專利名稱：一種仿生膠原膜包被的培養(yǎng)器皿及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，尤其涉及一種細(xì)胞或組織培養(yǎng)材料。
背景技術(shù)：
將細(xì)胞培養(yǎng)于細(xì)胞外基質(zhì)上有助于在體外維持細(xì)胞的分化表型，并可以使用無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。目前常用于細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞外基質(zhì)材料有各類型的膠原、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白等。膠原作為人與動物體內(nèi)含量最大的細(xì)胞外基質(zhì)成份，其優(yōu)異的生物相容性與生物活性早就為人們所熟知。在體內(nèi)，前膠原分子合成后，被酶切去兩端的端肽，形成長約300nm，直徑1. 5nm的膠原蛋白分子，然后多個膠原分子自組裝形成具有67nm典型D_band結(jié)構(gòu)的納米膠原纖維。67nm D-band的產(chǎn)生是由于膠原分子在首尾相交聯(lián)自組裝時所產(chǎn)生的overlap和gap所致。Overlap段長約30nm, gap段長約37nm。螺紋結(jié)構(gòu)的深度在3nm至5nm間。如圖1所示。在合適的pH、溫度、離子濃度的環(huán)境中，在靜電等作用下，酸法提取得到的膠原分子可以在體外重新自組裝，形成與體內(nèi)類似的具有周期性螺紋結(jié)構(gòu)的膠原纖維。美國Advanced BioMatrix公司有包被膠原纖維的玻璃板出售,但這種玻璃板使用不夠方便。限制了其的應(yīng)用。雖然各國相關(guān)的多家公司(美國BD公司等)都有在商業(yè)化的培養(yǎng)器皿表面進(jìn)行膠原包被，且有產(chǎn)品面市，但這種膠原包被的孔板僅僅利用孔板自身吸附膠原分子進(jìn)行涂覆，并不具備膠原在體內(nèi)所特有的纖維結(jié)構(gòu)及典型的D-band周期性螺紋結(jié)構(gòu)。而細(xì)胞可以響應(yīng)基質(zhì)表面的幾何形貌，且尺寸可以小至納米級。因此，制備有納米結(jié)構(gòu)的膠原涂層培養(yǎng)器皿對于特殊 細(xì)胞的培養(yǎng)及膠原體內(nèi)天然纖維結(jié)構(gòu)生物功能的研究有重要意義。美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院在非TC處理的細(xì)胞培養(yǎng)孔板(聚苯乙烯)表面制備膠原纖維涂層，但大部分的膠原都被洗去，因此包被孔板時使用的膠原濃度要求高，膠原的包被率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對上述產(chǎn)品的缺陷，提供一種易于使用，且均一、平整、具有天然纖維結(jié)構(gòu)及周期性螺紋結(jié)構(gòu)的仿生膠原膜包被的培養(yǎng)器皿，用以增強細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖和細(xì)胞功能及膠原的細(xì)胞學(xué)功能。該膠原膜同器皿表面結(jié)合緊密，不易脫落。本發(fā)明同時提供該培養(yǎng)器皿的制備方法。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種仿生膠原膜包被的培養(yǎng)器皿的制備方法，包括如下步驟( I)將膠原醋酸溶液與鹽緩沖液混合，調(diào)整混合液的pH至中性；(2)將步驟(I)的混合液裝入培養(yǎng)器皿，于40攝氏度以下保溫待膠原重組完成；(3)將步驟(2)得到的含重組膠原的器皿于60攝氏度以下烘干；(4)用超純水洗步驟(3)得到的膠原層(避免洗滌過于劇烈致膠原層脫離器皿底面)，于60攝氏度以下干燥；(5)重復(fù)步驟(4)兩次以上直至洗去所有的鹽結(jié)晶，即得仿生膠原膜包被的培養(yǎng)器皿。優(yōu)選地，步驟(1)所述膠原醋酸溶液為I型或II型膠原醋酸溶液；溶液濃度為
0.02 0. 2mg/ml。優(yōu)選地，步驟(2)所述保溫溫度為30-37攝氏度。優(yōu)選地，步驟(2)所述保溫時間1h至5h。優(yōu)選地，步驟(2)所述的培養(yǎng)器皿為培養(yǎng)多孔板、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等細(xì)胞或組織培養(yǎng)用具，TC處理與否均可。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(1)本發(fā)明通過操作簡便的自組裝過程，經(jīng)多次清洗烘干，通過氫鍵與疏水相互作用增加了膠原對器皿表面的結(jié)合力，克服了膠原在器皿底面結(jié)合力差的問題，制備出具有均一平整結(jié)構(gòu)的無紡布樣式納米纖維仿生膠原膜涂層。(2)膠原利用率高，較美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院的方法相比，達(dá)到相同的包被效果所需使用的膠原量大大減少。(3)器皿底面附著的膠原膜其膠原是以納米纖維形式存在，而且當(dāng)重組溫度介于30至37攝氏度時，形成的纖維具有典型的67nm周期性螺紋結(jié)構(gòu)。(4)所包被的膠原膜可以通過調(diào)整膠原的濃度來控制膠原纖維的包被率和膜厚度。(5)本發(fā)明的膠原膜活性良好，顯示出卓越的細(xì)胞親合性，在細(xì)胞粘附方面優(yōu)于商業(yè)化的組織處理細(xì)胞孔板。


圖1為膠原自組裝原理圖。圖2是天狼星紅染色的孔板圖，Ca)無膠原包被培養(yǎng)孔板；(b)無結(jié)構(gòu)膠原包被培養(yǎng)孔板；(c)實施例1制備的纖維結(jié)構(gòu)膠原包被培養(yǎng)孔板。圖3是實施例1制備的包被在12孔板表面的膠原膜各放大倍數(shù)掃描電鏡圖，(a)1000 倍；(b) 5000 倍；(c) 30000 倍；(d) 50000 倍。圖4為實施例1制備的膠原膜刮痕試驗的掃描電鏡圖。圖5 (a)顯示ATDC5在實施例1制備的包被有纖維結(jié)構(gòu)膠原的培養(yǎng)器皿上粘附的掃描電鏡圖；(b)顯不培養(yǎng)于孔板中的細(xì)胞掃描電鏡圖。圖6是實施例2制備的包被在12孔板表面的膠原膜掃描電鏡圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步具體詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1一種仿生膠原膜包被的培養(yǎng)器皿的制備方法，步驟如下(1)將普通酸法提取的I型膠原用0. 005M的醋酸溶液調(diào)整濃度至0. 2mg/ml。
(2)緩沖液的配制終濃度為 270mM NaCl,60mM HEPES、60mMNa2HP04 · H2OU. 4mMNaOH的緩沖液。(3)將步驟(I)和步驟(2)溶液進(jìn)行混合，得到pH為中性的膠原混合液，取Iml加入Corning公司經(jīng)TC處理的12孔板中，蓋好蓋子，于30攝氏度烘箱保溫3h。(4)將步驟(3)得到的含重組膠原的12孔板蓋子打開，于30攝氏度烘箱烘12h。(5)用超純水洗步驟(4)得到的器皿中的膠原層，避免洗滌過于劇烈致膠原層脫離器皿底面。于30攝氏度烘箱烘2h。(6)重復(fù)步驟(5)四次，即得仿生膠原膜包被的培養(yǎng)器皿。由圖2可以看出，制備的膠原膜在培養(yǎng)器皿表面分布平整均一，布滿了整個器皿的底面。圖3可以看出，器皿 底面附著的膠原膜其膠原是以納米纖維形式存在，直徑約為200nm,而且具有典型的67nm周期性螺紋結(jié)構(gòu)。圖4的刮痕試驗表明膠原膜僅有幾層膠原纖維構(gòu)成，厚度為nm級。將ATDC5細(xì)胞(一種小鼠軟骨分化模型細(xì)胞)分別培養(yǎng)于制備的包被有纖維結(jié)構(gòu)膠原的培養(yǎng)器皿以及普通的商業(yè)化的組織處理細(xì)胞孔板中，培養(yǎng)24h后戊二醛固定，梯度酒精脫水并風(fēng)干，鍍金膜后掃描電鏡觀察。圖5a顯示ATDC5在包被有纖維結(jié)構(gòu)膠原的培養(yǎng)器皿上粘附良好，顯示出卓越的細(xì)胞親合性；而培養(yǎng)于孔板中的細(xì)胞鋪展面積要遠(yuǎn)小于培養(yǎng)于膠原纖維膜上的細(xì)胞(圖5b)說明膠原膜活性良好，在細(xì)胞粘附方面優(yōu)于商業(yè)化的組織處理細(xì)胞孔板。實施例2一種仿生膠原膜包被的培養(yǎng)器皿的制備方法，步驟如下(I)將普通酸法提取的I型膠原用O. 005M的醋酸溶液調(diào)整濃度至O. 05mg/ml。(2)緩沖液的配制終濃度為 270mM NaCl,60mM HEPES、60mMNa2HP04 · H2OU. 4mMNaOH的緩沖液。(3)將步驟(I)和步驟(2)溶液進(jìn)行混合，得到pH為中性的膠原混合液，取Iml加入Corning公司經(jīng)TC處理的12孔板中，蓋好蓋子，于30攝氏度烘箱保溫3h。(4)將步驟(3)得到的含重組膠原的12孔板蓋子打開，于30攝氏度烘箱烘12h。(5)用超純水洗步驟(4)得到的器皿中的膠原層，避免洗滌過于劇烈致膠原層脫離器皿底面。于30攝氏度烘箱烘2h。(6)重復(fù)步驟(5)四次，即得仿生膠原膜包被的培養(yǎng)器皿。由圖6可以看出，制備的膠原膜以比較稀疏的方式分布于12孔板底面，且平整均
O
權(quán)利要求
1.一種仿生膠原膜包被的培養(yǎng)器皿的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)將膠原醋酸溶液與鹽緩沖液混合，調(diào)整混合液的pH至中性； (2)將步驟(I)的混合液裝入培養(yǎng)器皿，于40攝氏度以下保溫待膠原重組完成； (3)將步驟(2)得到的含重組膠原的器皿于60攝氏度以下烘干； (4)用超純水洗步驟(3)得到的膠原層，于60攝氏度以下干燥； (5)重復(fù)步驟(4)兩次以上直至洗去所有的鹽結(jié)晶，即得仿生膠原膜包被的培養(yǎng)器皿。
2.根據(jù)權(quán)利要I所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述膠原醋酸溶液為I型或II型膠原醋酸溶液；膠原濃度為O. 02、. 2mg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要I或2所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述保溫溫度為3(Γ37攝氏度。
4.根據(jù)權(quán)利要3所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述保溫時間為Ih至5h。
5.根據(jù)權(quán)利要I或2所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述的培養(yǎng)器皿為培養(yǎng)多孔板、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等細(xì)胞或組織培養(yǎng)用具。
6.權(quán)利要求f5任意一項所述方法制備的仿生膠原膜及仿生膠原膜包被的培養(yǎng)器皿。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種仿生膠原膜包被的培養(yǎng)器皿及制備方法，包括如下步驟(1)將膠原醋酸溶液與鹽緩沖液混合，調(diào)整混合液的pH至中性；(2)將步驟(1)的混合液裝入培養(yǎng)器皿，于40攝氏度以下保溫待膠原重組完成；(3)將步驟(2)得到的含重組膠原的器皿于60攝氏度以下烘干；(4)用超純水洗步驟(3)得到的膠原層，于60攝氏度以下干燥；(5)重復(fù)步驟(4)兩次以上直至洗去所有的鹽結(jié)晶，即得仿生膠原膜包被的培養(yǎng)器皿。通過簡單的膠原自組裝得到的產(chǎn)品，具有如下優(yōu)點膠原與培養(yǎng)器皿貼合緊密，平整度好，抗降解性能好，具有納米纖維結(jié)構(gòu)，且具有膠原體內(nèi)獨有的67nm周期性螺紋結(jié)構(gòu)。
文檔編號C12M3/00GK103060192SQ201210537068
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者王迎軍, 翟志臣, 姚詠嫦 申請人:華南理工大學(xué)