新型抗狂犬病毒糖蛋白人源基因工程抗體的制備與應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及抗狂犬病毒的單鏈抗體及其表達載體和表達細胞，以及所述單鏈抗體在制備狂犬病毒抗原診斷劑、狂犬病預防劑和/或治療劑中的用途。優選地，所述單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：3所示。
【專利說明】新型抗狂犬病毒糖蛋白人源基因工程抗體的制備與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及抗狂犬病毒糖蛋白人源基因工程抗體的制備與應用。具體地，本發明涉及抗狂犬病毒糖蛋白G的單鏈抗體的制備與應用。
【背景技術】
[0002]狂犬病，是由狂犬病毒感染引起的人畜共患急性傳染病。狂犬病潛伏期可以從幾天至數年，病情極為兇險，病死率高達100%。人類狂犬病主要是通過患狂犬病動物的咬傷、抓傷或被動物舔了破損的黏膜引起的感染，傳染源極為廣泛，主要傳染源為犬，其次為貓，因此預防控制難度大。目前，全球狂犬病病例接近5萬，主要分布在亞洲。我國幾乎各省都有狂犬病的病例發生。上個世紀從70年代至80年代初，由于我國對犬的控制措施不力和疫苗供應嚴重不足，造成狂犬病病例每年持續高達5000-7000人之多。此后全國各地加大了對犬的管理力度，且細胞疫苗大量生產確保供應，使狂犬病的疫情逐年下降，到1996年降至159例。但是，1997年開始回升到222例，此后每年以高比例的速度快速回升。其主要原因是進入90年代中期后，我國城市居民喜歡將犬、貓作為寵物引入家庭，加之對家養動物的許多管理制度和措施不夠完善，使狂犬病疫情逐年回升，居高不下，2008年2373人死于狂犬病、2009年2131人死于狂犬病，至今全國狂犬病病死率仍居法定傳染病前列。
[0003]到目前為止，疫苗和抗體仍然是預防與治療狂犬病的最有效的手段。而在暴露后治療中，在疫苗刺激肌體產生有效的保護之前，被動免疫血清或抗體顯得尤為重要。狂犬病暴露后預防，WHO推薦的處理方法是全程注射狂犬病疫苗，同時注射抗狂犬病馬血清(ERIG)或抗狂犬病人血清(HRIG)。國外的代表性產品是法國巴斯德的ERIG PMC和MOGAMRABIES-HT ；Bayer公司 生產的BayRab (HRIG)。在國內有國藥成都生物制品研究所與武漢生物制品研究所生產的ERIG，血液制品生產企業有一定量的HRIG。
[0004]但是，抗狂犬病人血清的生產因為血源受限制價格昂貴，產量有限，并且人免疫球蛋白也存在潛在血源攜帶病原體的可能性。馬血清制品比較容易發生嚴重的超敏反應，雖然巴斯德在降低馬血清的過敏原性方面做了一些工作，包括在制備過程中加入純化與病毒滅活步驟，但是超敏反應也還時有發生。
[0005]國際國內的研究表明，有必要用單克隆抗體取代狂犬病毒暴露后使用的血源抗體。1990年,B.Dietzschold利用細胞融合技術制備多株人單克隆抗體,發現一株能特異結合狂犬病毒G蛋白的抗體Mab57，其能高效廣泛地中和狂犬病毒并且對狂犬病毒攻擊的實驗室嚙齒類動物有保護作用(J Virol.，1990，64(6):3087-3090)，針對的是狂犬病毒蛋白G的226-231位氨基酸序列。另外，馬薩諸塞大學與美國疾病預防控制中心共有的美國授權專利7，727，532(對應中國專利申請CN101133158A)還公開了人抗狂犬病單克隆抗體17C7株，其在印度已經進入II期臨床。17C7株單抗是針對狂犬病毒蛋白基因的336-342位氨基酸序列。
[0006]為了大量制得單克隆抗體，B.Dietzschold等將Mab57基因轉入SPBN重組病毒表達系統，在BSR細胞中制備了 S057 抗體(J ImmunolMethods, 2001, 252 (1-2) =199-206)。但該方法的穩定性差，操作煩瑣，難以實現產業化。因此需要大規模生產單克隆抗體。
[0007]另外，用哺乳動物細胞生產單克隆抗體的生產過程染菌風險大、難以形成大規模生產。培養過程添加的血清也是潛在的污染源，無血清培養基價格昂貴。盡管人源單克隆抗體相對比較安全，但是由于不同人群的抗體有同種型的差異而且是150KD的分子量相對較大的蛋白，有針對單克隆抗體產生免疫反應的可能，從而降低單抗的治療效果(JMAbs.2009 =332-338)。再者，單克隆抗體的全抗體有Fe片段，作檢測試劑有非特異性吸附，產生的本底高。
[0008]因此，需要開發一種能大規模生成、經濟實惠且安全有效的狂犬病治療制劑。

【發明內容】

[0009]本發明人意外地發現，通過用原核細胞例如大腸桿菌表達人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體，可以實現該單鏈抗體的高效表達，表達產物具有很高的中和狂犬病毒糖蛋白的活性，從而為大規模、經濟且安全地生產狂犬病毒診斷劑、狂犬病治療劑和/或預防劑提供了另一種途徑。
[0010]因此，在本發明第一方面，提供了一種抗狂犬病毒的單鏈抗體，其特征在于包含由連接肽序列連接的(I)SEQ ID NO:1所示重鏈可變區氨基酸序列或與其具有至少90%同源性且能夠結合狂犬病毒G蛋白抗原的序列，以及(2)SEQ ID NO:2所示輕鏈可變區氨基酸序列或與其具有至少90%同源性且能夠結合狂犬病毒G蛋白抗原的序列，或者由上述序列組成。
[0011]在一個實施方案中，(I)的序列連接于所述連接肽的N端或者C端，而(2)的序列連接于所述連接肽的另一端。本發明單鏈抗體中的連接肽通常為長度為至少12個氨基酸殘基的序列，且存在于該抗體中的連接肽序列不會降低該抗體中重鏈可變區和輕鏈可變區部分的活性。在本發明的一個實施方案中，所述連接肽的氨基酸序列為(Gly4Ser)n，其中η為合適的整數，優選地，η為選自3-5的整數，特別優選地，η為4。所述連接肽也可以為其他氨基酸序列，作為一個實例，所述連`接肽的氨基酸序列為AKTTAPSVYPLA。同樣，對于上述連接肽的氨基酸序列，可以對其中的一個或多個氨基酸殘基進行置換、缺失、添加和/或修飾的改造，改造后的氨基酸序列仍可作為連接肽用于本發明的單鏈抗體中。在這個意義上，例如(Gly4Ser)3或(Gly4Ser)5可以認為是(Gly4Ser)4經氨基酸殘基改造后獲得的連接肽序列。
[0012]在優選的實施方案中，與SEQ ID NO:1所示重鏈可變區氨基酸序列的同源性可以為例如至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。
[0013]在優選的實施方案中，與SEQ ID NO:2所示輕鏈可變區氨基酸序列的同源性可以為例如至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。
[0014]在一個優選的實施方案中，上述單鏈抗體包含由連接肽連接的SEQ ID N0:1所示重鏈可變區氨基酸序列和SEQ ID NO:2所示輕鏈可變區氨基酸序列，或者僅由所述序列組成。
[0015]在一個具體的實施方案中，所述單鏈抗體包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列或者由所述氨基酸序列組成。
[0016]在本發明第二方面，提供了一種核酸分子，其編碼本發明第一方面的單鏈抗體。[0017]在一個優選的實施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:5-10所示核酸序列或者由所述序列組成。在一個更優選的實施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:7或8所示核酸序列或者由所述序列組成。
[0018]在本發明第三方面，提供了一種載體，其包含本發明第二方面的的核酸分子。
[0019]在這一方面，所述載體可以是例如pET20b、pET26b、pBV220、pRSET B等，但優選為質粒載體pET20b。
[0020]在本發明第四方面，提供了一種表達細胞，其包含本發明第三方面的載體。
[0021]所述表達細胞優選為原核細胞，例如大腸桿菌細胞、枯草芽孢桿菌細胞。優選地，所述表達細胞為大腸桿菌細胞。
[0022]在本發明第五方面，提供了本發明第一方面的單鏈抗體在制備狂犬病毒抗原診斷劑中的用途。優選地，所述單鏈抗體為SEQ ID NO:3所示的單鏈抗體。
[0023]在本發明第六方面，提供了本發明第一方面的單鏈抗體在制備狂犬病毒抗原預防劑中的用途。優選地，所述單鏈抗體為SEQ ID NO:3所示的單鏈抗體。
[0024]在本發明第七方面，提供了本發明第一方面的單鏈抗體在制備狂犬病毒抗原治療劑中的用途。優選地，所述單鏈抗體為SEQ ID NO:3所示的單鏈抗體。
[0025]通過用原核細胞例如大腸桿菌來進行表達，可以實現本發明抗體的成功表達。另外，通過對其抗原結合特異性以及中和活性的研究，發現所表達的抗狂犬病毒單鏈抗體能夠特異性地結合狂犬病毒抗原并且實現對抗原的中和作用。
[0026]根據大腸桿菌偏 愛的密碼子對抗體基因的重鏈可變區，輕鏈可變區的抗體基因序列進行優化，發現優化后的基因序列克隆后能高效表達，單鏈抗體結構比較穩定、且體外中和活性和體內保護性接近現有人抗狂犬病毒免疫球蛋白水平。
[0027]本發明的抗狂犬病毒單鏈抗體是具有完全抗原結合位點的最小抗體片段，大小為完整抗體的六分之一，易滲透肌體組織，增加藥物治療濃度，沒有Fe片段，不易發生超敏反應。
[0028]本發明的抗狂犬病毒單鏈抗體本身也是單克隆抗體，且沒有Fe片段，可去除非特異性反應的競爭性表面蛋白，作為檢測試劑可以降低本底。
[0029]本發明的抗狂犬病毒單鏈抗體易于基因操作和基因工程大量生產。具體地，本發明的抗體在原核細胞例如大腸桿菌中大量表達常會形成大量的無活性的聚集體，即為包含體，易與可溶雜蛋白分離；與可溶性的蛋白質相比，有產物濃度高，不易被宿主蛋白酶降解，對宿主細胞毒性低等優勢。
[0030]本發明涉及的包含體復性率較高，與狂犬病毒糖蛋白結合能力強，對狂犬病毒中和能力強，因此可以用于狂犬病的預防和治療。
[0031]最后，本發明的人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體與其它抗狂犬病毒糖蛋白單克隆抗體可以聯合使用。具體地，本發明涉及一種組合物，其包含本發明的人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體與FV 57，用于預防或治療狂犬病。本發明還涉及所述組合物在制備狂犬病毒抗原診斷劑、狂犬病預防劑或狂犬病治療劑中的用途。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為FV KW 01基因的擴增模式圖。[0033]圖2為質粒pET20b的圖譜。
[0034]圖3為質粒pET20b_FV Kff 01的酶切鑒定圖。
[0035]圖4為經IPTG誘導和未經IPTG誘導的FV KffOl蛋白表達的電泳圖。
[0036]圖5為FV KW 01蛋白在變性條件下的親和層析圖。
[0037]圖6為流穿液和各洗脫級分的電泳圖。
[0038]圖7示出人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體FV KffOl⑶的特異性抗原結合活性。其中，縱坐標為OD45tl值。
[0039]圖8示出本發明人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體FV KffOl中和病毒的活性。
[0040]圖9示出FV KffOl與0.2,0.4,0.6和0.8IU/ml的滅活狂犬病毒抗原反應的相關
性圖譜。
[0041]圖10示出人源狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體FV KffOl在動物水平中和活性的研究結
果O
[0042]圖11示出人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體FV KffOl與FV57聯合使用在動物水平中和活性的研究結果。
[0043]圖12示出人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體FV KffOl的暴露后免疫即治療效果的研究結果。序列說明·
[0044]SEQ ID NO:1為單鏈抗體FV KffOl的重鏈可變區氨基酸序列。
[0045]SEQ ID NO:2為單鏈抗體FV KffOl的輕鏈可變區氨基酸序列。
[0046]SEQ ID NO:3為單鏈抗體FV KffOl的氨基酸序列。
[0047]SEQ ID NO:4為單鏈抗體FV KffOl(R)的氨基酸序列。
[0048]SEQ ID NO:5為一個編碼單鏈抗體FV KffOl的重鏈可變區的核酸序列。
[0049]SEQ ID NO:6為一個編碼單鏈抗體FV KffOl的輕鏈可變區的核酸序列。
[0050]SEQ ID NO:7為一個編碼單鏈抗體FV KffOl的核酸序列。
[0051]SEQ ID NO:8為一個編碼單鏈抗體FV KffOl(R)的核酸序列。
[0052]SEQ ID NO:9為一個單鏈抗體FV KffOl中連接肽部分的氨基酸序列。
[0053]SEQ ID NO:10為一個編碼單鏈抗體FV KffOl中連接肽部分的核酸序列。
[0054]SEQ ID NO: 11-15分別為寡核苷酸引物FF1-5的序列。
[0055]SEQ ID NO: 16-20分別為寡核苷酸引物SF1-5的序列。
[0056]SEQ ID NO:21~25分別為寡核苷酸引物FR1-5的序列。
[0057]SEQ ID NO:26_30分別為寡核苷酸引物SR1-5的序列。
【具體實施方式】
[0058]下面參照附圖通過實施例對本發明進行具體詳細地說明。應理解，下文給出的具體實施例僅為示例之目的，無意于以任何方式對本發明的范圍進行限定。本發明的范圍由隨附權利要求限定。
[0059]在本申請中，對于未具體述及的實驗方案，均參照《分子克隆實驗指南》(第3版，黃培堂譯)、《現代免疫學實驗技術》(第2版，裘法祖)或者依照廠商提供的說明書進行。
[0060]實施例
[0061]實施例1:人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體FV KffOl基因的密碼子優化及合成[0062]1.FV KffOl基因的密碼子優化
[0063]根據Kramer 等(Kramer R A, Marissen W E, Goudsmit J, et al.The humanantibody repertoire specific for rabies virus glycoproteinas selected fromimmune libraries [J].European Journal of Immunology, 2005, 35 (7):2131-2145)文獻中所述的CR4098抗體序列，獲得其重鏈可變區(SEQ ID NO:1)和輕鏈可變區(SEQ ID NO:2)氨基酸序列，兩段可變區序列之間以連接肽(Gly4S)4(SEQ ID NO:7)連接。選擇大腸桿菌偏愛的密碼子對編碼該氨基酸序列的核酸序列進行優化，優化后的核酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0064]2.利用SOE-PCR法合成人源化單鏈抗體基因FV KffOl
[0065]本發明利用SOE-PCR法合成人源化單鏈抗體基因FV KffOl0合成的基因全長738bp。設計20條寡核苷酸引物，上游引物含EcoR V、EcoR I，下游引物包含Hind IIKBamHI和Xho I等幾個酶切位點，方便基因克隆到原核表達載體pET20b或PBV220，且在下游酶切位點前設終止密碼子。其中FF1-5、SF1_5寡核苷酸引物依次為與目的基因同向部分的引物，FR1-5、SR1_5寡核苷酸引物依次為與目的基因互補部分的引物，且后一引物與前一引物有13至24bp的重疊區。所有引物G+C含量控制在50%左右。將738bp的基因分成兩段，分別經過5輪S0E-PCR，最后再經過一輪PCR對這兩段序列進行拼接，最后合成完整的目的基因序列(見圖1)。
[0066]第I輪PCR:將上述合成的引物FF1/FR1和SF1/SR1這兩對引物分別進行鏈延伸反應(此輪PCR無模板)，反應條件為:94°C5min ;94°C 30s、56°C 30s、72°C 40s，30個循環；72°C IOmin0擴增獲得的2條片段分別命名為Fl (FF1/FR1)和SI (SF1/SR1)。PCR體系:10X 反應緩沖液 5 μ 1、一對引物各 2 μ I (IOOpM)、dNTP I μ I (20mM)、0.5 μ IDNA 聚合酶 pfu酶(2.5U/μ I)，總體積 50 μ I。
`[0067]第2輪PCR:分別以Fl和SI為模板，FF2/FR2、SF2/SR2為引物進行PCR，反應條件同上；其PCR產物作為下一輪的模板，以同樣方法進行第三、四、五輪PCR。
[0068]其中，第五輪PCR由于GC含量過高，未能擴增出目的片段。因此，把反應體系中的DNA聚合酶由pfu酶換成LA-taq酶。為了消除PCR產物末端的“A”，以此PCR產物作為模板，Pfu酶為DNA聚合酶，再進行一輪PCR，其產物分別命名為F5和S5，最后一輪為連接反應，以FF5和SR5為引物，F5、S5作為模板，采用LA_taq酶作為DNA聚合酶，進行PCR反應。除了所使用的DNA聚合酶外，其他反應條件和反應體系同第I輪PCR。
[0069]3.拼接產物的克隆、添加蛋白純化標簽及序列分析
[0070]將六輪SOE-PCR的擴增產物與T載體(pGEM_T Easy, Promega)連接，轉化大腸桿菌(E.coli toplO,購自Invitrogen),小提質粒,并將酶切鑒定結果正確的克隆送測序,挑選與目的序列一致的克隆。對測序正確的克隆設計突變引物，在基因序列的C末端加上6個組氨酸(6XHis)標簽，便于目的蛋白的純化(下文中，將帶有His標簽的克隆稱為FVKffOl⑶，將不帶His標簽的克隆稱為FVKW01 (N)，輕鏈可變區在N端，重鏈可變區在C端不帶His標簽的克隆稱為FV KffOl (R))。
[0071]PCR體系:10X反應緩沖液5μ 1、1μ l(5_50ng)質粒模板DNA、一對突變引物各 2 μ I (IOOpM)、dNTP I μ I (200 μ Μ)、0.5 μ IPfu TurboDNA 聚合酶(2.5U/ μ I)，總體積50 μ I。[0072]突變PCR 條件:95°C預熱 5min ；95°C lmin、55°C lmin、68°C 6min，共 18 個循環。
[0073]PCR反應結束，在50 μ I體系中加入I μ IDpn I (含10U)消化2-3小時，取I μ I轉化大腸桿菌toplO，提取質粒，測序，挑選正確突變的克隆。
[0074]小結:通過以上操作，成功地合成了單鏈抗體基因(FV KffOl)序列，為克隆、表達做準備。
[0075]實施例2:人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體FV KffOl的表達、復性和純化
[0076]1.抗體基因表達載體的構建
[0077]對于測序正確的突變克隆，以EcoR V和Hind III雙酶切質粒和載體pET20b (圖2)，從而構建質粒pET20b-FV KW01(IPTG誘導型表達載體)并進行酶切鑒定，鑒定結果如圖3所示。
[0078]2.pET20b-FV KffOl (FV KffOl(H)或 FV KffOl(N))的誘導表達
[0079]用測序正確的重組質粒pET20b_FV KWOl轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞。用含氨芐青霉素的LB瓊脂平板篩選。挑取新鮮單菌落接種于5ml LB培養基(含氨芐青霉素50μ g/ml)中，37°C振蕩培養過夜。次日接種50 μ I過夜培養物于5ml含氨芐青霉素的LB培養液中。37°C振蕩培養約3h，至0D600 ^ 0.4-0.6時，按1: 1000比例加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside, IPTG)使其終濃度為 Immol/L，并設對照組，誘導表達5-6小時，離心收集細菌。電泳鑒定目的蛋白的表達。結果見圖4。從這幅圖中可以看出，經IPTG誘導后，有分子量介于25-35kb之間的蛋白強烈表達，該蛋白對應目標蛋白即單鏈抗體FV KWOI。
[0080]小結:單鏈抗體基·因(FV KffOl)已經構建與表達成功，表達蛋白的分子量大小正確，目的蛋白所占比例大，表達量聞。
[0081]3.目的表達產物FV KWOl的分離純化
[0082]將細胞沉淀重懸于細菌裂解液(50mmol/L Tris-HCl, ImmoI/LEDTA, pH8.0)中，并于冰浴下超聲破碎15min。在4°C以1000Orpm離心30min。將所得沉淀用8mol/L尿素，IOOmmoI/L Tris-HCl (pH 8.0)溶解，攪拌 2 小時左右。
[0083]然后，在4°C以15000Xg離心30min。取上清，以0.45 μ m微孔濾膜過濾，之后用5ml柱體積的N1-NTA柱(GE公司)進行變性條件下的親和層析。
[0084]首先以30ml的緩沖液(8mol/L尿素，IOOmmoI/L Tris_HClpH8.0)平衡鎳柱，然后上樣，上樣結束后，在此緩沖液基礎上加50mmol/L咪唑洗滌30ml，再以500mmol/L咪唑濃度洗脫，收集洗脫液，電泳分析純化情況，結果見圖6。從圖6以看出，在以500mmol/L咪唑濃度進行洗脫時，可以從鎳柱上洗脫出大部分的目標蛋白即FVKW01。
[0085]小結:在變性條件下，用N1-NTA柱能去除大部分雜蛋白，得到較高純度的目的蛋白。
[0086]4.目的表達產物FV KWOl的復性
[0087]對純化后的變性蛋白進行復性:收集500mmol/L咪唑梯度洗脫液，取少量樣品行SDS-PAGE電泳，估計其蛋白濃度，控制復性蛋白的濃度在50-100 μ g/ml左右。
[0088]用復性液G+(50mmol/L Tris-HCl (pH = 8.0), 10% (v/v)甘油，1% (m/v)甘氨酸，
0.5mmol/L EDTA, 50mmol/L NaCl))和復性液 G-(50mmol/L Tris-HCl(pH = 8.0),10% (v/V)甘油，0.5mmol/L EDTA, 50mmol/L NaCl))分別透析(復性液與蛋白體積比為4: I);每4小時更換一次透析液，以復性液G+和G-各透析3次。透析完成，將復性后的蛋白離心，在40C以15000Xg離心30min。取上清，以0.45 μ m的微孔濾膜過濾后分裝保存。
[0089]實施例3:人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體FV KffOl的特異性抗原結合活性檢測
[0090]用0.lIU/ml的滅活狂犬病毒(aG株，吉林邁豐生物藥業有限公司惠贈)包被96孔板，每孔加100 μ I。用3% BSA-PBS進行封閉，37°C下孵育lh。加入用PBS稀釋的實施例2制備的抗體、作為陽性(P)對照的抗狂犬病毒人免疫球蛋白(hRIG，購自吉林省疾控中心)、作為陰性(N)對照的一個帶有組氨酸標簽的無關蛋白r Ade k、或者作為空白對照的PBS，每孔100μ 1，37°C孵育I小時。隨后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的第二抗體(鼎國)，每孔100μ 1，37°C下孵育I小時。再用四甲基聯苯胺(TMB)顯色液(購自天根生化科技有限公司)顯色，用2M H2SO4終止反應后，在450nm波長下測定OD值，結果見圖7。結果表明，人源抗體FV KffOl(H)可以特異性地與狂犬病毒結合，而無關蛋白r Ade k不能與狂犬病毒結合，表明此抗體是特異性針對狂犬病毒糖蛋白的人源化抗體。FV KffOl(N)7FV KffOl(R)的結果與FV KffOl(H)類似，結果見圖7。
[0091]小結:以上結果表明，FV KffOl⑶，FV KffOl (N)，FV KffOl (R)只能與狂犬病毒特異
性結合，并且有著很好的特異性。
[0092]實施例4:人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體KWOl (H)在細胞水平的中和活性
[0093]采用快速熒光灶抑制試驗(RFFIT法)進行檢測，標準血清(購自中國藥品生物制品檢定所)先經56°C滅活30分鐘。然后，將樣品或標準血清經三倍稀釋后與感染量為80%熒光灶的CVS病毒(CVS-11，購自中國藥品生物制品檢定所)在37°C中和I小時，每孔中再加入5 X IO4個BSR細胞(106/ml，于含10%滅活小牛血清的DMEM中)，37°C培養24小時后，傾出培養液。用含Ca2+、Mg2+的PBS浸洗I遍，加入預冷至_20°C的80%冷丙酮，50 μ I/孔，-20°C固定7分鐘(或室溫30分鐘)。稍干后加入0.02mg/ml的抗狂犬病毒核蛋白的熒光抗體(40μ I/孔，invitr0gen)，`37°C避光孵育60分鐘后，傾出液體，PBS浸洗2遍。滴甘油于孔中(每孔一滴)，鏡檢觀察熒光陽性率，并計算半數有效量(ED50)。樣品的單位含量=標準品的單位含量X樣品的ED50+標準品的ED50。由此計算出FV KffOl(H)效價為958IU/ml (531.7IU/mg)，FV KffOl (N)效價為 380IU/ml, FVKffOl (R)效價為 420IU/ml。如圖8B所示，人源抗體FV KffOl(H)和市售的人源抗狂犬病毒血清(hRIG，購自吉林省疾控中心)一樣可以完全中和狂犬CVS病毒，抑制其感染細胞，且抑制程度與抗體片段的濃度成正比(即與稀釋倍數成反比)，而陰性對照無關蛋白(牛血清白蛋白)對狂犬病毒的感染無抑制作用。這說明所制備的抗狂犬病毒G蛋白人源抗體FV KWOl能特異地中和狂犬病毒，阻止狂犬病毒對BSR細胞的吸附，抑制狂犬病毒對靶細胞的感染，充分說明此抗體具有較高的中和病毒的活性，結果見圖8。
[0094]小結:以上結果表明，FV KffOl⑶，FV KffOl (N)，FV KffOl (R)能夠中和狂犬病毒；而且 FV KffOl(N)與 FV KffOl(R)中和效價相當，FV KWOl (H)，FV KWOl (N)，FV KffOl(R)都具
有預防與治療狂犬病的前景。
[0095]實施例5:人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體FV KffOl (H)在檢測中的應用
[0096]人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體FV KWOl(H)可用于研制狂犬病毒抗原的定量與定性檢測試劑盒，從而高靈敏度地捕獲或檢測狂犬病毒。
[0097]以100 μ I 的 0.01mg/ml 的 FV KffOl (H)包被 96 孔板，用 200 μ I 的 3 % BSA-PBS封閉，加入0.2、0.4、0.6和0.8IU/ml的狂犬病毒抗原，每孔lOOul，于37°C孵育I小時，然后以0.01M PBSl/10000TWeen-20將板洗滌3-5次。加入HRP標記的多抗(抗狂犬病毒的馬血清，或自行制備的抗狂犬病毒的兔血清)，每孔100μ 1，37°C下孵育I小時。用TMB顯色液(購自天根生化科技有限公司)顯色，用H2SO4終止反應后，在450nm波長下測定OD45tl值，以檢測抗原的濃度。結果示于圖9，該圖表明抗體狂犬病毒抗原濃度和OD45tl值之間有很高的相關性(R2 = 0.9852)。由上可知，以FV KffOl(H)作為捕獲抗體，由于成本低，蛋白包被濃度可以比較大，從而提高了抗原檢測范圍。FV KffOl (N)也具有類似的結果(結果未給出)。
[0098]小結:以上結果表明，FV KffOl (H)或FV KffOl (N)可以用做捕獲或檢測抗體，具有作為診斷試劑的前景。
[0099]實施例6:人源抗狂犬病毒糖蛋白單鏈抗體FV KffOl (H)、FVKW01 (N)在動物水平中和活性的研究
[0100]本發明單鏈抗體FV KffOl (H)，FV KffOl (N)在動物水平的中和效果通過對CVS的中和效果進行評價。用80%致死量的病毒與抗體混合。選用16-18g/只雌性昆明小鼠(η =10)，于腿部肌肉注射100 μ I的病毒與抗體的混合液。具體處理見下表:
[0101]
【權利要求】
1.一種抗狂犬病毒的單鏈抗體，其特征在于包含由連接肽序列連接的(I)SEQ ID NO:1所示重鏈可變區氨基酸序列或與其具有至少90%同源性且能夠結合狂犬病毒G蛋白抗原的序列，以及(2)SEQ ID NO:2所示輕鏈可變區氨基酸序列或與其具有至少90%同源性且能夠結合狂犬病毒G蛋白抗原的序列，或者由上述序列組成。
2.權利要求1的單鏈抗體，其特征在于(I)的序列連接于所述連接肽的N端或者C端，而(2)的序列連接于所述連接肽的另一端。
3.權利要求1或2的單鏈抗體,其特征在于所述連接肽的氨基酸序列為(Gly4Ser)n,其中η為合適的整數，優選地，η為選自3-5的整數，特別優選地，η為4 ;或者為AKTTAPSVYPLA。
4.權利要求1的單鏈抗體，其特征在于所述單鏈抗體的氨基酸序列如SEQID NO:3-4所示。
5.一種核酸分子，其編碼權利要求1至4任一項的單鏈抗體。優選地，其包含SEQ IDNO:5-10所示核酸序列或者由所述序列構成。更優選地,其為SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的核酸序列。
6.—種載體,包含權利要求5的核酸分子,優選地,所述載體為載體pET20b。
7.一種表達細胞，包含權利要求3的載體，優選地，所述表達細胞為大腸桿菌細胞。
8.權利要求1至4任一項的單鏈抗體在制備狂犬病毒抗原診斷劑、狂犬病預防劑或狂犬病治療劑中的用途。
9.一種組合物，其包含權利要求1至4任一項的單鏈抗體與FV 57，用于預防或治療狂犬病。·
10.權利要求9的組合物在制備狂犬病毒抗原診斷劑、狂犬病預防劑或狂犬病治療劑中的用途。
【文檔編號】C12N15/63GK103848915SQ201210509801
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年12月3日 優先權日:2012年12月3日
【發明者】孔維, 吳永革, 袁若森, 朱昌林, 姜春來, 谷鐵軍, 張喆, 陳曉旭, 段冶 申請人:長春百克生物科技股份公司, 吉林大學