適用于多種樣本的dna提取試劑配制方法和提取方法
【專利摘要】適用于多種樣本的DNA提取試劑配制方法和提取方法，它涉及生物【技術領域】，它樣本的預處理過程為：刮取口腔細胞，將口腔細胞拭子浸入到1.5mlPBS溶液中，震蕩混勻，然后再將液體轉入新的Ep管中，采用離心機進行離心2-5min，吸棄上清液，只保留沉淀，它的DNA樣本的提取過程為：在樣本沉淀中加入350-420ul的溶解液1和10-15ul的20mg/ml蛋白酶K渦旋混勻30-40min，溫度為60-80℃，期間每隔10min震蕩一次，然后進行DNA樣本的純化處理及檢測。它簡化了提取步驟，只需要經過細胞裂解、漂洗和溶解三個步驟，使提取質量和純度得到大幅提升，并適用于多種不同樣本，降低了成本。
【專利說明】適用于多種樣本的DNA提取試劑配制方法和提取方法
[0001]
【技術領域】:
本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及適用于多種樣本的DNA提取試劑配制方法和提取方法。
[0002]【背景技術】:
DNA提取是分子生物學的基本實驗，也是不斷發展的基因芯片檢測中最基本的方法，它是基因芯片制備、分析和診斷的前提，因此，DNA提取是生物學最基礎的技術之一，成功的核酸分離純化需要四個重要的步驟:組織或細胞的破碎和裂解，核蛋白復合體的變性，核酸酶的滅活以及污染物的去除，理想的抽提方法可以獲取高質量的靶核酸，同時沒有蛋白、糖、脂和其它核酸污染等。酚抽提法、異丙醇沉淀法、甲酞胺裂解法是動物來源的DNA最為經典的方法，現行的很多方法都是在此基礎上改進得來，這三種方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫酸鈉消化破碎細胞，在前兩種方法中裂解液先用酚/氯仿去除蛋白質，再分別用乙醇或異丙醇沉淀DNA。甲酞胺法是利用高濃度的甲酞胺解聚蛋白質與DNA的結合，然后利用透析來處理DNA樣品。提取DNA的純度很高，但操作繁瑣，用時長，且所用試劑具有一定的毒性。植物來源的DNA提取方法有十六烷基三乙基澳化按(CTAB)法，SDS法和高鹽低pH法等，細菌、真菌來源的DNA提取方法為堿裂解法、煮沸法、SDS裂解法以及Triton-溶菌酶裂解法等。以上方法雖然經典但多用到酚等有毒的有機試劑，安全性低，對人體毒性較大，步驟較多且繁瑣，耗時較長，提取結果不穩定，鑒于這些缺點，目前使用相對較少。多數生物實驗室開始使用試劑盒提取DNA，市場上大多數商業核酸抽提試劑盒采用固相純化法，相對于傳統方法，試劑盒提取較快速和高效，固相系統抽提核酸依賴緩沖液的PH值和鹽濃度來吸附核酸，基于以下原理:氫與親水基質發生相互結合作用，在水溶液中則通過陰離子交換柱發生離子交換，以及通過親和力和大小排除機制。固相純化通常采用離心柱通過離心力作用運行，支持物有硅膠、玻璃顆粒 、硅藻土、陰離子交換載體等，抽提包括細胞裂解、核酸吸附、漂洗和洗脫四個關鍵性步驟，但基于這種方法的提取結果存在從固相支持物上DNA洗脫不完全，導致得率低等缺點，不能滿足下游某些對DNA質、量要求較高的實驗操作，尤其不利于對小量珍貴樣本的提取。
[0003]
【發明內容】
:
本發明的目的是提供適用于多種樣本的DNA提取試劑配制方法和提取方法，它簡化了提取步驟，只需要經過細胞裂解、漂洗和溶解三個步驟，針對前有方法提出的DNA質量不佳，含有雜質太多做了更進一步改進，使提取質量和純度得到大幅提升，并適用于多種不同樣本，不需要利用柱子吸附核酸，降低成本，最大程度減少核酸的損失，最終DNA得率高，質量好。
[0004]為了解決【背景技術】所存在的問題，本發明采用以下技術方案:1、樣本的預處理過程為:刮取口腔細胞，將口腔細胞拭子浸入到1.5ml PBS溶液中，震蕩混勻，然后再將液體轉入新的Ep管中，采用離心機進行離心2-5min，吸棄上清液，只保留沉淀。
[0005]2、DNA樣本的提取過程為:在樣本沉淀中加入350-420ul的溶解液I和10_15ul的20 mg /ml蛋白酶K渦旋混勻30_40min，溫度為60_80°C，期間每隔IOmin震蕩一次。
[0006]3、DNA樣本的純化處理及檢測過程為:取出Ep管瞬甩，加入180-200 ul的溶解液2，60-80°C保溫10-15min，將Ep管中的液體轉移到新的1.5ml的Ep管中，采用離心機進行離心，離心6-8min，抽吸上清液到另一個Ep管中，然后加入等體積的冷的異丙醇，顛倒混勻，采用離心機進行離心5-10min，緩緩倒出上清液，在干凈的吸水紙上倒扣Ep管將其中少量的液體倒出，再加入l_3ml的70%乙醇洗滌沉淀，采用離心機進行離心5-8min，緩緩倒出上清，在干凈的吸水紙上倒扣Ep管使其中少量的液體自然流出，并晾干15-20min，加入30ul的DNA溶解液3，渦旋5秒，瞬甩，再采用離心機離心5_8min，吸取上清液，然后轉移到新的Ep管中，采用分光光度計檢測OD值。
[0007]所述的溶解液1 為 1Ommol /L 的 Tris -HCl, 10 mmol /L 的KCl, 10 mmol /L 的MgCl2, 2 mmol /L 的 EDTA，0.4 mol /L 的 NaCl, 1% 的 SDS 配制而成的水溶液。
[0008]所述的溶解液2為5 mol /L NaCl溶液。
[0009]所述的溶解液3為去離子水或者為采用10 mmol /L的Tris _HC1，1 mmol /L的EDTA配制成的水溶液。
[0010]本發明具有以下有益效果:它簡化了提取步驟，只需要經過細胞裂解、漂洗和溶解三個步驟，針對前有方法提出的DNA質量不佳，含有雜質太多做了更進一步改進，使提取質量和純度得到大幅提升，并適用于多種不同樣本，不需要利用柱子吸附核酸，降低成本，最大程度減少核酸的損失，最終DNA得率高，質量好。
[0011]【具體實施方式】一:
本【具體實施方式】采取以下技術方案:1、樣本的預處理過程為:刮取口腔細胞，將口腔細胞拭子浸入到1.5ml PBS溶液中，震蕩混勻，然后再將液體轉入新的Ep管中，采用離心機進行離心2-5min，吸棄上清液，只保留沉淀。
[0012]2、DNA樣本的提取過程為:在樣本沉淀中加入350-420ul的溶解液I和10_15ul的20 mg /ml蛋白酶K渦旋混勻30_40min，溫度為60_80°C，期間每隔IOmin震蕩一次。
[0013]3、DNA樣本的純化處理及檢測過程為:取出Ep管瞬甩，加入180-200 ul的溶解液2，60-80°C保溫10-15min，將Ep管中的液體轉移到新的1.5ml的Ep管中，采用離心機進行離心，離心6-8min，抽吸上清液到另一個Ep管中，然后加入等體積的冷的異丙醇，顛倒混勻，采用離心機進行離心5-10min，緩緩倒出上清液，在干凈的吸水紙上倒扣Ep管將其中少量的液體倒出，再加入l_3ml的70%乙醇洗滌沉淀，采用離心機進行離心5-8min，緩緩倒出上清，在干凈的吸水紙上倒扣Ep管使其中少量的液體自然流出，并晾干15-20min，加入30ul的DNA溶解液3，渦旋5秒，瞬甩，再采用離心機離心5_8min，吸取上清液，然后轉移到新的Ep管中，采用分光光度計檢測OD值。
[0014]所述的溶解液I 為 IOmmol /L 的 Tris -HCl, 10 mmol /L 的KCl, 10 mmol /L 的MgCl2, 2 mmol /L 的 EDTA，0.4 mol /L 的 NaCl, 1% 的 SDS 配制而成的水溶液。
[0015]所述的溶解液2為5 mol /L NaCl溶液。
[0016]所述的溶解液3為去離子水或者為采用10 mmol /L的Tris _HC1，1 mmol /L的EDTA配制成的水溶液。
[0017]本【具體實施方式】具有以下有益效果:它簡化了提取步驟，只需要經過細胞裂解、漂洗和溶解三個步驟，針對前有方法提出的DNA質量不佳，含有雜質太多做了更進一步改進，使提取質量和純度得到大幅提升，并適用于多種不同樣本，不需要利用柱子吸附核酸，降低成本，最大程度減少核酸的損失，最終DNA得率高，質量好。
[0018]【具體實施方式】二:本【具體實施方式】的與【具體實施方式】一的不同之處在于它的樣本預處理過程不同，它的樣本的預處理過程為:采用鑰匙將血凝塊轉入干凈的玻璃研磨器中，加入380-410ul的溶液4，充分研磨直到沒有明顯的血凝塊，吸取0.4-0.5ml的研磨液到新的1.5ml的Ep管中，然后加入適量的溶解液4補充體積到1.5ml，室溫靜置10_15min，然后采用離心機進行離心，吸棄上清液，重復上步驟2-3次，得到白細胞沉淀。其它處理方法與【具體實施方式】一相同。
[0019]所述的溶解液4采用1.0g的KHC03，8.3g的NH4CL和0.037 g的EDTA_Na2，加入1000ml雙蒸水配制成的工作液。
[0020]【具體實施方式】三:本【具體實施方式】與【具體實施方式】一的不同之處在于樣本的預處理過程不同，它的樣本的預處理過程為:將抗凝血吹吸均勻，取出0.3-0.5ml的血液到
1.5ml的Ep管中，然后加入 適量的溶解液4補充體積到1.5ml，室溫靜置10_15min，采用離心機進行離心3min，吸棄上清液，重復上步驟2-3次，得到白細胞沉淀。其它處理方法與【具體實施方式】一相同。
【權利要求】
1.適用于多種樣本的DNA提取試劑配制方法和提取方法，其特征在于:(1)、樣本的預處理過程為:刮取口腔細胞，將口腔細胞拭子浸入到1.5ml PBS溶液中，震蕩混勻，然后再將液體轉入新的Ep管中，采用離心機進行離心2-5min，吸棄上清液，只保留沉淀；(2)、DNA樣本的提取過程為:在樣本沉淀中加入350-420ul的溶解液I和10-15ul的20 mg /ml蛋白酶K渦旋混勻30-40min，溫度為60_80°C，期間每隔IOmin震蕩一次；(3)、DNA樣本的純化處理及檢測過程為:取出Ep管瞬甩，加入180-200 ul的溶解液2，60-80°C保溫10_15min，將Ep管中的液體轉移到新的1.5ml的Ep管中，采用離心機進行離心，離心6_8min，抽吸上清液到另一個Ep管中，然后加入等體積的冷的異丙醇，顛倒混勻，采用離心機進行離心5-10min,緩緩倒出上清液，在干凈的吸水紙上倒扣Ep管將其中少量的液體倒出，再加入l-3ml的70%乙醇洗滌沉淀，采用離心機進行離心5-8min，緩緩倒出上清，在干凈的吸水紙上倒扣Ep管使其中少量的液體自然流出，并晾干15-20min，加入30ul的DNA溶解液3，渦旋5秒，瞬甩，再采用離心機離心5-8min，吸取上清液，然后轉移到新的Ep管中，采用分光光度計檢測OD值。
2.根據權利要求1所述的適用于多種樣本的DNA提取試劑配制方法和提取方法，其特征在于所述的溶解液I為IOmmol /L的Tris -HCl, 10 mmol /L的KCl, 10 mmol /L的MgCl2, 2 mmol /L 的 EDTA，0.4 mo I /L 的 NaCl，1% 的 SDS 配合而成的水溶液。
3.根據權利要求1所述的適用于多種樣本的DNA提取試劑配制方法和提取方法，其特征在于所述的溶解液2為5 mol /L NaCl溶液。
4.根據權利要求1所述的適用于多種樣本的DNA提取試劑配制方法和提取方法，其特征在于所述的溶解液3為去離子水或者為采用10 mmol /L的Tris _HC1，1 mmol /L的EDTA配制成的水溶液。
5.根據權利要求1所述的適用于多種樣本的DNA提取試劑配制方法和提取方法，其特征在于所述的樣本的預處理過程為:采用鑰匙將血凝塊轉入干凈的玻璃研磨器中，加入,380-410ul的溶液4，充 分研磨直到沒有明顯的血凝塊，吸取0.4-0.5ml的研磨液到新的,1.5ml的Ep管中，然后加入適量的溶解液4補充體積到1.5ml，室溫靜置10_15min，然后采用離心機進行離心，吸棄上清液，重復上步驟2-3次，得到白細胞沉淀。
6.根據權利要求1所述的適用于多種樣本的DNA提取試劑配制方法和提取方法，其特征在于所述的溶解 液4采用1.0g的KHC03，8.3g的NH4CL和0.037 g的EDTA_Na2，加入,1000rnl雙蒸水配制成的工作液。
7.根據權利要求1所述的適用于多種樣本的DNA提取試劑配制方法和提取方法，其特征在于所述的樣本的預處理過程為:它的樣本的預處理過程為:將抗凝血吹吸均勻，取出,0.3-0.5ml的血液到1.5ml的Ep管中，然后加入適量的溶解液4補充體積到1.5ml，室溫靜置10-15min,采用離心機進行離 心3min,吸棄上清液,重復上步驟2_3次,得到白細胞沉淀。
【文檔編號】C12N15/10GK103882006SQ201210554081
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月19日 優先權日:2012年12月19日
【發明者】楊利霞, 修賀明 申請人:河北省健海生物芯片技術有限責任公司