豬附紅細胞體pcr檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種豬附紅細胞體PCR檢測方法，依次包括病原的分離純化，豬附紅細胞體DNA的提取，引物的設計與合成，普通PCR的檢測，陽性質粒標準品的制備，實時熒光定量PCR的檢測的步驟。相對于IHA、ELISA等其他檢測方法而言，其特異性高、敏感性強，準確性可靠性大；能快速、簡便、可靠、準確的檢測出樣品中的附紅細胞體，也可用于附紅細胞體病的流行病學調查和療效檢測。
【專利說明】豬附紅細胞體PCR檢測方法
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測附紅細胞體病的方法。
[0003]
【背景技術】
[0004]附紅細胞體病(Eperythrozoonsis)是由附紅細胞體(Eperythmzoon, EH)寄生于人、動物紅細胞表面、血漿及骨髓內，引起的一種以貧血、黃疸、發熱等為主要臨床癥狀的人畜共患病。屬于立克次體目(Rickettsiales)、無衆體科(Anaplasmata-ceae)、附紅細胞體屬(Eperythrozoon)。多在紅細胞表面單個或成團，呈鏈狀或鱗片狀，少量游離。
[0005]豬附紅細胞體一般呈環形，直經0.8-2.5um,也有球狀、桿狀。對干燥和化學藥物比較敏感，0.5%石炭酸于37°C經3小時可將其殺死，一般常用濃度的消毒藥在幾分鐘內即可使其死亡，對低溫冷凍的抵抗力較強，可存活數年之久。
[0006]附紅細胞體對宿主的選擇并不嚴格，人、牛、豬、羊等多種動物均可感染，且感染率比較高。有人做過調查，各種階段豬的感染率達80-90%;人的感染陽性率可達86%;而雞的陽性率更高，可達90%，但除了豬之外的其它動物發病率不高。多數隱性，少數發病(受應激因素刺激)， 潛伏期2-45d，病癥因動物種類不同而不同，發熱，食欲不振，精神萎頓，黏膜黃染，貧血，背腰及四肢末梢瘀血，淋巴結腫大，心悸及呼吸加快；腹瀉，生殖力下降，毛質下降，紅細胞數減少，血紅素、血漿白蛋白、球蛋白均下降，淋巴細胞及單核細胞上升，血紅蛋白尿病程長短不一，短者幾天，長者數年，嚴重者死亡。
[0007]該病最早發現于1928年，直到1950年確定豬的黃疸性貧血是由附紅細胞體所引起，才逐漸被重視起來。我國于1981年首先在家兔中發現附紅細胞體，相繼在牛、羊、豬等家畜中查到附紅細胞體，以后在人群中也證實了附紅細胞體感染的存在。該病不僅導致畜產品質量和產量降低，動物生育力下降，而且還可導致動物發生嚴重的臨床癥狀甚至死亡，阻礙了畜牧業的發展，造成了重大的經濟損失。
[0008]目前對該病的診斷仍多采用鏡檢的方法，但由于一些人為的因素及該病多呈混合感染，常會發生誤診。臨床上該病的診斷方法主要以直接鏡檢為主，其中包括鮮血壓片和涂片染色，但是假陽性率高，動物實驗方法是確診的手段，但所費時間太長，費用高，血清學方法包括間接血凝試驗、補體結合試驗或酶聯免疫吸附試驗等，由于附紅細胞體的抗體變化起伏較大，這些方法也不適用于該病的診斷，近幾年雖然用PCR方法診斷豬附紅細胞體病的報道屢見不鮮，但是實際應用過程中，有的仍會表現出不特異和重復性差的現象，加之PCR檢測應用的EB為有害物質，因此，也不是非常理想的方法。而實時熒光定量PCR是近年來發展起來的一項新的核酸技術，具有實時、靈敏、快速、安全等優點，在細菌及病毒病的診斷方面已有廣泛應用，但國內外尚未見應用實時熒光定量P C R檢測豬附紅細胞體的報道。
[0009]

【發明內容】

[0010]本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種豬附紅細胞體PCR檢測方法，能快速、簡便、可靠、準確的檢測出附紅細胞體病，以滿足畜牧業生產和醫學診斷的需求。
[0011]本發明提供的豬附紅細胞體PCR檢測方法，包括以下步驟:
(1)病原的分離純化，嚴格無菌采集10份可疑病豬的血樣lml，4°C或冷凍保存，于每份采集的血樣中加入3倍0.01mol/L pH7.4的PBS清洗,2000r/min離心10min,去上清液,于沉淀中加入1倍的？1^稀釋,56<€水浴3111；[11,立即2000r/min離心10min,棄沉淀,取上清液于另一離心管中，15000r/min離心2h，去上清液，于沉淀中加入1ml生理鹽水稀釋，4°C或一20°C保存備用；
(2)豬附紅細胞體DNA的提取，按GenomicDNA purification試劑盒使用說明，從純化的豬附紅細胞體病原及標準陽性病原中提取豬附紅細胞體模板，4 °C或一 2 O °C保存備用；
(3)引物的設計與合成,根據GenBank中登錄的豬附紅細胞體I6 SrRNA序列，用Primerpremier5.0軟件設計了 I對特異性引物，預計擴增片段大小為263bp，引物序列為:上游引物P 1:5' >CACGCCGTAAACGATGGA<3/ ;下游引物P 2:5' >CACGAG CTGACGACAACC<3 '；
(4)普通PCR的檢測，通過對引物濃度和退火溫度等條件進行優化，最終確定反應體系為:10XPCR 緩沖液 2.5ul，dNTP 2ul, rTaq DNA 聚合酶 Q 0.25ul，20pmol/ul 上、下游引物 P1、P2 各 0.5ul，模板 DNA 2ul，加 ddH20 補足至 25ul ;反應條件為:95°C 3min，94°C 30s，56°C 40 s ,72°C 30 s，30個循環，72°C延伸lOmin，取PCR產物5ul，進行瓊脂糖凝膠電泳；
(5)陽性質粒標準品的制備，將普通PCR擴增產物純化后連接到PM D I 8- T載體上，然后轉化于DH 5大腸桿菌感受態細胞中，在氨芐青霉素抗性平板上篩選出陽性克隆子，并以此陽性質粒作為標準品，用于實時熒光定量PCR擴增；
(6)實時熒光定量PCR的檢測，反應體系為:10XPCR緩沖液2.5ul，2.5mmol/ulMg2+0.2ul, Mg2+ 0.2ul, lOmmol/ul dNTP 2ul, rTaq DNA 聚合酶 Q 0.25ul, 20pmol/ul 上、下游引物 PU P2 各 0.5ul，標準品 DNA 2ul, SYBR GreenI 0.3ul，加 ddH20 補足至 25ul ;反應條件為:95°C 3min，94°C 30s, 56°C 40 s ,72°C 30 s，然后 95°C lmin，60°C lmin，75°C 時收集熒光信號，進行40個循環，每個循環升高0.5°C，停留8 s，做熔解曲線。
[0012]本發明提供的豬附紅細胞體PCR檢測方法，其有益效果在于，提供了一種檢測附紅細胞體病的標準方法，該方法采用的是實時熒光定量PCR，相對于IHA、ELISA等其他檢測方法而言，其特異性高、敏感性強，準確性可靠性大；實時熒光定量PCR所使用的實時定量PCR儀是特異性靶基因檢測與定量的一體化平臺，它將PCR熱循環、熒光檢測和各種應用分析軟件結合在一 起，可動態地觀察PCR每一循環各反應管中PCR產物逐漸增加的情況，具有省時、可重復、靈敏度高和線性范圍寬等優點；SYBR GreenI熒光染料在核酸的實時檢測方面有很多優點，由于它與所有的雙鏈D N A相結合，不必因為模板不同而特別定制，因此通用性好，且價格相對較低，因此本發明建立的檢測豬附紅細胞體的實時熒光定量PCR更加實用；本發明能快速、簡便、可靠、準確的檢測出樣品中的附紅細胞體，也可用于附紅細胞體病的流行病學調查和療效檢測。
[0013]
【具體實施方式】
[0014]下面結合一個實施例，對本發明提供的豬附紅細胞體PCR檢測方法進行詳細的說明。
[0015]
實施例
[0016]本實施例的豬附紅細胞體PCR檢測方法，包括以下步驟:
(1)病原的分離純化，嚴格無菌采集10份可疑病豬的血樣lml，4°C或冷凍保存，于每份采集的血樣中加入3倍0.01mol/L pH7.4的PBS清洗,2000r/min離心10min,去上清液,于沉淀中加入I倍的PBS稀釋,56<€水浴3111；[11,立即2000r/min離心10min,棄沉淀,取上清液于另一離心管中，15000r/min離心2h，去上清液，于沉淀中加入1ml生理鹽水稀釋，4°C或一20°C保存備用；
(2)豬附紅細胞體DNA的提取,按GenomicDNA purification試劑盒使用說明，從純化的豬附紅細胞體病原及標準陽性病原中提取豬附紅細胞體模板，4 °C或一 2 O °C保存備用； (3)引物的設計與合成,根據GenBank中登錄的豬附紅細胞體I6 S rRNA序列，用Primerpremier5.0軟件設計了 I對特異性引物，預計擴增片段大小為263bp，引物序列為:上游引物P 1:5' >CACGCCGTAAACGATGGA<3/ ;下游引物P 2:5' >CACGAG CTGACGACAACC<3 '；
(4)普通PCR的檢測，通過對引物濃度和退火溫度等條件進行優化，最終確定反應體系為:10父？0?緩沖液2.5111，dNTP 2ul, rTaq DNA 聚合酶 Q 0.25ul，20pmol/ul 上、下游引物 P1、P2 各 0.5ul，模板 DNA 2ul，加 ddH20 補足至 25ul ;反應條件為:95°C 3min，94°C 30s，56°C 40 s ,72°C 30 s，30個循環，72°C延伸lOmin，取PCR產物5ul，進行瓊脂糖凝膠電泳；
(5)陽性質粒標準品的制備，將普通PCR擴增產物純化后連接到PM D I 8- T載體上，然后轉化于DH 5大腸桿菌感受態細胞中，在氨芐青霉素抗性平板上篩選出陽性克隆子，并以此陽性質粒作為標準品，用于實時熒光定量PCR擴增；
(6)實時熒光定量PCR的檢測，反應體系為:10XPCR緩沖液2.5ul，2.5mmol/ulMg2+0.2ul，Mg2+ 0.2ul, lOmmol/ul dNTP 2ul,rTaq DNA聚合酶Q 0.25ul, 20pmol/ul 上、下游引物 PU P2 各 0.5ul，標準品 DNA 2ul, SYBR GreenI 0.3ul，加 ddH20 補足至 25ul ;反應條件為:95°C 3min，94°C 30s, 56°C 40 s ,72°C 30 s，然后 95°C lmin，60°C lmin，75°C 時收集熒光信號，進行40個循環，每個循環升高0.5°C，停留8 s，做熔解曲線。
【權利要求】
1.一種豬附紅細胞體PCR檢測方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)病原的分離純化，嚴格無菌采集10份可疑病豬的血樣lml，4°C或冷凍保存，于每份采集的血樣中加入3倍0.01mol/L pH7.4的PBS清洗,2000r/min離心10min,去上清液,于沉淀中加入I倍的PBS稀釋,56<€水浴3111；[11,立即2000r/min離心10min,棄沉淀,取上清液于另一離心管中，15000r/min離心2h，去上清液，于沉淀中加入1ml生理鹽水稀釋，4°C或一20°C保存備用； (2)豬附紅細胞體DNA的提取,按GenomicDNA purification試劑盒使用說明，從純化的豬附紅細胞體病原及標準陽性病原中提取豬附紅細胞體模板，4 °C或一 2 O °C保存備用； (3)引物的設計與合成,根據GenBank中登錄的豬附紅細胞體I6 SrRNA序列，用Primerpremier5.0軟件設計了 I對特異性引物，預計擴增片段大小為263bp，引物序列為:上游引物P 1:5' >CACGCCGTAAACGATGGA<3/ ;下游引物P 2:5' >CACGAG CTGACGACAACC<3 '； (4)普通PCR的檢測，通過對引物濃度和退火溫度等條`件進行優化，最終確定反應體系為:10XPCR 緩沖液 2.5ul，dNTP 2ul, rTaq DNA 聚合酶 Q 0.25ul，20pmol/ul 上、下游引物 P1、P2 各 0.5ul，模板 DNA 2ul，加 ddH20 補足至 25ul ;反應條件為:95°C 3min，94°C 30s，56°C 40 s ,72°C 30 s，30個循環，72°C延伸lOmin，取PCR產物5ul，進行瓊脂糖凝膠電泳； (5)陽性質粒標準品的制備，將普通PCR擴增產物純化后連接到PM D I 8- T載體上，然后轉化于DH 5大腸桿菌感受態細胞中，在氨芐青霉素抗性平板上篩選出陽性克隆子，并以此陽性質粒作為標準品，用于實時熒光定量PCR擴增；` (6)實時熒光定量PCR的檢測，反應體系為:10XPCR緩沖液2.5ul，2.5mmol/ulMg2+0.2ul, Mg2+ 0.2ul, lOmmol/ul dNTP 2ul, rTaq DNA 聚合酶 Q 0.25ul, 20pmol/ul 上、下游引物 PU P2 各 0.5ul，標準品 DNA 2ul, SYBR GreenI 0.3ul，加 ddH20 補足至 25ul ;反應條件為:95°C 3min，94°C 30s, 56°C 40 s ,72°C 30 s，然后 95°C lmin，60°C lmin，75°C 時收集熒光信號，進行40個循環，每個循環升高0.5°C，停留8 s，做熔解曲線。
【文檔編號】C12Q1/68GK103865992SQ201210551025
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月18日 優先權日:2012年12月18日
【發明者】張述智, 夏偉, 朱紹輝, 張 浩, 王曉麗, 徐權汗, 李之詳, 許團輝 申請人:青島中仁藥業有限公司