它細胞一樣有較多數(shù)量貼壁，由于前體細胞和各種終末神經(jīng)細胞在無血清培養(yǎng)基中生長不良，活力下降，出現(xiàn)脫壁懸浮和逐漸死亡。每次換液去除懸浮細胞，細胞密度逐漸下降，大約3周時，剩余的貼壁細胞大部分是活力較強的神經(jīng)干細胞，密度為I X IOVml左右，該密度可以很好地避免發(fā)生細胞聚集現(xiàn)象，且神經(jīng)干細胞仍能較好地分裂增殖，并大量形成克隆球。我們從人胚中分離出來自單細胞的克隆球經(jīng)分裂增殖多次傳代后仍然保持較強的活力，并呈巢蛋白的陽性表達，分化后細胞行免疫熒光檢測顯示均有NSE、GFAP和CNP陽性細胞，具有自我更新及多分化潛能，證明是神經(jīng)干細胞。本發(fā)明并不局限于所述的實施例，本領域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神即公開范圍內(nèi)，仍可作一些修正或改變，故本發(fā)明的權(quán)利保護范圍以權(quán)利要求書限定的范圍為 準。
權(quán)利要求
1.一種大胚齡神經(jīng)干細胞的高-低密度貼壁細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟皮層神經(jīng)干細胞的分離和培養(yǎng)，高-低密度貼壁細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，神經(jīng)干細胞的傳代培養(yǎng)，神經(jīng)干細胞的單細胞克隆，神經(jīng)干細胞的分化培養(yǎng)以及免疫熒光法檢測；其中， 所述皮層神經(jīng)干細胞的分離和培養(yǎng)步驟包括取13周自然流產(chǎn)和13周水囊引產(chǎn)的人胚胎，無菌條件下分離出胚胎前腦和大腦皮層組織，制成單細胞懸液，加入無血清培養(yǎng)基中，臺盼藍染色計數(shù)活細胞，調(diào)整細胞濃度為lX107/ml，分別種植于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，37°C、體積濃度為5% CO2條件下靜置進行貼壁細胞培養(yǎng)； 所述高-低密度貼壁細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的步驟包括應用高密度貼壁細胞培養(yǎng)5天后后吸出部分細胞改為低密度培養(yǎng)，培養(yǎng)2周時經(jīng)多次換液去除懸浮細胞繼續(xù)培養(yǎng)至4周時形成大量大小不等的克隆球； 所述的神經(jīng)干細胞的傳代培養(yǎng)步驟包括待原代細胞培養(yǎng)出現(xiàn)大量懸浮克隆球后進行傳代培養(yǎng)，無菌條件下在倒置顯微鏡下用自制玻璃微針將其中的大于200 μ m的大克隆球切成數(shù)塊，繼續(xù)培養(yǎng)，7 10天傳代I次，方法同上述的高-低密度貼壁細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的步驟； 所述的神經(jīng)干細胞的單細胞克隆步驟包括在貼壁細胞培養(yǎng)中，當細胞密度降至IXlOVml時，挑選散在出現(xiàn)、明顯增大、具有強折光性的細胞，在培養(yǎng)瓶底面用記號筆分別標記，動態(tài)定點觀察并照相記錄；當單個細胞形成克隆球并逐漸增大即將懸浮脫離時，用玻璃微管逐個吸出克隆球進行分化試驗；將原代細胞制成單細胞懸液，稀釋至40個/ml，于96孔培養(yǎng)板中滴加稀釋的細胞懸液，每孔ΙΟΟμ 1，選取僅有I個細胞的培養(yǎng)孔作標記； 所述神經(jīng)干細胞的分化培養(yǎng)步驟包括將以上獲得的、來自單細胞的克隆球經(jīng)胰酶消化后，種植于預先用多聚賴氨酸包被的小培養(yǎng)皿中，用DMEM/F12+5% Fcs+EGF+bFGF培養(yǎng)基和經(jīng)過濾滅菌后的新鮮成人腦脊液中進行分化培養(yǎng)； 所述免疫熒光法檢測步驟包括將上述獲得的克隆球種入包被的小培養(yǎng)皿中，用無血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12小時后行熒光檢測；經(jīng)分化培養(yǎng)后的細胞分別于2、7、14和21天行熒光檢測。
2.如權(quán)利要求1所述的大胚齡神經(jīng)干細胞的高-低密度貼壁細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述皮層神經(jīng)干細胞的分離和培養(yǎng)步驟中的血清培養(yǎng)基為含B27 (I 50)和EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)的 DMEM/F12(1 I)無血清培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求1所述的大胚齡神經(jīng)干細胞的高-低密度貼壁細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的高-低密度貼壁細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的步驟中，所述高密度貼壁細胞培養(yǎng)的細胞密度為I X 107/ml，所述低密度貼壁細胞培養(yǎng)的細胞密度為I X 106/ml。
全文摘要
本發(fā)明提供一種大胚齡神經(jīng)干細胞的高-低密度貼壁細胞培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟皮層神經(jīng)干細胞的分離和培養(yǎng)，高-低密度貼壁細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，神經(jīng)干細胞的傳代培養(yǎng)，神經(jīng)干細胞的單細胞克隆，神經(jīng)干細胞的分化培養(yǎng)以及免疫熒光法檢測。本發(fā)明采用無血清培養(yǎng)和單細胞克隆技術(shù)從13周人胚大腦皮層中分離和培養(yǎng)出具有自我更新和多分化潛能的神經(jīng)干細胞，采用先高密度而后密度逐漸遞減的高-低密度貼壁細胞培養(yǎng)法，形成大量神經(jīng)干細胞，該細胞具有連續(xù)克隆能力，可傳達培養(yǎng)，表達神經(jīng)巢蛋白抗原；分化后的細胞表達神經(jīng)元細胞、膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的特異性抗原，解決了胚胎神經(jīng)干細胞較難培養(yǎng)的問題。
文檔編號C12N5/0797GK103013920SQ20121050711
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者陸華 申請人:陸華