專利名稱：一種干細胞培養基及其應用和干細胞培養方法
技術領域：
本發明涉及細胞培養領域，尤其涉及一種干細胞培養基及其應用和干細胞培養方法。
背景技術：
諸多研究表明干細胞不僅可以自我更新，在條件合適的情況下能分化成其他功能細胞，因此干細胞有望成為治療人類疑難疾病的有效手段。然而，干細胞在正常成體組織中含量甚微，在體外如何快速擴增與培養干細胞培養是研究干細胞的作用機制及探索其在治療人類疾病治療方法的重要技術。干細胞盡量含量甚微，但廣泛分布于哺乳動物的各個組織器官，這些組織或器官包括但不局限于骨髓、臍帶、脂肪組織、腦組織、視網膜、心臟、肝臟、肺以及皮膚等。大量研究表明，這些低含量的干細胞可在體外通過適當的方法進行進一步擴增，最常規的一種培養干細胞的培養基就是添加有胎牛血 清的培養基。然而，采用這種培養基培養的干細胞，不僅生長比較緩慢，而且傳遞次數超過5代之后其分化成功能細胞的潛能大大降低，牛血清批次存在潛在的不重復性也大大影響了其規模化；另一方面，牛血清相對于人是異源性的東西，從而限制了其在臨床上的應用。因此，探索快速擴增干細胞而又不影響其潛能的培養條件及其培養基組成的優化組合是非常重要的研究內容。
發明內容
鑒于上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種干細胞培養基及其應用和干細胞培養方法，旨在解決采用現有添加有牛血清的培養基培養干細胞存在生長緩慢且細胞潛能會傳代次數的增加而大大降低的問題。本發明的技術方案如下
一種干細胞培養基，其中，所述干細胞培養基中不含血清，所述干細胞培養基包括氨基酸、維生素、鹽類、脂類、細胞因子和蛋白多肽；
其中，所述氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸及谷氨酰胺；
所述細胞因子和蛋白多肽包括成纖維細胞生長因子1、成纖維細胞生長因子2、表皮生長因子、血小板衍生生長因子、胰島素、胰島素樣生長因子1、血管內皮細胞生長因子、胎盤生長因子、白血病抑制因子、干細胞因子、轉鐵蛋白和人血清白蛋白；
所述維生素包括生物素、氯化膽堿、D-泛酸鈣、葉酸、肌醇、煙酰胺、吡哆醇鹽酸鹽、核黃素、鹽酸硫氨、輔酶Q10、維生素B12、腐胺二鹽酸鹽、維生素C和維生素E ；
所述脂類包括地塞米松、油酸、膽固醇、乙醇胺、亞油酸、硫辛酸和脂質混合物；
所述鹽類包括碳酸氫鈉、氯化鈣、氯化鉀、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鈉、一水磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和丙酮酸鈉；所述干細胞培養基還包括抗氧化劑、D-葡萄糖、牛磺酸、肝素鈉。所述的干細胞培養基，其中，所述干細胞培養基以I升計算，包括以下組分 丙氨酸O. ΟΓΟ. 25mM
精氨酸O. ΓΙΟ mM
天冬酰胺 O. 11 2. 75 mM 天冬氨酸 O. 03 O. 75 mM 半胱氨酸 O. 03 O. 75 mM 谷氨酸O. 03 O. 75 mM
甘氨酸O. 05 1. 25 mM
組氨酸O. 03 O. 75 mM
異亮氨酸 O. 5 12. 5 mM 亮氨酸O. 24 6 mM
賴氨酸O. 2^5 mM
甲硫氨酸 O. 12^3 mM 苯丙氨酸 O. 2Γ5. 25 mM 脯氨酸O. 004^0.1 mM
絲氛酸O. 15 3. 5 mM
蘇氛酸O. 06 1. 5 mM
色氨酸O. 02 O. 5 mM
酪氨酸O. 03 O. 75 mM
纈氨酸O. 28 7 mM
谷氨酰胺 O. 8 20 mM 表皮生長因子1-10 mg/L
纖維細胞生長因子I1-10 mg/L
纖維細胞生長因子21-10 mg/L
胰島素樣生長因子I1-10 mg/L
白細胞因子1-10 mg/L
血小板衍生生長因子1_10 mg/L
胎盤生長因子1-10 mg/L
干細胞因子1-10 mg/L
血管內皮細胞生長因子 1-10 mg/L 胰島素I 25 mg/L
轉鐵蛋白4"100 mg/L
人血清白蛋白 0.02、. 5 g/L 生物素6 150mM
氯化膽堿12 300mM
葉酸1. 2 30mM
輔酶 QlOO. 2"5mM
地塞米松2 50 nMD-泛酸鈉I 25mM
肌醇14 350mM
煙酰胺ΓI OOmM
吡哆醇鹽酸鹽O. 03、. 75mM
核黃素0.11 2.75mM
鹽酸硫氨O. 11 2. 75mM
維生素 B12O. Γ2. 5mM
腐胺二鹽酸鹽O. Γ2. 5mM
維生素C2 50 mg/L
維生素EO. 05 L 25 mg/L
肝素鈉0.08 2 g/L
D-葡萄糖3. 6 90 mM 還原性谷胱甘肽 O. 0002、· 005 mg/L
牛磺酸O. 00144 O. 36 g/L
β-巰基乙醇O. 01 O. 25mg/L
酚紅1. 62 40. 5 mg/L
油酸O. 5 12. 5 mg/L
亞油酸O. 5 7. 5 mg/L
硫辛酸O. 02^0. 5 mg/L
脂質混合物O. 2^5 ml/L
膽固醇I 25 mg/L
乙醇胺12 300ml/L
碳酸氫鈉2. 32 58 mM
氯化鈣O. 0168 O. 42 mM
氯化鉀O. 832 20. 8 mM
氯化鎂O. 06 1. 5 mM
硫酸鎂O. 0814^2. 035 mM
氯化鈉24. 122 603. 55 mM
磷酸二氫鈉O. 0906 2. 265 mM
磷酸氫二鈉O. Γ2. 5 mM
丙酮酸鈉O. Γ2. 5 mM。所述的干細胞培養基，其中，所述干細胞培養基以I升計算，包括以下組分
丙氨酸O. 05 mM
精氨酸2. 00 mM
天冬酰胺O. 55 mM
天冬氨酸O. 4 mM
半胱氨酸O. 15 mM
谷氨酸O. 15 mM
甘氨酸O. 25 mM組氨酸O. 15 mM
異亮氨酸2. 50 mM
亮氨酸1. 20 mM
賴氨酸1. 00 mM
甲硫氨酸O. 60 mM
苯丙氨酸1. 05 mM
脯氨酸O. 02 mM
絲氨酸O. 70 mM
蘇氨酸O. 30 mM
色氨酸O. 10 mM
酪氨酸O. 15 mM
纈氨酸1. 4 mM
谷氨酰胺4 mM表皮生長因子1-10 mg/L
纖維細胞生長因子I1-10 mg/L
纖維細胞生長因子21-10 mg/L
胰島素樣生長因子I1-10 mg/L
白細胞因子1-10 mg/L血小板衍生生長因子 1_10 mg/L
胎盤生長因子1-10 mg/L
干細胞因子1-10 mg/L血管內皮細胞生長因子1-10 mg/L
胰島素5 mg/L
轉鐵蛋白20 mg/L
人血清白蛋白O.1 g/L
生物素30 mM
氯化膽堿60 mM
葉酸6 mM
輔酶QlOI mM
地塞米松10 nM
D-泛酸鈉5 mM
肌醇70 mM
煙酰胺20 mM
吡哆醇鹽酸鹽O. 15 mM
核黃素O. 55 mM
鹽酸硫氨O. 55 mM
維生素B12O. 5 mM
腐胺二鹽酸鹽O. 5 mM
維生素C10 mg/L維生素EO. 25 mg/L
肝素鈉0.4g/L
D-葡萄糖18 mM
還原性谷胱甘肽0.001 mg/L
牛磺酸0.0072 g/L
巰基乙醇0.05 mg/L
酌■紅8. lmg/L
油酸2. 50 mg/L
亞油酸1. 5 mg/L
硫辛酸O.1 mg/L
脂質混合物I ml/L
膽固醇5 mg/L
乙醇胺60 ml/L
碳酸氫鈉11. 6 mM
氯化鈣O. 084 mM
氯化鉀4. 16 mM
氯化鎂O. 3 mM
硫酸鎂O. 407 mM
氯化鈉120.61 mM
一水磷酸二氫鈉O. 453 mM 磷酸氫二鈉O. 5 mM
丙酮酸鈉O. 5 mM。一種如上所述的干細胞培養基的應用，其中，將所述干細胞培養基用于培養干細胞。所述的干細胞培養基的應用，其中，所述干細胞包括但不局限于人與哺乳動物來源的干細胞。所述的干細胞培養基的應用，其中，所述干細胞從各種組織或器官里分離得到；所述組織與器官包括但不局限于骨髓、臍帶、脂肪組織、腦組織、視網膜、心臟、肝臟、肺以及皮膚。一種采用如上所述的干細胞培養基的培養干細胞的方法，其中，在進行培養干細胞前將用于促使干細胞貼壁的材料包被培養皿，依次所述加入所述干細胞培養基和干細胞。所述的培養干細胞的方法，其中，所述用于促使干細胞貼壁的材料為膠原蛋白、明膠、多聚賴氨酸、纖粘連蛋白、層粘連蛋白、玻表粘連蛋白的一種或多種混合物。有益效果本發明所提供的干細胞培養基，不含血清，適合于快速培養人及哺乳動物組織來源的干細胞，包括但不局限于脂肪間充質干細胞、骨髓間充質干細胞和臍帶血干細胞。該培養基能讓細胞的擴增速度提高3-5倍，但又不影響其分化的潛能。采用該干細胞培養基與普通培養基相比，不僅能更快速擴增不同來源的干細胞，延長了傳代次數，而且又能很好的保持干細胞的潛能性。
圖1a為本發明實施例1中采用本發明干細胞培養基與常規培養基培養ADSC的干細胞擴增速度的檢測結果示意圖。圖1b為本發明實施例1中采用本發明干細胞培養基與常規培養基培養BMSC的干細胞擴增速度的檢測結果示意圖。圖1c為本發明實施例1中采用本發明干細胞培養基與常規培養基培養UMBSC的干細胞擴增速度的檢測結果示意圖。圖2為本發明實施例2中經過本發明干細胞培養基與常規培養基培養的ADSC、BMSC和UMBSC體外分化成軟骨細胞潛能的檢測結果示意圖。圖3為本發明實施例3中經過本發明干細胞培養基與常規培養基培養的ADSC、BMSC和UMBSC體外分化成脂肪細胞潛能的檢測結果示意圖。圖4為本發明實施例4中經過本發明干細胞培養基與常規培養基培養的ADSC、BMSC和UMBSC體外分化成神經細胞潛能的檢測結果示意圖。圖5為本發明實施例5中經過本發明干細胞培養基與常規培養基培養的ADSC、BMSC和UMBSC體外分化成視網膜上皮細胞潛能的檢測結果示意圖。圖6為本發明實施例6中經過本發明干細胞培養基培養的ADSC、BMSC和UMBSC移植之后對感光細胞退行性視網膜模型的保護作用的檢測結果示意圖。
具體實施例方式本發明提供一種 干細胞培養基及其應用和干細胞培養方法，為使本發明的目的、技術方案及效果更加清楚、明確，以下對本發明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。本發明所提供的干細胞培養基中不含血清，其配方涉及到添加氨基酸、維生素、鹽類、脂類、細胞因子和蛋白多肽，細胞培養方法涉及到促進細胞貼壁材料的使用。該方法與普通培養基相比，不僅能更快速擴增不同來源的干細胞，延長了傳代次數，而且又能很好的保持干細胞的潛能性。所述干細胞培養基適合用于快速培養人及哺乳動物組織來源的干細胞，包括但不局限于脂肪間充質干細胞、骨髓間充質干細胞和臍帶血干細胞。具體地，所述干細胞培養基包括氨基酸、維生素、鹽類、脂類、細胞因子和蛋白多肽；
其中，所述氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸及谷氨酰胺；
所述細胞因子和蛋白多肽包括成纖維細胞生長因子I (FGF1)、成纖維細胞生長因子2 (FGF2)、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素(insulin)、胰島素樣生長因子I (IGF1)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、胎盤生長因子(PGF)、白血病抑制因子(LIF)、干細胞因子(SCF)、轉鐵蛋白(transferrin)和人血清白蛋白(HSA)；
所述維生素包括生物素、氯化膽堿、D-泛酸鈣、葉酸、肌醇、煙酰胺、吡哆醇鹽酸鹽、核黃素、鹽酸硫氨、輔酶Q10、維生素B12、腐胺二鹽酸鹽、維生素C和維生素E ；所述脂類包括地塞米松、油酸、膽固醇、乙醇胺、亞油酸、硫辛酸和脂質混合物(Lipidmixture) (Sigma,L5416)；
所述微量元素包括綠化鈷、亞硒酸鈉、氯化鎳、氯化錳、乙二胺四乙酸鈉鹽、七鑰酸銨、氯化鋁、硫酸鉻鉀、硫酸銅、硝酸鐵、硫酸亞鐵或硫酸鋅；
其他小分子物質包括抗氧化劑(b-巰基乙醇、還原型谷胱甘肽)、D-葡萄糖、牛磺酸、肝素鈉。進一步地，所述干細胞培養基以I升計算，包括以下組分
權利要求
1.一種干細胞培養基，其特征在于，所述干細胞培養基中不含血清，所述干細胞培養基包括氨基酸、維生素、鹽類、脂類、細胞因子和蛋白多肽； 其中，所述氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸及谷氨酰胺； 所述細胞因子和蛋白多肽包括成纖維細胞生長因子1、成纖維細胞生長因子2、表皮生長因子、血小板衍生生長因子、胰島素、胰島素樣生長因子1、血管內皮細胞生長因子、胎盤生長因子、白血病抑制因子、干細胞因子、轉鐵蛋白和人血清白蛋白； 所述維生素包括生物素、氯化膽堿、D-泛酸鈣、葉酸、肌醇、煙酰胺、吡哆醇鹽酸鹽、核黃素、鹽酸硫氨、輔酶Q10、維生素B12、腐胺二鹽酸鹽、維生素C和維生素E ； 所述脂類包括地塞米松、油酸、膽固醇、乙醇胺、亞油酸、硫辛酸和脂質混合物； 所述鹽類包括碳酸氫鈉、氯化鈣、氯化鉀、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鈉、一水磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和丙酮酸鈉； 所述干細胞培養基還包括抗氧化劑、D-葡萄糖、牛磺酸、肝素鈉。
2.根據權利要求1所述的干細胞培養基，其特征在于，所述干細胞培養基以I升計算，包括以下組分 丙氨酸O. ΟΓΟ. 25mM 精氨酸O. ΓΙΟ mM 天冬酰胺 O. 11 2. 75 mM 天冬氨酸 O. 03 O. 75 mM 半胱氨酸 O. 03 O. 75 mM 谷氨酸O. 03 O. 75 mM 甘氨酸O. 05 1. 25 mM 組氨酸O. 03 O. 75 mM 異亮氨酸 O. 5 12. 5 mM 亮氨酸O. 24 6 mM 賴氨酸O. 2^5 mM 甲硫氨酸 O. 12^3 mM 苯丙氨酸 O. 2Γ5. 25 mM 脯氨酸O. 004^0.1 mM 絲氛酸O. 15 3. 5 mM 蘇氛酸O. 06 1. 5 mM 色氨酸O. 02 O. 5 mM 酪氨酸O. 03 O. 75 mM 纈氨酸O. 28 7 mM 谷氨酰胺 O. 8 20 mM 表皮生長因子1-10 mg/L 纖維細胞生長因子I1-10 mg/L 纖維細胞生長因子21-10 mg/L胰島素樣生長因子I1-10 mg/L白細胞因子1-10 mg/L血小板衍生生長因子1_10 mg/L胎盤生長因子1-10 mg/L干細胞因子1-10 mg/L血管內皮細胞生長因子1-10 mg/L胰島素I 25 mg/L轉鐵蛋白4"100 mg/L人血清白蛋白0.02、. 5 g/L生物素6 150mM氯化膽堿12 300mM葉酸1. 2 30mM輔酶 QlOO. 2"5mM地塞米松2 50 nMD-泛酸鈉I 25mM肌醇14 350mM煙酰胺ΓI OOmM吡哆醇鹽酸鹽O. 03、. 75mM核黃素0.11 2.75mM鹽酸硫氨O. 11 2. 75mM維生素 B12O. Γ2. 5mM腐胺二鹽酸鹽O. Γ2. 5mM維生素C2 50 mg/L維生素EO. 05 L 25 mg/L肝素鈉0.08 2 g/LD-葡萄糖3. 6 90 mM還原性谷胱甘肽 O. 0002、· 005 mg/L牛磺酸O. 00144 O. 36 g/Lβ-巰基乙醇O. 01 O. 25mg/L酚紅1. 62 40. 5 mg/L油酸O. 5 12. 5 mg/L`亞油酸O. 5 7. 5 mg/L硫辛酸O. 02^0. 5 mg/L脂質混合物O. 2^5 ml/L膽固醇I 25 mg/L乙醇胺12 300ml/L碳酸氫鈉2. 32 58 mM氯化鈣O. 0168 O. 42 mM氯化鉀O. 832 20. 8 mM氯化鎂O. 06 1. 5 mM 硫酸鎂O. 0814^2. 035 mM 氯化鈉24. 122 603. 55 mM 一水磷酸二氫鈉 O. 0906 2. 265 mM 磷酸氫二鈉 O. Γ2. 5 mM 丙酮酸鈉O. Γ2. 5 mM。
3.根據權利要求1所述的干細胞培養基，其特征在于，所述干細胞培養基以I升計算，包括以下組分 丙氨酸O. 05 mM 精氨酸2. 00 mM 天冬酰胺 O. 55 mM 天冬氨酸 O. 4 mM 半胱氨酸 O. 15 mM 谷氨酸O. 15 mM 甘氨酸O. 25 mM 組氨酸O. 15 mM 異亮氨酸 2. 50 mM 亮氨酸1. 20 mM 賴氨酸1. 00 mM 甲硫氨酸 O. 60 mM 苯丙氨酸1. 05 mM 脯氨酸O. 02 mM 絲氨酸O. 70 mM 蘇氨酸O. 30 mM 色氨酸O. 10 mM 酪氨酸O. 15 mM 纈氨酸1. 4 mM 谷氨酰胺 4 mM 表皮生長因子1-10 mg/L 纖維細胞生長因子I 1-10 mg/L 纖維細胞生長因子2 1-10 mg/L 胰島素樣生長因子I 1-10 mg/L 白細胞因子1-10 mg/L 血小板衍生生長因子 1_10 mg/L 胎盤生長因子1-10 mg/L 干細胞因子1-10 mg/L 血管內皮細胞生長因子1-10 mg/L 胰島素5 mg/L 轉鐵蛋白20 mg/L人血清白蛋白O.1 g/L 生物素30 mM 氯化膽堿60 mM 葉酸6 mM 輔酶QlOI mM 地塞米松10 nM D-泛酸鈉5 mM 肌醇70 mM 煙酰胺20 mM 吡哆醇鹽酸鹽O. 15 mM 核黃素O. 55 mM 鹽酸硫氨O. 55 mM 維生素B12O. 5 mM 腐胺二鹽酸鹽O. 5 mM 維生素C10 mg/L 維生素EO. 25 mg/L 肝素鈉0.4g/L D-葡萄糖18 mM 還原性谷胱甘肽0.001 mg/L 牛磺酸0.0072 g/L 巰基乙醇0.05 mg/L 酌■紅8. lmg/L 油酸2. 50 mg/L 亞油酸1. 5 mg/L 硫辛酸O.1 mg/L 脂質混合物I ml/L 膽固醇5 mg/L 乙醇胺60 ml/L 碳酸氫鈉11. 6 mM 氯化鈣O. 084 mM 氯化鉀4. 16 mM 氯化鎂O. 3 mM 硫酸鎂O. 407 mM 氯化鈉120.61 mM 一水磷酸二氫鈉O. 453 mM 磷酸氫二鈉O. 5 mM 丙酮酸鈉O. 5 mM。
4.一種如權利要求1所述的干細胞培養基的應用，其特征在于，將所述干細胞培養基用于培養干細胞。
5.根據權利要求4所述的干細胞培養基的應用，其特征在于，所述干細胞包括但不局限于人與哺乳動物來源的干細胞。
6.根據權利要求4所述的干細胞培養基的應用，其特征在于，所述干細胞從各種組織或器官里分離得到；所述組織與器官包括但不局限于骨髓、臍帶、脂肪組織、腦組織、視網膜、心臟、肝臟、肺以及皮膚。
7.一種采用如權利要求1所述的干細胞培養基的培養干細胞的方法，其特征在于，在進行培養干細胞前將用于促使干細胞貼壁的材料包被培養皿，依次所述加入所述干細胞培養基和干細胞。
8.根據權利要求7所述的培養干細胞的方法，其特征在于，所述用于促使干細胞貼壁的材料為膠原蛋白、明膠、多聚賴氨酸、纖粘連蛋白、層粘連蛋白、玻表粘連蛋白的一種或多種混合物。
全文摘要
本發明公開一種干細胞培養基及其應用和干細胞培養方法，所述干細胞培養基中不含血清，所述干細胞培養基包括氨基酸、維生素、鹽類、脂類、細胞因子和蛋白多肽。所述干細胞培養基適合于快速培養人及哺乳動物組織來源的干細胞，包括但不局限于脂肪間充質干細胞、骨髓間充質干細胞和臍帶血干細胞。該培養基能讓細胞的擴增速度提高3-5倍，但又不影響其分化的潛能。采用該干細胞培養基與普通培養基相比，不僅能更快速擴增不同來源的干細胞，延長了傳代次數，而且又能很好的保持干細胞的潛能性。
文檔編號C12N5/0789GK103060264SQ20121055794
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月20日 優先權日2012年12月20日
發明者劉小青, 應明, 陳光風, 鄭龍坡 申請人:上海市第十人民醫院