專利名稱：通過n端替換提高gh10木聚糖酶熱穩定性的方法
技術領域：
本發明涉及GHlO木聚糖酶改造及突變酶的高效表達方法，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一類酶的總稱。狹義上木聚糖酶特指 β _1，4-內切木聚糖酶(endo-β-1,4-xylanase, EC 3· 2·1. 8)。β-1,4-內切木聚糖酶可以從主鏈內部作用于木糖苷鍵，是木聚糖降解過程中最重要的酶之一。目前所克隆的木聚糖酶大多屬于F/10和G/11家族，第10家族木聚糖酶與第11家族相比具有底物特異性低、水解速度快、水解產物聚合度低，具有較大的研究和應用價值。木聚糖酶在造紙、食品、能源、飼料及環境等領域中具有廣闊的應用前景，特別是在紙漿生物漂白中的巨大應用潛力早已引起各界的高度關注。然而，目前工業生產的大多為原始菌直接發酵所得到的木聚糖酶，其最適反應溫度大多在45-55°C左右，且熱穩定性較差，大大制約了木聚糖酶在飼料、造紙等行業中高溫環境下的應用，如Alves-Prado等在巴西塞拉多地區的土壤中分離到一株高產木聚糖酶的細菌Lysinibacillussp. strain P5B1,該木聚糖酶的最適作用溫度為55°C ;Menon等從印度海洋化工研究院實驗鹽農場的沉積物中篩選分離出一株產耐鹽木聚糖酶的短小芽孢桿菌GESF1，并對該木聚糖酶進行了分離純化和酶學性質研究，該酶的最適作用溫度為40°C，雖然這些木聚糖酶其它酶學性質較好，但由于熱穩定性問題較難被應用在高溫制造行業。因此尋找有效途徑和手段，提高木聚糖酶在高溫環境中的穩定性及催化活性已成為國內木聚糖酶工業的當務之急。發明內容
本發明的目的是提供一種GHlO木聚糖酶Aus XynlOA熱穩定性改造及重組突變酶的高效表達和純化方法。·
為實現上述目的，本發明的技術方案提供了一種提高GHlO木聚糖酶最適溫度及熱穩定性的方法，其特征在于，依據Aus XynlOA(源于Aspergillus usamii E001)與耐熱木聚糖酶(源于Thermoascus Aurantiacus 751K6A)蛋白質序列比對及計算機預測分析結果，運用基因工程的方法將耐熱酶的N端區域序列替換Aus XynlOA的相應序列。獲得的突變酶命名為ATxlOAM，其對應的基因和蛋白質序列分別為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2。
所述的木聚糖酶的活性測定方法
于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH 4. 6、檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制的質量濃度為O. 5%的樺木木聚糖(Sigma, USA)溶液2. 4mL, 50°C預熱lOmin,在A管中加入O.1mL 適當稀釋的酶液，50°C準確反應15min;立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水楊酸(DNS) 試劑，在B管中再補加O.1mL酶液，A和B管均煮沸7min ;冷卻后各加去離子水5mL，搖勻； 540nm處以B管為空白對照測定A管吸光度值，并從木糖標準曲線上查出相應的還原糖 (以木糖計)含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義在本測定條件下，以每分鐘產生I μ mol還原糖所需的酶量定義為I個木聚糖酶活性單位(IU)。
所述突變酶的構建和表達方法
(I)突變酶的構建依據 Aus XynlOA 與來源于 Thermoascus Aurantiacus 751K6A 的耐熱木聚糖酶蛋白質序列比對及計算機預測分析結果選擇NRLTTGKNA(SEQ ID NO 3)作為擬替換序列，并依此設計突變弓 I物XynCHNRl (5' -CGGCCTTGATAATGGCAGCGTTCTTACCAGTAG TCAATC-3')。
提取包含Aus XynlOA基因的T載體(pUCm-T-Aus xynl0A)，依此為模板使用引物 AusXynlOA 基因的成熟肽引物 XynlOA-Fl (5' -GAATTCCAGGCTTCAGTGAGTATTGA-3 ')和引物XynCHNRl進行第一輪PCR，其后依pUCm-T-Aus xynlOA為模板，利用大引物PCR使用Xy nlOA-Rl(5/ -GCGGCCGCCTAGAGAGCATTTGCGATAG-3')和第一輪PCR產物作為引物進行第二輪PCR。將兩輪PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T 載體連接(pUCm-T-ATxlOAM)，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到突變酶的成熟妝基因序列。
(2)含編碼ATxlOAM成熟肽基因的表達質粒的構建
使用EcoR I和Not I對割膠回收的目的基因與pPIC9K分別進行雙酶切，割膠回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-ATxlOAM(圖1)，并對重組表達質粒進行序列測定。
(3) GSl 15/ATxIOAM重組子的構建、表達、產物純化及活性測定用Sal I對 pPIC9K-ATxlOAM 進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/ATxlOAM ;按照手冊上的標準流程進行誘導表達，用DNS法測定重組木聚糖酶活性；發酵液經冷凍離心、超濾、離子交換層析和凝膠過濾層析，獲得了電泳純的重組木聚糖酶。
本發明的有益效果本發明的目的是提供一種GHlO木聚糖酶Aus XynlOA改造及重組突變酶的高效表達和純化方法。依據Aus XynlOA與來源于Thermoascus Aurantiacus 751K6A的耐熱木聚糖酶蛋白質序列比對結果，運用基因工程的方法將耐熱酶的N末端區域序列替換Aus XynlOA的對應區域。獲得的突變酶命名為ATxlOAM。ATxlOAM較原酶最適溫度和熱穩定性都有了一定幅度的提高，具有一定的工業化生產和應用潛力以及經濟價值， 也為其它木聚糖酶的研究奠定了基礎。


圖1 :重組質粒pPIC9K_ATxlOAM示意圖具體實施方式
以下結合具體實施例，進一步闡述本發明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳細說明本發明，而不用于限制本發明的范圍。
實施例1突變酶的構建
提取包含Aus XynlOA基因的T載體(pUCm-T-Aus xynl0A)，依此為模板使用Aus XynlOA基因的成熟肽引物XynlOA-Fl和引物XynCHNRl進行第一輪PCR，其反應條件為 940C 5min ;2 個循環，94°C 30s, 45°C 30s, 72°C 70s ；28 個循環 94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s ；720C IOmin ;10°C保存；其后依pUCm-T-AusxynlOA為模板，利用大引物PCR使用XynlOA-Rl (5' -GCGGCCGCCTAGAGAGCATTTGCGATAG-3')和第一輪 PCR 產物作為引物進行第二輪 PCR， 其反應條件為94°C 5min ；2 個循環，94°C 30s, 45 °C 30s, 72 °C 70s ；28 個循環 94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 70s ；72°C IOmin ;10°C保存。將兩輪PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T載體連接(pUCm-T-ATxlOAM)，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到突變酶的成熟肽基因序列。
實施例2含編碼ATxlOAM成熟肽基因的表達質粒的構建
使用EcoR I和Not I對割膠回收的目的基因與pPIC9K分別進行雙酶切，酶切時間為4h，割膠回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下連接過夜(> 12h)，得到重組質粒 pPIC9K-ATxlOAM(圖1)，并對重組表達質粒進行序列測定。
實施例3GS115/ATx IOAM的構建、表達、產物純化及活性測定
用Sal I對pPIC9K-ATxlOAM進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GSl 15/ATx IOAM。該工程菌用O. 5%甲醇誘導72h，DNS法測得發酵液中重組木聚糖酶活性達521IU/mL。離心上清液為重組木聚糖酶粗酶液，經截留分子量為IOkDa的超濾膜濃縮,再經DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析和Sephadex G-75凝膠過濾層析純化，純化后經SDS-PAGE檢測為單一條帶，并顯示重組木聚糖酶分子量為42kDa。該重組木聚糖酶最適作用溫度55°C，較原酶提高了 10°C，60°C下保 溫IOmin殘余酶活仍大于40%。
權利要求
1.一種改造后的源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001、歸屬于GHlO家族的木聚糖酶基因ATxlOAM，其對應的基因和蛋白質序列分別為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。
2.突變酶的構建方法 依據Aus XynlOA與來源于Thermoascus Aurantiacus 751K6A的耐熱木聚糖酶蛋白質序列比對結果選擇NRLTTGKNA(SEQ ID NO 3)作為擬替換序列，并依此設計突變引物XynCHNRl(5' CGGCCTTGATAATGGCAGCGTTCTTACCAGTAGTCAATC-3')； 提取包含Aus XynlOA基因的T載體(pUCm-T-Aus xynlOA)，依此為模板使用引物AusXynlOA 基因的成熟肽引物 XynlOA-Fl (5 ' -GAATTCCAGGCTTCAGTGAGTATTGA-3 ')和引物XynCHNRl進行第一輪PCR，其后依pUCm-T-Aus xynlOA為模板，利用大引物PCR使用XynlOA-Rl (5' -GCGGCCGCCTAGAGAGCATTTGCGATAG-3')和第一輪PCR產物作為弓I物進行第二輪PCR ;將兩輪PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T載體連接(pUCm-T-ATxlOAM)，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序，得到突變酶的成熟妝基因序列。
3.ATxIOAM表達質粒的構建、表達及純化 使用EcoR I和Not I對割膠回收的目的基因與PPIC9K分別進行雙酶切，割膠回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-ATxlOAM，并對重組表達質粒進行序列測定； 用Sal I對pPIC9K-ATxlOAM進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/ATxlOAM ;按照手冊上的標準流程進行誘導表達，用DNS法測定重組木聚糖酶活性；發酵液經冷凍離心、超濾、離子交換層析和凝膠過濾層析，獲得了電泳純的重組木聚糖酶。
全文摘要
本發明的目的是提供一種GH10木聚糖酶Aus Xyn10A熱穩定性改造及重組突變酶的高效表達和純化方法。依據Aus Xyn10A(源于Aspergillus usamii E001)與耐熱木聚糖酶(源于Thermoascus Aurantiacus 751K6A)蛋白質序列比對結果，運用基因工程的方法將耐熱酶的N末端區域序列替換Aus Xyn10A的對應序列。獲得的突變酶命名為ATx10AM。實驗結果表明突變后該酶的最適溫度和熱穩定性有了明顯的提高，作為一種耐熱型的酶制劑，該木聚糖酶具有較大的工業化生產潛力和經濟價值。
文檔編號C12N15/81GK102994529SQ201210562519
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月24日 優先權日2012年12月24日
發明者鄔敏辰, 汪俊卿, 殷欣, 李劍芳 申請人:江南大學