專利名稱：一株高效代謝木糖的重組酵母菌株及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株能夠發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的重組酵母菌株。
背景技術(shù)：
利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇，不僅能夠降低燃料乙醇的生產(chǎn)成本，而且在改善環(huán)境及廢物處理等方面均有很重要的作用。我國作為一個農(nóng)業(yè)大國，秸桿等農(nóng)作物廢棄物資源相當(dāng)豐富，這為發(fā)展燃料乙醇產(chǎn)業(yè)提供了得天獨(dú)厚的條件。一般用作工業(yè)生產(chǎn)乙醇的菌株為釀酒酵母，雖然天然的釀酒酵母能夠很好的利用木質(zhì)纖維素水解物中的己糖產(chǎn)生乙醇，但是卻缺乏對含量豐富的戊糖，例如木糖的代謝能力。因此構(gòu)建能夠高效利用木糖的工程菌株對降低燃料乙醇的生產(chǎn)成本具有關(guān)鍵意義。目前我國在利用代謝工程方法構(gòu)建能夠利用木糖產(chǎn)生乙醇的釀酒酵母工程菌株方面已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但是仍不能滿足生產(chǎn)的要求，主要表現(xiàn)在木糖利用緩慢、副產(chǎn)物木糖醇積累過多以及乙醇得率低等方面。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株高效代謝木糖的重組酵母菌株。本發(fā)明的第二個目的是提供上述一株高效代謝木糖的重組酵母菌株的用途。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下

—株高效代謝木糖的重組酵母菌株，分類命名釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)命名為SyBE005,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6634，其具有高效代謝木糖產(chǎn)乙醇的能力。上述菌株代謝木糖產(chǎn)乙醇的用途。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的重組酵母菌株SyBE005能夠有效的利用木糖發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。乙醇產(chǎn)率達(dá)到理論得率的64%，副產(chǎn)物木糖醇的產(chǎn)率在12%以下，能夠高效地轉(zhuǎn)化木糖為乙醇，是優(yōu)良的利用纖維素水解液的菌株。本發(fā)明的高效代謝木糖的重組酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)命名為SyBE005,已于2012年9月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號為CGMCC No. 6634。地址在北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所。


圖1為含有木糖還原酶基因編碼框、木糖醇脫氫酶基因編碼框及木酮糖激酶基因編碼框的質(zhì)粒圖譜。圖2為含有木糖醇脫氫酶基因編碼框的質(zhì)粒PRS305-XDH圖譜。
圖3是含有核糖磷酸異構(gòu)酶基因編碼框、轉(zhuǎn)酮酶基因編碼框的質(zhì)粒pRS-RKI1-TKLl 圖譜。圖4是含有戊糖磷酸差向異構(gòu)酶基因編碼框、轉(zhuǎn)醛酶基因編碼框的質(zhì)粒pAUR-RPEl-TALl 圖譜。圖5為菌株L2612PR、L2612PR-DPPP、SyBE005在含有20g/L木糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵時木糖利用情況。圖6為菌株L2612PR、L2612PR-DPPP、SyBE005在含有20g/L木糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵時乙醇產(chǎn)生情況。圖1為菌株L2612PR、L2612PR-DPPP、SyBE005在含有20g/L木糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵時木糖醇產(chǎn)生情況。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，本發(fā)明的實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但不對本發(fā)明做任何限制。實(shí)施例1重組酵母菌株SyBE005的構(gòu)建與篩選出發(fā)菌株出發(fā)菌株L2612,是美國威斯康星大學(xué)麥迪遜分校的Thomas Jeffries教授贈予，基因型是MAT alp ha, leu2, ura3, trpl。是亮氨酸、尿喃唳和色氨酸缺陷。培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)基A :合成氮源YNB 6. 7g/L,混合氨基酸粉末2g/L (具體配方參考[美]D. C.安伯格等酵母遺傳學(xué)方法試驗(yàn)指南),亮氨酸100mg/L,色氨酸100mg/L,葡萄糖20g/L。篩選培養(yǎng)基B :合成氮源YNB 6. 7g/L，混合氨基酸粉末2g/L，色氨酸100mg/L，葡萄糖20g/L0篩選培養(yǎng)基C :合成氮源YNB 6. 7g/L，混合氨基酸粉末2g/L，葡萄糖20g/L。篩選培養(yǎng)基D :合成氮源YNB 6. 7g/L,混合氨基酸粉末2g/L,短梗霉素A 0. 5mg/L,葡萄糖20g/L。馴化培養(yǎng)基合成氮源YNB 6. 7g/L，混合氨基酸粉末2g/L，木糖50g/L。固體培養(yǎng)基中，添加20g/L的瓊脂。出發(fā)重組菌株L2612PR-DPPP的構(gòu)建以菌株L2612基因組為模板，克隆出啟動子TDHlp、TDH3p、PGKlp，木酮糖激酶基因XKSl (含自身終止子)，戊糖磷酸差向異構(gòu)酶基因RPE1，核糖磷酸異構(gòu)酶基因RKI1，轉(zhuǎn)酮酶基因TKLl，轉(zhuǎn)醛酶基因TALl，終止子序列PGKlt。通過融合PCR技術(shù)將合成的木糖還原酶基因XR、木糖醇脫氫酶基因XDH分別與啟動子PGK1、終止子PGKlt連接，將啟動子PGKl與木酮糖激酶基因XKSl連接，然后將三個基因表達(dá)框順次連接到載體Hplac211(購于ATCC)上，形成表達(dá)質(zhì)粒YIplac211-XRXDHXK(圖1)。木糖還原酶基因XR序列用SEQ ID NO 1所示。木糖醇脫氫酶基因XDH序列用SEQ ID NO 2所示。將以上構(gòu)建的木糖醇脫氫酶基因表達(dá)框從質(zhì)粒YIplac211_XRXDHXK上酶切出來，重新克隆到載體PRS305 (購于ATCC)上，形成質(zhì)粒pRS305_XDH(圖2)。利用融合PCR技術(shù)構(gòu)建戊糖磷酸差向異構(gòu)酶基因表達(dá)盒TDHlp-RPEl-PGKlt，轉(zhuǎn)醛酶基因表達(dá)盒PGKlp-TALl-PGKlt，核糖磷酸異構(gòu)酶基因表達(dá)盒PGKlp-RKIl-PGKlt，轉(zhuǎn)酮酶基因表達(dá)盒 TDH3p-TKLl-PGKlt。將基因表達(dá)盒 PGKlp-RKIl-PGKlt 和 TDH3p_TKLl_PGKlt連接到載體PRS304 (購于ATCC)上，形成載體pRS-RKIl-TKLl (圖3)。將基因表達(dá)盒TDHlp-RPEl-PGKlt和基因表達(dá)盒PGKlp-TALl-PGKlt依次連接到載體pAURlOl (大連寶生物公司購買)，構(gòu)建載體pAUR-RPEl-TALl (圖4)。用限制性內(nèi)切酶Apa I線性化YIplac211_XRXDHXK，通過醋酸鋰法轉(zhuǎn)化菌株L2612，在篩選培養(yǎng)基A上篩選獲得重組菌株L2612PR。并在此重組菌株的基礎(chǔ)上，用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化質(zhì)粒PRS305-XDH，在篩選培養(yǎng)基B上獲得重組菌株。用限制性內(nèi)切酶EcoRI線性化質(zhì)粒pRS-RKIl-TKLl，用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化上一步得到的重組菌株，在篩選培養(yǎng)基C上表達(dá)獲得重組菌株。并在此菌株的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化用StuI線性化的質(zhì)粒pAUR-RPEl-TALl，在篩選培養(yǎng)基D上得到出發(fā)重組菌株L2612PR-DPPP。突變菌株SyBE005的構(gòu)建和篩選將菌株L2612PR-DPPP以初始OD6tltl=O. 2接到含50mL馴化培養(yǎng)基的250mL中，30°C、200轉(zhuǎn)/分有氧培養(yǎng)3天。測量培養(yǎng)物的0D_，并以初始0D_=0. 2轉(zhuǎn)接到新鮮馴化培養(yǎng)基中，重復(fù)培養(yǎng)10次后菌液的0D_保持不變，繼續(xù)重復(fù)培養(yǎng)10次。取少量的菌液，稀釋后在馴化培養(yǎng)基的固體平板上涂布培養(yǎng)，獲得單菌落菌株。從其中選取菌落尺寸最大的20個菌落，分別接種到含有2mL液體篩選培養(yǎng)基C的15mL試管中，在30°C、200轉(zhuǎn)/分的條件下培養(yǎng)2天。取IOOii L菌液轉(zhuǎn)接到3mL新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基A中，在30°C、200轉(zhuǎn)/分的條件下無氧培養(yǎng)。用帶有排氣針的橡膠塞密封試管口。無氧培養(yǎng)24小時后，測量菌液的OD6tltl、殘余木糖含量和代謝產(chǎn)物乙醇、甘油、木糖醇含量。從20株單菌落中獲得了一株殘余木糖最少的菌株SyBE005。分析方法
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以722型分光光度計在600nm處測定的菌體吸光值(0D_)表征菌體濃度。木糖、乙醇、木糖醇、甘油的濃度用高效液相色譜(Watersl515)測定。色譜柱為AminexHPX-87H，柱溫65°C ;檢測器=Waters示差檢測器2421，檢測器溫度是40°C。流動相為5mM硫酸溶液，流速0. 6mL/min,進(jìn)樣量為10 u L。實(shí)施例2菌株L2612PR、L2612PR-DPPP與SyBE005的木糖發(fā)酵比較1.試驗(yàn)材料菌株 L2612PR、L2612PR_DPPP、SyBE0032.試驗(yàn)方法種子培養(yǎng)基1:合成氮源YNB 6. 7g/L，混合氨基酸粉末2g/L，葡萄糖20g/L，亮氨酸100mg/L,色氨酸 100mg/L。種子培養(yǎng)基2 :合成氮源YNB 6. 7g/L，混合氨基酸粉末2g/L，葡萄糖20g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，木糖20g/L。從新鮮的斜面上接一環(huán)L2612PR菌落到50mL種子培養(yǎng)基I中。類似的，從新鮮的斜面上接菌落L2612PR-DPPP與SyBE005到50mL種子培養(yǎng)基2中。在30°C、200轉(zhuǎn)/分的條件下培養(yǎng)24小時。以初始菌體濃度0D_=1. 0接種到IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C、150轉(zhuǎn)/分條件下培養(yǎng)，發(fā)酵60小時。檢測菌體濃度、木糖濃度和產(chǎn)物乙醇、木糖醇、甘油的濃度。3.分析方法
同實(shí)施例1。4.試驗(yàn)結(jié)果圖5所示，在48小時內(nèi)菌株SyBE005已經(jīng)完全利用了木糖，而菌株L2612PR、L2612PR-DPPP都只利用了約60%的木糖，SyBE005的最大木糖比消耗速率達(dá)到0. 301g/g干重/h ;發(fā)酵結(jié)束后，L2612PR、L2612PR-DPPP、SyBE005的乙醇產(chǎn)量分別達(dá)到了 2. 02g/L、2. 97g/L、6. 85g/L。L2612PR、L2612PR_DPPP 對應(yīng)的乙醇得率分別為 0. 15g/g 木糖、0. 20g/g木糖，SyBE005的發(fā)酵乙醇 得率達(dá)到0. 33g/g木糖，相對于L2612PR、L2612PR_DPPP分別提高了 120%和65%，如圖6所示；發(fā)酵結(jié)束后，L2612PR、L2612PR-DPPP、SyBE005的木糖醇含量分別達(dá)到了 6. 24g/L、6. 29g/L、2. 43g/L。L2612PR、L2612PR_DPPP 的木糖醇得率達(dá)到 0. 48g/g木糖、0. 42g/g木糖，而SyBE005的木糖醇得率降低為0. 12g/g木糖，相對于L2612PR、L2612PR-DPPP降低了 3、2. 5倍，如圖7所示。
權(quán)利要求
1.一株高效代謝木糖的重組酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)命名為SyBE005，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6634，其具有1 效代謝木糖廣乙醇的能力。
2.權(quán)利要求1所述菌株代謝木糖產(chǎn)乙醇的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株高效代謝木糖的重組酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)命名為SyBE005，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.6634，其具有高效代謝木糖產(chǎn)乙醇的能力。本發(fā)明的重組酵母菌株SyBE005能夠有效的利用木糖發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。乙醇產(chǎn)率達(dá)到理論得率的64%，副產(chǎn)物木糖醇的產(chǎn)率在12%以下，能夠高效地轉(zhuǎn)化木糖為乙醇，是優(yōu)良的利用纖維素水解液的菌株。
文檔編號C12N1/19GK103060217SQ20121050711
公開日2013年4月24日 申請日期2012年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月29日
發(fā)明者元英進(jìn), 査健, 申明華, 胡夢龍 申請人:天津大學(xué)