一種脂肪酶突變體及其用途
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，涉及一種脂肪酶突變體及其用途，該突變體是由野生型南極假絲酵母菌脂肪酶B（CALB）出發經過突變得到的，具體涉及一種脂肪酶突變體和其制備方法以及利用該脂肪酶突變體通過催化布洛芬類化合物的酯衍生物水解，動力學拆分得到具有光學活性的S構型布洛芬類化合物的方法。本發明中，野生型南極假絲酵母菌脂肪酶B通過突變得到具有改良性質的脂肪酶，該酶在畢氏酵母工程菌中表達，該脂肪酶包括與SEQ?ID?NO.02至少85%同一性的氨基酸序列，并且具有對應于SEQ?ID?NO.02的189位殘基為芳香族氨基酸殘基，對應于SEQ?ID?NO.2的190位殘基為非極性氨基酸殘基。本發明通過對南極假絲酵母菌脂肪酶B進行突變，提高了其對布洛芬類化合物的對映選擇性。
【專利說明】一種脂肪酶突變體及其用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，涉及一種脂肪酶突變體及其用途，該突變體是由野生型南極假絲酵母菌脂肪酶B (CALB)出發經過突變得到的，具體涉及一種脂肪酶突變體和其制備方法以及利用該脂肪酶突變體通過催化布洛芬類化合物的酯衍生物水解，動力學拆分得到具有光學活性的^構型布洛芬類化合物的方法。
【背景技術】
[0002]脂肪酶，即三酰基甘油酰基水解酶，是一種特殊的酯鍵水解酶，它可以在油水界面上催化油脂的水解反應，生成脂肪酸和甘油、甘油單酯或二酯。脂肪酶通常被用于在水相體系中催化酯類化合物的水解反應，在非水相體系中催化醇類化合物的酯化、轉酯反應化，在非水相體系中催化氨酰化反應等。iGurrent Opinion in Chemical Biology 2002,
6,145-150.)
南極假絲酵母(Candida antarctica)首先是在南極洲分離得到的，該南極假絲酵母可以產生兩種性質完全不同的脂肪酶，分別為南極假絲酵母脂肪酶A (CALA)和脂肪酶B(CALB)ο Patkar等人1993年成功分離純化分別得到了 CALA和CALB (.1ndian.J.Chem.1993 32B.76-80)。1994年，Uppenberg等研究出CALB自由酶的三維立體結構和氨基酸順序(SiiT/citfre 1994，2，293-308)，發現CALB由317個氨基酸殘基組成，分子量為33kD，與其它脂肪酶的氨基酸序列對比發現它們之間沒有明顯的同源性。1995年CALB被成功克隆并在米曲霉oryzae) {Canadian Journal of Botany 1995, 73,869-875.)中得到表達，該專利為諾和諾德公司所擁有。為了進一步研究CALB的性質及提高產量，CALB又陸續在許多種宿主中被克隆表達，如畢赤酵母G0ZcAi aAasioris)，釀酒酵母 iSacclmromyces cerevisiae)和大腸桿菌Cb7i)等。CALB 對水溶性和非水溶性物質都表現出較高的催化活性，是用于許多反應的催化劑，并且被用于例如立體選擇性轉化和聚酯合成，特別是對于仲醇的高對映選擇性使得CALB目前在生物技術的使用中成為最重要的酶。
[0003]天然的CALB仍存在一定的缺陷，如熱穩定性較差產量較低等，使其在生產實踐中的應用受到一定限制，成功修飾和改造CALB使其具有更加良好的性質是一個研究的熱點。2005年Magnusson等人在Trpl04處引入點突變，Trpl04Ala突變株對4-庚醇和5-壬醇的特異性比野生型酶分別提高了 270倍和5500倍2005, 6，1051-1056.)。2009年Seo等將CALB分別與蘋果酸脫氫酶、亞精胺腐胺周質結合蛋白質和肽基脯氨酰順反異構酶進行融合并在大腸桿菌中表達，融合表達的CALB溶解性得到大大提高，從而增加了其表達量(BBA- Proteins & Proteomics 2009, 1794, 519-525.)。
[0004]布洛芬類化合物(piOfens)是一類重要的藥物，主要用于治療疼痛、發燒、炎癥等，是非留體類抗炎藥物(NSAIDs)中重要的一類。這類藥物臨床已廣泛應用包括萘普生、布洛芬、酮洛芬、氟比洛芬等(圖1)。布洛芬類藥物的α位含有一個手性碳原子，存在一對光學異構體，盡管目前布洛芬類藥物以消旋形式存在，旦其中S構型布洛芬具有明顯較高的臨床效果。
[0005]利用生物催化方法合成布洛芬類化合物可通過多種生物催化劑催化的反應如水解、酯化、氧化、還原等反應來進行，其中通過脂肪酶催化的動力學拆分反應來制備光學純的布洛芬類化合物便是可行路線之一，如脂肪酶通過水解或醇解羧酸酯、酯化羧酸等反應來拆分已有相關報導(Crem泛挪，2011，13，2607.)，但是南極假絲酵母脂肪酶B對布洛芬類化合物的酯衍生物幾乎沒有或僅有很低的對映選擇性MicrobTech, 2006, 39, 924; J Org Chem, 1994, 59, 4410; Bi o techno I Bi oeng, 2001, 75,559.)，這就的需要對現有的方法路線進行改進，以提高脂肪酶對布洛芬類化合物的對映選擇性至理想水平。

【發明內容】

[0006]本發明的技術方案如下:通過對南極假絲酵母菌脂肪酶B進行突變，提高其對布洛芬類化合物的對映選擇性，使通過脂肪酶動力學拆分路線高效、可行。
[0007]本發明由野生型南極假絲酵母菌脂肪酶B {Candida antarctica lipase B)基因(SEQ ID N0.1)通過突變得到具有改良性質的脂肪酶，該酶在畢氏酵母工程菌中表達，該脂肪酶突變體，能夠將布洛芬類化合物的酯衍生物水解，動力學拆分得到具有光學活性的S構型布洛芬類化合物(圖2)。在本發明的實施方案中，該脂肪酶與天然存在的CALB野生型相比，在將底物水解為產物方面具有一個或多個改善的性質。其能夠以SEQ ID N0.02蛋白質(南極假絲酵母脂肪酶B, Candida antarctic lipase B,縮寫為CALB)的至少1.5倍活性將布洛芬類化合物的酯衍生物水解為至少70%對映體過量的S構型的布洛芬類化合物。
[0008]在進一方面，該重組脂肪酶包括與SEQ ID N0.02至少85%同一性的氨基酸序列，并且具有對應于SEQ ID N0.02的189位殘基為芳香族氨基酸殘基，對應于SEQ ID N0.2的190位殘基為非極性氨基酸殘基，這些氨基酸突變對于改善脂肪酶的活性劑對映選擇性至關重要。
[0009]在進一方面，所述脂肪酶突變體包含以下一項或多項突變，39殘基位為非極性氨基酸殘基；40位殘基為非極性氨基酸殘基；138位殘基為極性不帶電荷氨基酸殘基；139位殘基為極性不帶電荷氨基酸殘基；152位殘基為極性帶正電荷的氨基酸殘基；154位殘基為非極性氨基酸殘基；157位殘基氨基酸殘基為極性氨基酸殘基。
[0010]本發明中涉及的芳香族氨基酸為Phe、Tyr，非極性氨基酸為Ala、Val、Leu、lie、Pro、Phe、Trp> Met,極性不帶電荷氨基酸為Gly、Ser、Thr> Cys> Tyr、Asn、Gin,極性帶正電荷的氨基酸殘基為Lys、Arg、His。
[0011]進一方面，本發明的一些實施方案中，含有突變的脂肪酶變體針對布洛芬類化合物的酯衍生物展現出更高的活性及選擇性，這些突變包含下列一項或者多項突變，氨基酸序列 189 位殘基為 Phe (SEQ ID N0.4，10, 12)，190 位殘基為 Leu 或 lie (SEQ ID N0.6，8，10，12)，39 位殘基為 Ala 或 Val (SEQ ID N0.34)，40 位殘基為 Ala 或 Val (SEQ IDN0.34)，138 位殘基為 Ser、Thr 或 Cys (SEQ ID N0.14，16，18，36，38，40，42)，139位殘基為 Tyr、His 者 Arg (SEQ ID N0.14，16，36，38，40，42)，152 位殘基為 Lys 或His (SEQ ID N0.30，32)，154 殘基位為 Gly 或 Ala (SEQ ID N0.20，22，24，26，28，30，32，36，38，40，42)，157 位殘基為 Ser、Thr、Asp 或 Gly (SEQ ID N0.20，22，24，26，28，30，32，36，38，40，42)。
[0012]本發明的實施方式包括編碼所述脂肪酶變體的核酸，例如與編碼本發明所述CALB變體的核酸序列具有至少85%的序列同一性。本發明的相關實施方式包括包含這些核酸的載體及包含該類載體的宿主細胞。
[0013]本發明還包括脂肪酶突變體在動力學拆分手性羧酸酯類化合物中的應用。所述的手性羧酸酯類化合物為如式(I)所示的化合物，
【權利要求】
1.一種脂肪酶突變體，該突變體氨基酸序列具有與SEQ ID N0.02蛋白質氨基酸序列至少有85%序列同一性，并且對應于SEQ ID N0.2的189位殘基為芳香族氨基酸殘基，對應于SEQ ID N0.2的190位殘基為非極性氨基酸殘基。
2.如權利要求1所述的脂肪酶突變體，所述的芳香族氨基酸殘基為Phe或Tyr，優選Phe,所述的非極性氨基酸殘基為Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp或Met,優選Leu或He。
3.如權利要求2所述的脂肪酶突變體，包括如下一個或多個氨基酸殘基:39位為非極性氨基酸殘基；40位殘基為非極性氨基酸殘基；138位殘基為極性不帶電荷氨基酸殘基；139位殘基為極性不帶電荷氨基酸殘基；152位殘基為極性帶正電荷的氨基酸殘基；154位殘基為非極性氨基酸殘基；157位殘基氨基酸殘基為極性氨基酸殘基。
4.如權利要求3所述脂肪酶突變體，所述的39位殘基為Ala或Val；40位殘基為Ala或Val ; 138位殘基為Ser、Cys ; 139位殘基為Tyr、His者Arg ; 152位殘基為Lys或His ；154殘基位為Gly或Ala ；157位殘基為Ser、Thr> Asp或Gly。
5.如權利要求4所述脂肪酶突變體，其特征在于，138位殘基為Ser; 139位殘基為Tyr。
6.如權利要求4所述脂肪酶突變體，其特征在于，138位殘基為Ser，139位殘基為His。
7.如權利要求4所述脂肪酶突變體，其特征在于，154位殘基為Gly，157位殘基為Asp0
8.如權利要求4所述脂肪酶突變體，其特征在于，152位殘基為His；154位殘基為Gly ； 157位殘基為Ser。
9.如權利要求1所述脂肪酶突變體，其氨基酸序列如SEQID N0.4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40 或 42 所示。
10.一種核酸，其能夠編碼權利要求1-9中任一項所述的脂肪酶突變體。
11.如權利要求10所述的核酸，其氨基酸序列如SEQID N0.3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39 或 41 所示。
12.—種表達載體,該載體含有權利要求10或11所述的核酸且能在宿主細胞中進行表達。
13.—種宿主細胞,其含有權利要求10或11的核酸或權利要求12所述的的表達載體。
14.如權利要求13所述的宿主細胞，該宿主細胞是畢氏酵母。
15.權利要求1-9中任一項所述的脂肪酶突變體在動力學拆分手性羧酸酯類化合物中的應用。
16.如權利要求15所述的應用，其特征在于所述的應用包括下述方法:在pH5-9的磷酸鹽緩沖液溶液中，在權利要求1-9任一項所述的脂肪酶突變體的催化下，手性羧酸酯類化合物進行水解，生成光學活性手性羧酸。
17.如權利要求15或16所述的應用，其特征在于，所述的手性羧酸酯類化合物為如式(I)所示的化合物，
18.如權利要求16-17任一項所述的應用，其特征在于，所述的手性羧酸酯類化合物為布洛芬類化合物的酯衍生物，其結構如式(II)所述，布洛芬類化合物為布洛芬、氟比洛芬、阿利洛芬、非諾洛芬、萘普生或酮洛芬，
【文檔編號】C12N1/19GK103881992SQ201210561186
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月21日 優先權日:2012年12月21日
【發明者】游松, 秦斌, 張新, 梁萍, 穆矛, 王瀟瑩, 馬國振, 金旦妮 申請人:沈陽藥科大學