水稻耐熱基因tog1及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了水稻耐熱基因TOG1及其編碼蛋白。TOG1基因是下列核苷酸序列之一：1)SEQ?ID?No：1所示的DNA序列；2)與SEQ?ID?No：1所示的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。TOG1是具有SEQ?ID?No：2所示的氨基酸序列的蛋白質，或者是將SEQ?ID?No：2所示氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ?ID?No：2所示的氨基酸序列相同的活性的由SEQ?ID?No：2衍生的蛋白質。本發明還公開了通過提高TOG1表達量改善植物耐熱性狀并有效增加產量的方法。
【專利說明】水稻耐熱基因TOG1及其應用
發明領域
[0001]本發明屬于植物基因工程領域。具體地，本發明涉及一種賦予水稻高溫耐受性狀的增產基因TOGl (Thermaltolerant Growthl)，該基因的功能片段，該基因所編碼的蛋白質及其功能類似物，以及含有所述TOGl基因核苷酸序列的載體和含有該基因核苷酸序列或該載體的宿主細胞；另外，本發明還涉及一種培育具有提高的耐熱性的植物的方法。
【背景技術】
[0002]作為廣泛種植于熱帶、亞熱帶和溫帶的農作物，水稻的理想生長溫度為33攝氏度
[1]。34°C的高溫會造成明顯的水稻減產[2]，高于理想生長溫度5°C的高溫會對植物在細胞及代謝水平造成劇烈的負面影響[I]。然而在水稻育種過程中，耐熱性狀卻長期被人們所忽視，從而造成了目前優質耐熱種質資源極為有限。由于耐熱和增產往往密切相關，耐熱品種的培育無疑會在增加水稻適應性的基礎上進一步增加畝產量。
[0003]而另一方面，由于植物的耐熱機理極為復雜，本領域的研究一直倍受關注。除了生理水平的適應調節，以HSP70為代表的熱激蛋白蛋白家族能夠作為分子伴侶有效的保護蛋白在高溫下正常折疊[3，4，5]。而在另一層面，組蛋白H2A.Z也參與對高溫的感知，并介導轉錄水平的廣泛應答[6]。因此，植物對高溫逆境的應答及耐受顯然受多重途徑調控。
[0004]DEAD-box RNA解旋酶家族廣泛存在于幾乎所有生命體中[7]。該家族在氨基酸序列上具有9個極其保守的功能區[8]，從而賦予其非常保守的基本解旋功能[9]。而另一方面，該家族在長期進化過程中分化出參與多種生命進程的各種功能，包括mRNA的轉錄、剪接、運輸和翻譯以及rRNA前體的加工等[7]。所有上述進程都需要保證錯誤折疊的RNA解旋并正確折疊成特定的構象，DEAD-box RNA解旋酶正是通過其解旋異構活性確保了各種RNA的正確折疊，因此本領域的研究者們越來越傾向于將其定義成RNA伴侶[10]。大量的研究證據已經表明RNA伴侶在細菌的抗逆機制中發揮了關鍵作用[10]。同樣，植物RNA在冷、熱、鹽及氧化脅迫下的正確折疊高度依賴于RNA伴侶的參與[10]。
[0005]本發明鑒定的水稻耐熱因子TOGl為DEAD-box RNA解旋酶中的一種，與已知在酵母rRNA前體加工過程中發揮了關鍵性作用的Rrp3 [ref.11]有很高的同源性，該基因的正常表達保證了水稻對高溫一定程度的耐受性，通過基因工程改造適度提高其表達量能夠進一步提高水稻的耐熱性，從而達到增產的目的。

【發明內容】

[0006]因此，本發明的一個目的是提供一種水稻耐熱基因及其編碼的水稻耐熱因子。本發明的另一個目的是提供一種培育具有提高的耐熱性的植物(例如，水稻品種)的方法。
[0007]本發明人克隆了水稻的耐熱基因TOGl，由于該基因編碼含DEAD-box結構域的RNA解旋酶，故而其被命名為DEAD-box RNA解旋酶基因。
[0008]由本發明人發現并鑒定的水稻的耐熱基因TOGl編碼的水稻耐熱因子名稱縮寫為TOGl (命名為DEAD-box RNA解旋酶)，是具有SEQ IDNo:2所示的氨基酸序列的蛋白質，或者是將SEQ ID No:2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID No:2所示的氨基酸序列相同的活性的由SEQ ID No:2衍生的蛋白質。優選地，其中所述“相同的活性”是指RNA解旋酶活性，具體是指與SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的RNA解旋酶活性相同的RNA解旋酶活性。
[0009]SEQ ID No:2所示的氨基酸序列是由472個氨基酸組成的蛋白質。
[0010]本發明人發現并鑒定的水稻耐熱因子TOGl的編碼基因T0G1，是下列核苷酸序列之一:
[0011]I) SEQ ID No:1 所示的 DNA 序列;
[0012]2)與SEQ ID No:1所示的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能的蛋白質的核苷酸序列。
[0013]優選地,上述“相同功能”是指RNA解旋酶活性,具體是指與SEQID No:1所示的DNA序列編碼的DEAD-box RNA解旋酶相同的RNA解旋酶活性。
[0014]序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列由4746個堿基組成。
[0015]優選地，所述水稻耐熱基因TOGl是編碼如下蛋白質(a)和(b)的基因:
[0016](a)具有SE Q ID No:2所不的氣基酸序列的蛋白質；
[0017](b)將SEQ ID No:2所示的氨基酸序列經過一個或多個氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID No:2所示的氨基酸序列相同的活性的由SEQ ID No:2衍生的蛋白質。
[0018]本領域技術人員應該理解，利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發明所提供的TOGl基因導入植物細胞，或者對SEQ ID No:3所示TOGl基因前導序列區進行改造從而改變TOGl表達量，比如插入增強元件或刪除抑制元件，可獲得耐熱性狀改變的細胞系及植株。本發明的基因在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強啟動子或誘導型啟動子。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記或具有抗性的抗生素標記物。攜帶有本發明TOGl基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電導等常規生物技術方法導入植物細胞，被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，優選禾本科植物，更優選水稻。本發明的基因對培育耐熱植物新品種，特別是培育耐熱水稻新品種具有重要意義。當本發明的基因被用于改變水稻耐熱性狀時，可采用以下方法:(I)將本發明的水稻耐熱基因TOGl克隆到植物轉化載體中；
(2)將所構建的植物轉化載體轉化可再生水稻組織(或器官)并使本發明的水稻耐熱基因在轉化的組織中表達；(3)將被轉化的組織(或器官)培養成植株。
[0019]更具體地，本發明提供以下各項:
[0020]1、一種賦予水稻耐熱性狀的DEAD-box RNA解旋酶TOGl，其為具有SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的蛋白質，或者是將SEQ ID No:2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID No:2所示的氨基酸序列相同的活性的由SEQ IDNo:2衍生的蛋白質。
[0021]2、根據第I項所述的DEAD-box RNA解旋酶T0G1，其特征在于:其是具有SEQ IDNo:2所不的氣基酸序列的蛋白質。
[0022]3, TOGl的編碼基因，其是下列核苷酸序列之一:
[0023]I) SEQ ID No:1 所示的 DNA 序列；[0024]2)與SEQ ID No:1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能的蛋白質的核苷酸序列。
[0025]4、根據第3項所述的基因，其特征在于:所述TOGl的編碼基因是SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。
[0026]5、一種含有第3或4項所述的基因或其片段的載體。
[0027]6、根據第5項所述的載體,其為植物表達載體,優選為適于在水稻中表達的載體。
[0028]7、根據第6項所述的載體，其為PCAMBIA1300。
[0029]8、一種宿主細胞，該細胞含有第3或4項所述的基因或其片段，或者含有第5-7項任一項所述的載體。
[0030]9、根據第8項所述的宿主細胞，所述細胞選自大腸桿菌細胞、農桿菌細胞或植物細胞。
[0031]10、一種培育具有提高的耐熱性的植物的方法，所述方法包括用第5-7項任一項所述的載體轉化所述植物的細胞或組織，并且將轉化的植物細胞或組織培育成植株。
[0032]11、根據第10項所述的方法，其中所述轉化通過農桿菌介導法或基因槍法進行。
[0033]12.根據第10或11項所述的方法，其中所述植物為禾本科植物，優選水稻。
[0034]13.根據權利要求10所述的方法，其中所述方法還提高轉基因植物的產量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]從下面結合附圖的詳細描述中，本發明的上述特征和優點將更明顯，其中:
[0036]圖1、togl與野生型中秈3037的表型比較。
[0037]水稻材料分別種植于北京和揚州的5月至9月以及海南的12月至4月。
[0038]標尺:20厘米。
[0039]圖2、不同溫度下togl與野生型中秈3037的種子萌發與幼苗生長。
[0040]標尺:3厘米。
[0041]圖3、TOGl基因的定位及候選基因確定。
[0042]圖4、TOGl 基因的 DNA 序列(SEQ ID No:1)。
[0043]圖5、TOGl基因編碼的氨基酸序列(SEQ ID No:2)。
[0044]圖6、包含TOGl基因啟動子的前導序列(SEQ ID No:3)。
[0045]圖7、TOGl基因功能互補及過表達載體圖譜。
[0046]圖8、T0G1基因功能互補實驗驗證，左圖為野生型(WT)水稻植株，右圖為互補突變體(togl+TOGl)。
[0047]標尺:20厘米。
[0048]圖9、TOGlRNAi植株與野生型比較。
[0049]植株種植于北京的5月至9月。
[0050]標尺:20厘米。
[0051]圖10、 T0G1RNA解旋活性體外驗證。
[0052]泳道I為雙鏈RNA底物，泳道2為與TOGI孵育后的RNA底物。
[0053]圖11、TOGl過表達植株與野生型比較。
[0054]a、過表達型(TOGl-ox)與野生型幼苗(WT)在37°C高溫下的生長情況。[0055]標尺:5厘米。
[0056]b、過表達型與野生型在北京5月至9月的自然生長情況。
[0057]標尺:20厘米。
[0058]C、北京自然環境生長(5月至9月，平均日最高溫度約為30°C)的過表達型(TOGl-ox)與野生型(WT)的單株結實。
[0059]圖12、北京自然環境生長的過表達型(TOGl-ox)與野生型(WT)的單株結實⑷和分蘗數目⑶統計。
[0060]圖13、北京自然環境生長的過表達型(TOGl-ox)與野生型(WT)中TOGl的表達量。【具體實施方式】
[0061]以下通過實施例來進一步闡明本發明。但是應該理解，所述實施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發明的范圍和精神。
[0062]一、水稻耐熱基因的分離和遺傳分析
[0063]本發明中進行圖位克隆研究的高溫敏感矮化水稻togl來自秈型水稻品種中秈3037自發突變。當togl種植于日最高溫低于30°C的涼爽環境時，其形態特征與野生型無異；而當生長于較多天數日最高溫高于30°C的夏季天氣時，togl葉片變細，明顯矮于野生型，結實率大幅降低；生長于更加炎熱的揚州一帶夏季天氣時，togl更加矮化并失去結實能力(圖1)。保持其它條件相同，對比不同溫度下的種子萌發和幼苗生長的實驗進一步確定了 togl為溫度敏感突變體(圖2)。togl和正常水稻品種進行正交和反交，所有Fl植株均不表現高溫矮桿。而在雜交組合的F2代分離群體中，正常的和高溫矮桿植株呈典型的3:1分離(320: 96)。這一結果表明togl突變體性狀受單隱性基因控制。
[0064]二、圖位克隆水稻耐熱基因TOGl
[0065]為了克隆TOGl基因，本發明人首先將純合的高溫敏感突變體togl和中花11進行雜交，獲得的F1代自交得到F2群體，對其中645個F2隱性個體(具有高溫敏感表型的F2代個體)進行TOGl基因的初步定位。如圖3所示,應用Sequence Tagged Site(STS,序列標簽位點)分子標記，利用PCR的方法，發現位于第3號染色體上的STS標記PU P2、P3、P4、P5、P6、P7(表1)與突變位點在位置上具有明顯的連鎖性。突變位點和P4之間的交換單株，絕大多數在突變位點和P1、P2、P3之間也進行交換，而突變位點和P5之間的交換單株，絕大多數包含在突變位點和P6、P7之間的交換單株中。同時突變位點和P4之間的交換單株與突變位點和P5之間的交換單株不同，因此推斷突變基因可能位于標記P4和標記P5之間的區域。在此基礎上，進一步擴大突變體togl和中花11的雜交組合，獲得了包含1272株突變單株的F2分離群體用于TOGl精細定位。參照已經完成的水稻基因組序列(http://WWW.tigr.0rg/tdb/e2kl/osal/ 和 http://btn.genomics, org.cn)，對粳稻和秈稻的序列進行比較，利用序列差異發展了 3個新的STS分子標記(表1)。最終將TOGl精細定位于BAC克隆BAC5:AC133930標記P8和PlO之間，這兩個標記之間的物理距離約為25kb。利用水稻基因組注解數據庫 RiceGAAS(http://ricegaas.dna.affrc.g0.jp/rgadb)分析表明，25kb區域內有4個功能注釋的基因，我們將這4個基因進行DNA序列測定，比較了突變體和野生型序列，發現其中三個基因在突變體中的序列都與野生型的一致，只有一個編碼DEAD-boxRNA解旋酶的基因即0s03g46610發生了突變，該基因在第一個外顯子的第140位的核苷酸處發生了一個單堿基的置換即G — T，導致該處的氨基酸由一個甘氨酸轉變成一個纈氨酸。因此，我們將DEAD-box RNA解旋酶基因確定為目標基因，命名為TOGl。利用水稻基因組注解數據庫RiceGAAS信息表明，該基因全長為4746bp，mRNA的全長為1817bp，共有13個外顯子，12個內含子，⑶S區長度為1419bp，共編碼472個氨基酸。該基因在KOME (http://cdnaOl.dna.affrc.g0.jp/cDNA)水稻日本晴的cDNA數據庫有完整的cDNA序列，登錄號為AK067769。包含該基因完整的ORF序列，編碼的氨基酸序列和包含該基因啟動子序列的2kb前導序列分別見附圖4、5、6。
[0066]表1用于TOGl定位的分子標記
[0067]
【權利要求】
1.一種賦予水稻耐熱性狀的DEAD-box RNA解旋酶TOGl，其為具有SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的蛋白質，或者是將SEQ ID No:2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQID No:2所示的氨基酸序列相同的活性的由SEQ ID No:2衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的DEAD-boxRNA解旋酶T0G1，其特征在于:其是具有SEQ IDNo:2所不的氣基酸序列的蛋白質。
3.TOGl的編碼基因，其是下列核苷酸序列之一: 1)SEQ ID No:1所示的DNA序列； 2)與SEQID No:1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能的蛋白質的核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的基因，其特征在于:所述TOGl的編碼基因是SEQID No:l所示的核苷酸序列。
5.一種含有權利要求3或4所述的基因或其片段的載體。
6.權利要求5所述的載體，其為植物表達載體，優選為適于在水稻中表達的載體。
7.根據權利要求6所述的載體，其為PCAMBIA1300。
8.一種宿主細 胞，所述細胞含有權利要求3或4所述的基因或其片段，或者含有權利要求5-7任一項所述的載體。
9.根據權利要求8所述的宿主細胞，所述細胞選自大腸桿菌細胞、農桿菌細胞或植物細胞。
10.一種培育具有提高的耐熱性的植物的方法，所述方法包括用權利要求5-7任一項所述的載體轉化所述植物的細胞或組織，并且將轉化的植物細胞或組織培育成植株。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述轉化通過農桿菌介導法或基因槍法進行。
12.根據權利要求10或11所述的方法，其中所述植物為禾本科植物，優選水稻。
【文檔編號】C12N5/10GK103898078SQ201210574391
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月26日 優先權日:2012年12月26日
【發明者】薛勇彪, 王冬, 程祝寬, 覃寶祥, 張玉娥 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所