專利名稱：耐熱纖維素酶基因、重組工程菌、耐熱纖維素酶及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程領域，具體涉及來源于閃爍桿菌屬(Fenz/ctojbacteA7'um)細菌的耐熱 纖維素酶基因、耐熱纖維素酶、重組載體、生產耐熱纖維素酶的基因工程菌，以及該耐熱纖維 素酶在纖維加工等領域的應用。
背景技術：
纖維素是一種纖維狀、堅韌的、水不溶的物質，廣泛存在于植物的細胞壁中。纖維素無 疑是地球上最豐富的有機化合物。自然界纖維素主要來源有棉花、麻、樹木、野生植物等等， 此外還有很大一部分來源于各種植物的莖桿，如麥稈、稻草、高粱稈、甘蔗渣等等。纖維素是 植物的主要支持物。與淀粉一樣，纖維素也是一種多糖，其分子量介于5.0x104到4.0"09 之間，大致相當于8.0x10、1.0x10"個葡萄糖殘基。纖維素分子由許多p-D-葡萄糖分子以p (1—4)糖苷鍵連接而成的直鏈。直鏈間彼此平行，鏈間葡萄糖的羥基之間極易形成氫鍵，使 得完整的纖維素具有高度不溶于水的性質。
纖維素不能被大多數動物消化，這是因為纖維素是葡萄糖單元通過(3 (1—4)糖苷鍵連接 構成的，而大多數動物體內只有水解a糖苷鍵的水解酶。 一些動物可以借助消化道內的共生 微生物來消化纖維素，例如反芻動物(牛、羊、駱駝等等)，有一個瘤胃結構，瘤胃中的微生 物可以分泌纖維素酶，幫助反芻動物消化纖維素類的食物。
大量的纖維素酶來源于微生物。纖維素酶可以分為內切纖維素酶、外切纖維素酶和p-葡 萄糖苷酶，三類纖維素酶彼此協同作用，可以有效地水解天然纖維素。開發(fā)和使用高效、廉價 的纖維素酶制劑，是對纖維素進行利用的關鍵。目前工業(yè)上使用的纖維素酶大多是來源于真菌 發(fā)酵的產物，是一種中溫條件下發(fā)揮作用，同時含有三類纖維素酶的混合酶制劑，水解纖維素 的效率不夠好；同時，在現有的纖維素酶應用領域(例如織物處理、洗滌、柔化、人造絲加工、 紙張?zhí)幚淼?中，使用傳統的混合型纖維素酶制劑，可能會對纖維主體結構造成不必要的損傷， 不利于控制水解纖維素的工藝過程，所以，單一組分或者按比例使用多種單一組分的纖維素酶， 尤其是使用單一的內切纖維素酶組分，對于有效控制和改善生產工藝具有非同尋常的意義。
來源于嗜熱菌的耐熱纖維素酶，或者稱為嗜熱纖維素酶，由于具有較高的酶活力和熱穩(wěn) 定性，日益被人們所關注，成為纖維素酶基礎研究和開發(fā)新型纖維素酶制劑的熱點。
關于嗜熱酶，自1985年第一種嗜熱酶即Taq DNA聚合酶被成功地用于聚合酶鏈式反應 (PCR)后，生長在特殊高熱環(huán)境下的微生物正日益引起人們的重視。許多具有水解酶活性 的嗜熱酶(thermophilic enzyme, 55 - 80°C)相繼得到了開發(fā)，并在許多領域發(fā)揮了重要作用。 近年來，人們從海底熱流的嗜熱性古細菌中分離得到超級嗜熱酶(hyperthermophilic enzyme,
80- 113°C)，為現代酶工程技術展現了新的應用前景。嗜熱酶不僅具有化學催化劑無法比擬 的優(yōu)點，如催化效率高和底物專一性強，而且酶的穩(wěn)定性極好。因而它可以克服中溫酶 (mesophilic enzyme, 20 - 55°C)及低溫酶(psychrophilic enzyme, -2 - 20°C)在應用過程 中常常出現的生物學性質不穩(wěn)定的現象，從而使很多高溫化學反應過程得以實現，這將極大地 促進生物技術產業(yè)的發(fā)展，從而帶動技術水平和生活質量的提高。
利用嗜熱酶作為生物催化劑有如下優(yōu)點(1)酶制劑的制備成本降低。因為嗜熱酶的穩(wěn) 定性高，因而可以在室溫下分離提純和包裝運輸，并且能長久地保持活性。(2)加快了動力
學反應。隨著反應溫度的提高，分子運動速度加快，酶催化能力加強。(3)對反應器冷卻系 統的要求標準降低，因而減少了能耗。(4)提高了產物的純度。在嗜熱酶催化反應條件下(超 過70'C),很少有雜菌生存，從而減少了細菌代謝物對產物的污染。由于嗜熱酶的高溫反應活 性，以及對有機溶劑、去污劑和變性劑的較強抗性，使它在食品、醫(yī)藥、制革、石油開采及廢 物處理等方面都有廣泛的應用潛力。
分離自熱噴泉等自然極端熱環(huán)境的閃爍桿菌屬(Fe/v/Gto辦acte勿/n)細菌，屬于嗜熱真細 菌，從閃爍桿菌屬細菌中分離得到的嗜熱酶多具有很好的酶學性質和應用潛力。對多節(jié)閃爍桿 菌(Ferv/'cto6acteram noctost/m)基因組的分析，我們發(fā)現在此菌的基因組中可能包含幾種 嗜熱的纖維素酶基因。應用分子生物學技術，我們對其中一個纖維素酶基因進行了克隆和表達， 表達蛋白具有很高的水解羧甲基纖維素鈉的活力，進一步的酶學研究證實，這一蛋白是一種性 質優(yōu)良的耐熱內切纖維素酶。
由于嗜熱菌人工培養(yǎng)困難，生長周期較長，纖維素酶的含量很低，因此不利于直接利用 嗜熱菌來生產耐熱纖維素酶。將耐熱纖維素酶基因轉入可快速繁殖、培養(yǎng)條件簡單的常溫宿主 內，可有效地解決這些問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一是提供一種耐熱纖維素酶基因；
本發(fā)明的目的之二是提供由上述耐熱纖維素基因構建的重組質粒和重組工程菌； 本發(fā)明的目的之三是提供一種利用上述工程菌制備的穩(wěn)定性好、耐熱性強的耐熱內切纖維 素酶(FnCel5A);
本發(fā)明的第四個目的是提供上述耐熱纖維素酶在纖維素加工領域及諸如工農業(yè)、醫(yī)藥及科 學研究中的應用。
本發(fā)明的主要內容包括嗜熱細菌(FeAv/cfo6acte〃'umnocfosu/nstrain Rt17-B1)的培養(yǎng)、 基因組的提取、用PCR方法釣取目的基因、重組質粒的構建、重組質粒在宿主菌中的表達、 工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)、耐熱纖維素酶的收獲、提取、純化、活力測定及性質研究。
我們所研究的耐熱纖維素酶屬于嗜熱酶，它的基因來自于嗜熱真細菌(FeAv/GtobactenY;m noctost/m strain Rt17-B1 )。
我們將來自嗜熱真細菌(Fen//cfo6acten'um nodosum strain Rt17-B1)的耐熱纖維素酶前 體蛋白基因(基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，由其編碼的耐熱纖維素酶前體蛋白的 氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示)，去除信號肽序列后的耐熱纖維素酶成熟蛋白基因(其核 苷酸序列如SEQ ID NO 3所示，由其編碼的耐熱纖維素酶成熟蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N04所示)裝載在pET-11a (Novagen公司產品，質粒圖譜參見圖2A,克隆/表達區(qū)域的核 酸序列參見圖2 C)或pET-15b (Novagen公司產品，質粒圖譜參見圖2 B，克隆/表達區(qū)域 的核酸序列參見圖2 D)載體上，得到兩個重組質粒pCel5A和pNHCel5A，然后轉入到大 腸桿菌E co//'strain BL21-CodonPlus (DE3)-RIL (Stratagene公司產品)宿主中，得到兩株 工程菌BLR Cel5A和BU=nNHCel5A。這兩種工程菌經發(fā)酵培養(yǎng)、純化得到了大量表達的耐 熱纖維素酶，分別為耐熱纖維素酶成熟蛋白fnCel5A (其氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示) 和蛋白N-末端加有His，tag的耐熱纖維素酶重組蛋白FnNHCel5A (其氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示，對應的耐熱纖維素酶重組蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示)。
本發(fā)明所涉及的工程菌(BLFnCel5A、 BLFnNHCel5A菌株)的特征與大腸桿菌 (￡sc/jen'cWaco//') BL21菌株基本相同，具體描述如下
(1) 菌體形態(tài)特征直桿狀，菌體大小為(1."M.5)[jmx2.0 6.0tJm,單個或成對。革蘭氏 陰性。以周生鞭毛運動或不運動，可參見圖七；
(2) 培養(yǎng)特征兼性厭氧，具有呼吸和發(fā)酵兩種代謝類型。在營養(yǎng)瓊脂上的菌落光滑、 低凸、濕潤、灰色、表面有光澤、全緣，在生理鹽水中容易分散；
(3) 生理生化特征化能有機營養(yǎng)；氧化酶陰性，乙酸鹽可以作為唯一碳源利用，檸檬 酸鹽不能利用；葡萄糖和其它糖類發(fā)酵產生丙酮酸，在進一步轉化為乳酸、乙酸和甲酸，甲酸 部分可被甲酸脫氫酶分解為等量的C02和H2。
進一步，經過基因重組、突變、序列拼接、嵌合等手段獲得的衍生體、變異體，其基因中 含有與SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列有60%以上的同源 性，進一步優(yōu)選至少為80。/。同源性，更優(yōu)選至少為90%同源性，甚至更優(yōu)選至少為95%的同 源性。
進一步，經過分子生物學、基因工程等手段獲得的衍生蛋白、變異體蛋白，其氨基酸序列 與SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列有60%以上的同源性， 進一步優(yōu)選至少為80%同源性，更優(yōu)選至少為90%同源性，甚至更優(yōu)選至少為95%的同源性。
如氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示的耐熱纖維素酶重組蛋白與氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示的耐熱纖維素酶成熟蛋白具有93%的同源性。
我們所獲得的耐熱纖維素酶FnCel5A、 R NHCel5A ( FnNHCel5A具備與FnCel5A相同 的性質，只是活力稍稍低一些)，能在高溫條件(70~80°C)下高效催化反應，而且酶的穩(wěn)定
性非常好，運用到生產中，有儲運成本低、加快動力學反應、對反應器冷卻系統要求標準低等 優(yōu)點。同時，f/ Cel5A、 F/ NHCel5A是具有單一內切酶活性的耐熱纖維素酶，在纖維素加工 領域具有廣泛的應用。
另外，該重組耐熱纖維素酶在很多領域也都具有非常可觀的應用潛力。例如可以應用 到水解植物來源的纖維素，將纖維素轉化成可供發(fā)酵的糖類，或者轉化成燃料乙醇等有價值的 化工產品。也可以將該重組耐熱纖維素酶，應用到洗滌劑、廢水處理、動物飼料等方面，或者 應用在紡織工業(yè)、再生紙生產、植物有效成分提取、果汁加工等工業(yè)中。


圖1: PCR產物電泳圖2: pET-11a與pET-15b質粒結構示意圖； 圖3:重組質粒pCel5A構建過程； 圖4:重組質粒pNHCel5A構建過程；
圖5: DNA電泳圖6:編碼FnCel5A的基因DNA測序結果； 圖7:工程菌BLFnCel5A菌體形態(tài)； 圖8:耐熱纖維素酶SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳帶； 圖9:耐熱纖維素酶FnCel5A最適催化反應溫度曲線； 圖10:耐熱纖維素酶FnCel5A最適催化反應pH值曲線； 圖11:耐熱纖維素酶F/ Cel5A在70'C下熱穩(wěn)定性曲線； 圖12:耐熱纖維素酶FnCel5A在75'C下熱穩(wěn)定性曲線； 圖13:耐熱纖維素酶FnCel5A在80'C下熱穩(wěn)定性曲線。
如圖1所示，泳道1為DL2000DNA Marker (購自TaKaRa生物公司)電泳結果，泳道 2為FnCel5A成熟蛋白序列基因擴增產物電泳結果；
如圖2所示，其中A圖為pET-11a質粒圖譜；B圖為pET-15b質粒圖譜；C圖為pET-11a 質粒中克隆/表達區(qū)域核酸序列示意圖；D圖為pET-15b質粒中克隆/表達區(qū)域核酸序列示意圖。
如圖5所示，泳道1代表質粒載體pET-11a線形DNA形式與編碼FnCel5A的基因DNA 片斷(約1kb)的電泳結果；泳道2代表質粒載體pET-15b線形DNA形式與編碼R Cel5A 的基因DNA片斷(約1kb)的電泳結果；泳道3代表DL2000 DNA Marker (Takara公司產 品)的電泳結果，作為一個標準的譜來對比衡量一同電泳的DNA的大小。
如圖6所示，其中A為R Cel5A的基因5'-端正向測序結果，B為FnCel5A的基因3'-端 反向測序結果；
如圖8所示,泳道1代表工程菌BLFnCel5A菌體破碎后的上清液，泳道2代表BLFnCel5A 菌體破碎后上清液60°C 10 min處理后的沉淀，泳道3代表泳道1樣品6CTC 10 min處理后的 上清液，泳道4代表F/iNHCel5A經過Ni-NTA親和層析后的蛋白帶，泳道5代表FnCel5A
經過離子交換層析后的蛋白帶。
具體實施方式
實施例1:
1、嗜熱細菌(Fenz/ctobacten'um noctost;m strain Rt17-B1)的培養(yǎng)
嗜熱細菌(多節(jié)閃爍桿菌，FeAv/cto/ acte"'t/mAJOctoswr7Rt17-B1)的來源DSM5306<
ATCC 35602 < B.K.C. Patel, Rt17-B1. Hot spring; New Zealand
培養(yǎng)條件是DSMZ Medium 144培養(yǎng)基，70°C，厭氧培養(yǎng)，具體操作為.-
根據DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)提供的培養(yǎng)基配方，配制細菌培養(yǎng)
DSMZ 144號培養(yǎng)基高溫厭氧細菌培養(yǎng)基
NH4CI NaCI
MgCI2'6H20
KH2P04
K2HP04
微量元素溶液(詳見下文)
FeS04*7H20
刃天青(Resazurin)
維生素溶液(詳見下文)
Na2S'9H20
酵母抽提物
水解蛋白胨
葡萄糖
補加蒸餾水至1000.000 ml 培養(yǎng)基在100%氮氣中配置，
0.900 g 0.900 g
0.400 g
0.750 g
1.500g 9.000 ml 3.000 mg 1 ■ mg 5,000 ml 1.000 g
3.000 g
10.000 g
5.000 g
葡萄糖單獨滅菌，最終pH值7.2 ~ 7.4。
微量元素溶液:
次氮基三乙酸
12.800 g
FeCI2'4H20 0.200 g
MnCI2'4H20 O，g
CoCI2'6H20 0.170 g
CaCI2'2H20 0.100 g
ZnCI2 0.100 g
CuCI2 0,020 g
H3B03 0,010 g
Na2Mo04'2H20 0,010 g
NiCI2'6H20 0.026 g
NaCI 1.000 g
Na2Se03'5H20 0.020 g
補加蒸餾水至1000.0 ml
最初配制時，溶解次氮基三乙酸，并用KOH調節(jié)至pH 6.5。
維生素溶液
生物素(維生素H) 2.000 mg
葉酸(維生素B ) 2.000 mg
維生素Be 10.000 mg
硫胺(維生素B1) *21"120 5.000 mg
核黃素 5.000 mg
煙酸(尼克酸) 5.000 mg
D-泛酸鈣 5.000 mg
維生素B^ 0.100 mg
p-氨基苯酸 5.000 mg
硫辛酸 5.000 mg
補加蒸餾水至1000.0 ml
將來自DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)的多節(jié)閃爍桿菌(Fen//'cto/)acterfi//r7 nodost/m Rt17-B1 DSMZ編號DSM 5306)，參照文獻(Patel BK, et al. Fervidobacterium nodosum new-genus new-species, a new chemoorganotrophic caldoactive anaerobic bacterium. Arch. Microbiol. 141:63-69， 1985.)進行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程可以概括為
(1)按DSMZ提供的配方，配制DSMZ 144號培養(yǎng)基(高溫厭氧細菌培養(yǎng)基)，培養(yǎng)基 在115 °C、 15 min的條件下進行高溫蒸汽滅菌處理；
(2〉按V/V-200:1向培養(yǎng)基中加入10%Na2S溶液；
(3) 向培養(yǎng)基中通入N2 (3 min以上)；
(4) 按1%的接菌量，接入Fe/v/'ctabacten'i/mnoctosum Rt17-B1種子菌液，然后密閉；
(5) 在6(TC條件下培養(yǎng)，直至達到理想的菌體密度。
2、 基因組的提取
將上面獲得的多節(jié)閃爍桿菌(FeAV/'oto/jacte〃u/77 noctosw/w Rt17-B1 DSMZ編號DSM 5306)的細菌培養(yǎng)物于10,000 rpm離心l分鐘，倒盡上清液，收集菌體沉淀，用細菌基因組 DNA提取試劑盒(本例中使用的是TIANGEN公司生產的細菌基因組DNA提取試劑盒，the bacteria genomic DNA purification kit),按照產品說明書提取基因組DNA，備用。
3、 目的基因的釣取 (1)引物設計
嗜熱細菌Fe/vWobacten'mn noctosu/n strain Rt17-B1的全基因測序工程己經完成 (Project ID: 16719 at US DOE Joint Genome Institute [Complete]),己在因特網上公布 (Genbank編號CP00071)。通過網上數據庫分析，在其基因組中含有幾段可能編碼纖維素 酶的基因。我們選擇了其中一個可能的纖維素酶基因(序列區(qū)域是1698601~1699632,具體 序列參見序列表SEQ ID N01，在本專利中，我們稱之為耐熱纖維素酶前體蛋白基因)作為 研究對象。
SEQ ID NO 1基因序列預計編碼343個氨基酸，其編碼的耐熱纖維素酶前體蛋白的氨基 酸序列如SEQ ID NO 2所示，通過SignalP 3.0軟件網上分析服務 (httD:〃www.cbs.dtu.dk/services/SianalPA,預測蛋白N-^的24個氨基酸是信號肽序列，去除 這個信號肽序列后得到耐熱纖維素酶成熟蛋白，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0 4所示， 對應編碼這個耐熱纖維素酶成熟蛋白的基因序列如序列表SEQ ID NO 3所示。
通過Pfam網站數據分析服務(^1 :/爾{301」3!16113.0「9)，預測這段基因編碼是一個屬于糖 基水解酶家族5 (glycosyl hydrolase family 5)成員的纖維素酶。根據Henrissat提出的糖基 水解酶命名法，我們把該酶的成熟蛋白命名為FnCel5A (氨基酸序列如序列表SEQ ID NO 4 所示)，把成熟蛋白N-端加有His*Tag的重組蛋白定名為NHFnCel5A (氨基酸序列如序列表 SEQIDN0 6所示)Cel表明該基因編碼的水解酶的最適底物是纖維素，"5"表示該基因編碼 的水解酶是屬于糖基水解酶第5家族，"A"表示該基因是本實驗從Fe/v/cto/)acten》m nodosum 中獲得的第一個屬于糖基水解酶第5家族的纖維素酶，Fn是Fen//'ctobacten'um noctostm 的 簡寫，NH表明在酶蛋白N-端加有His'Tag小肽。
根據該基因的序列特點，以及序列對應的表達蛋白的信號肽序列和成熟蛋白序列特點，我 們設計了兩段帶有限制性酶切位點的引物(上游引物CAG CGC CAT ATG GAC CAA AGT GTGAGTAA,劃線部分為A/cte I酶切位點；下游引物GAC GTC GGA TCC TTA TTT TCC
AAG TGC Ag,劃線部分為SamH I酶切位點)，委托大連TaKaRa生物公司合成這一對引物 用于釣取耐熱纖維素酶成熟蛋白基因(該基因編碼的耐熱纖維素酶成熟蛋白的氨基酸序列參見 SEQIDN0 4)，釣取目的基因釆取PCR擴增的方法。 (2)目的基因(SEQ ID NO 3)的PCR擴增和純化
在50pl Pfu或TaKaRa Ex Taq反應體系中(配制方法參見試劑說明書)，以上文所述的 F. noctosum Rt17-B1基因組DNA為模板，上游引物CAG CGC CATATG GAC CAA AGT GTG AGT AA和下游引物GAC GTC GGATCC TTA TTT TCC AAG TGC Ag兩條引物作為擴增引 物，通過PCR的方法進行擴增。
PCR反應條件預變性95'C 10分鐘熱循環(huán)條件是95°C 1分鐘，60'C 1分鐘，72'C 1 分鐘，反應進行30個循環(huán)；最后在72'C保溫延伸10分鐘。按照這樣的實驗設計，通過PCR 擴增的該基因全長是960bp,用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果如圖1中泳道2 所示。證實得到目的基因的DNA擴增產物后，使用PCR產物純化試劑盒(購自杭州維特捷 公司的PCR清潔試劑盒)對擴增產物進行DNA純化，.20'C保存，備用。
4、重組質粒的構建
(1)表達成熟耐熱纖維素酶蛋白的pCel5A重組質粒的構建(圖3)
將PCR擴增后的耐熱纖維素酶基因產物DNA純化，純化后的DNA依次用限制性內切酶 8an7HI和A/ctel進行酶切反應，實驗操作參照TaKaRa產品說明書。酶切完畢，加入適量載 樣液(6X上樣緩沖液，30mMEDTA、 36%甘油、0.05%二甲苯青、0.05%溴酚藍，與核酸溶 液按1: 5混合)，在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳，應用DNA凝膠回收試劑盒(購自杭州維特 捷公司DNA凝膠回收試劑盒)回收酶切后的DNA片段，為編碼耐熱纖維素酶基因的DNA片 斷。
應用同樣的方法酶切pET-11a質粒，然后用堿性磷酸酶(CAP)處理質粒，在0.8%瓊脂 糖凝膠中檢測線性質粒，并提純(應用DNA凝膠回收試劑盒(購自杭州維特捷公司DNA凝 膠回收試劑盒)回收酶切后的DNA片段)酶切后的質粒。
將上述回收的編碼耐熱纖維素酶基因的DNA片斷和酶切后的pET-11a質粒混合，在16'C 應用T4 DNA連接酶進行連接反應。將連接后的質粒轉入大腸桿菌XL菌株中，在含有 50-100mg/L抗生素氨芐青霉素(Amp)的固體瓊脂平皿上進行涂布，37'C靜止培養(yǎng)12小時 左右，直至出現陽性克隆的單菌落，選取單克隆細胞菌落，在加有氨芐青霉素抗生素的液體培 養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜。用質粒提取試劑盒提出質粒，再用限制性內切酶Wcte I和8amH I水解 質粒，然后經瓊脂糖電泳驗證，結果參見圖5所示，從圖中泳道1的結果我們可以看到，經 過雙酶切后，重組質粒重新被酶切成原pET-11a質粒和編碼F/ Cel5A的基因DNA，其結果與 圖1泳道2的結果相同，證明提取的質粒是我們所需的、連接有耐熱纖維素酶基因片段和表 達載體的質粒。對耐熱纖維素酶基因進行測序，結果與根據SEQ ID NO 3設計的結果一致， 證明得到了含有耐熱纖維素酶目的基因的重組質粒pCel5A。
(2) 表達N-端加有His，Tag肽段的耐熱纖維素酶重組蛋白的pNHCel5A重組質粒的構建(圖4) 操作基本與上面的pCel5A構建過程相同，只是使用的載體由pET-11a換成了 pET-15b。
(3) 測序
構建后的重組質粒pCel5A和pNHCel5A,委托上海生工生物公司進行序列測定。在對 本發(fā)明相應基因進行測序時，該所用的測序儀器為ABI PRISM 3730 ,測序試劑為 BigDye terminator v3丄ABI公司對儀器的性能說明為正常情況下，除了開始約10至30 個堿基，在650bp以內可以達到98.5%以上的準確率， 一般只有進行正反鏈(基因正向和反 向，或者稱基因的5'-端和3'-端)同時測序，在兩個序列完全吻合的情況下，才能確保所得序 列100%可靠。
如圖2C和圖2D，對pET-11a和pET-15b質粒中克隆/表達區(qū)域核酸序列的示意，耐熱 纖維素酶基因正向插入到A/cte I和8a/77H I酶切位點之間，可以應用引物T7 promoter primer #69348-3對插入基因的5'-端進行擴增、測序反應，對插入的耐熱纖維素酶基因的5'-端進行 正向測序，得到基因的正向序列測序結果；應用引物T7 terminator primer #69337-3對插入 基因的3'-端進行擴增、測序反應，對插入的耐熱纖維素酶基因的3'-端進行反向測序，得到基 因的反向序列測序結果。測序結果如圖6所示，其中圖6 (A)是從基因5'-端正向測序得到的 結果，應用分析軟件 Chromas 1.62 ( Technelysium Pty Ltd ， http:〃www.technelvsium.com.au/chromas.html)査看測序結果，圖6 (A)所示的測序譜圖 是從基因的啟動密碼子ATG開始的，也就是基因插入的酶切位點A/ofe I所識別的序列CATATG 的后3個核苷酸序列開始的，得到的基因5'-端核苷酸正向序列如圖6A所示。圖6 (B)是從 基因3'-端反向測序得到的結果，所示的測序譜圖是從基因的終止密碼子TAA的互補序列TTA 開始的，得到的核苷酸序列如圖6B所示，這是基因的反向序列，借助序列分析軟件，例如 FastPCR Professional (Primer Digital Ltd),按照核苷酸堿基互補原則，得到基因3'-端序列 的正向閱讀結果。雙向測序的結果經過拼接，得到基因序列與SEQIDN0 3序列一致，SEQ IDN0 3序列是源自SEQIDN01序列并且編碼F/ Cel5A成熟蛋白的序列。這樣的結果就證 實了兩個重組質粒所含的基因序列，可以分別表達SEQ ID NO 4所述氨基酸序列的成熟蛋白 FnCel5A，以及該成熟蛋白N-端加有His4ag肽段的重組蛋白F/ NHCel5A (其氨基酸序列表 如SEQ ID N06所示)。
(4) 重組質粒pCel5A和pNHCel5A所編碼表達的耐熱纖維素酶蛋白的異同。
將耐熱纖維素酶成熟蛋白基因序列SEQ ID NO 3，分別插入到pET-11a和pET-15b的克 隆/表達區(qū)域(參見圖2C、D)中的A/ctel和8amH l兩個酶切位點之間，構成了重組質粒pCel5A 和pNHCel5A。
參照pET-11a和pET-15b的克隆/表達區(qū)域序列結構特點，表達蛋白的序列將是rbs后面 第一個甲硫氨酸(Met,對應密碼子為atg)到SEQ ID NO 3中的最后一個終止密碼子(tea)。 這樣，pCel5A可以編碼表達的蛋白是FnCel5A成熟蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0 4所示； 而pNHCel5A可以編碼表達的重組蛋白，是SEQ ID NO 4編碼的成熟蛋白f"Cel5A的N-端加有His'Tag肽段的重組蛋白FnNHCel5A，其氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示。
F/ Cel5A和F/ NHCel5A兩種耐熱纖維素酶的基因序列基本相同，不同的是為了方便應用 鎳親和層析(Ni-NTAAgarose)對重組蛋白進行分離、純化，FnNHCel5A的N-端加有與鎳親 和層析材料有親和作用的His，Tag肽段。兩種耐熱纖維素酶的蛋白序列有93%同源性，都為 耐熱纖維素酶，兩者的性質基本相同。進一步的，按照理論預測，與FnCel5A序列(SEQ ID N04)有95。/o以上、90%以上、80%以上、甚至60%以上同源性的蛋白，也有著與FrtCel5A 相同或相近的纖維素酶的性質。
5、重組質粒在宿主細菌(&co//'sfra/A7BL21-CodonPlus(DE3)-RIL)中的表達
將含有目的基因的重組質粒轉入宿主菌中，宿主菌首選大腸桿菌(& co/Z)，最佳的選擇 是￡. co/,' sfra//7 BL 21-CodonPlus (DE3)-RIL。轉化有目的基因的￡. co// s的/力BL 21-CodonPlus (DE3)-RIL感受態(tài)細胞，在含有氨芐青霉素的固體平皿上進行涂布篩選，挑取 陽性轉化菌，置于5ml含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基的選擇可以是實驗室經常 使用的2YT、 LB培養(yǎng)基，37'C振蕩培養(yǎng)過夜；次日，按1 %的接種量取0.1ml飽和菌液加入 到10ml新鮮液體培養(yǎng)基中，37'C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)直到A咖為0.6 1時，加入異丙基硫代p-D-半乳糖苷(IPTG),終濃度為1 mmol/L， 28。C振蕩培養(yǎng)12-16小時，離心(10,000 rpm,1 min) 收集菌體，進行15。/oSDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，得到的電泳圖顯示在目的分子量附近有蛋白 帶，而且蛋白含量非常大同時，菌體沉淀用5-20倍體積的蒸餾水重懸，超聲波破碎后，得 到的菌體破碎液(內含表達的蛋白)，以羧甲基纖維素鈉鹽(CMC)作為底物，將的5^11% (w/v) CMC置于水浴鍋中預熱15min。加入5yl酶液(即菌體破碎液)，與底物充分混勻， 保溫5min;立即將樣品放入冰水浴中4'C 12000 rpm離心1min,取1ml DNS試劑加入500pl 反應液；沸水浴5min,冷水冷卻至室溫。每管加蒸餾水稀釋到10ml，讀取As2Q的吸光度值， 根據葡萄糖標準曲線計算^^應體系中產生的葡萄糖濃度。通過檢測反應體系中一定時間內生成 的還原糖的量來分析表達蛋白的纖維素酶活力。還原糖的生成量采用DNS法進行測量，實驗 操作參照文獻(Miller Gl_ (1959) Use of dinitrosalicyclic acid reagent for determination of reducing sugar, a'otechno/ B/oeng Symp 5:193-219)。酶蛋白濃度的測定采用Bradford檢測 法。經過測定，兩種重組菌株都可以大量表達具有纖維素酶活力的蛋白，說明得到了兩種可以
表達纖維素酶蛋白的重組工程菌菌株，分別是宿主菌中載有pCel5A重組質粒的工程菌 BLFnCel5A，可以表達耐熱纖維素酶成熟蛋白(定名為FnCel5A);還有宿主菌中載有 pNHCel5A重組質粒的工程菌BLFnNHCel5A，可以表達N-端加有His'Tag肽段的重組耐熱 纖維素酶蛋白(F/ NHCel5A)。
挑取本發(fā)明所涉及的工程菌少許，置于5 ml含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基 的選擇可以是實驗室經常使用的2YT、 LB培養(yǎng)基，也可以是工業(yè)發(fā)酵用培養(yǎng)基(如麥芽汁培 養(yǎng)基、玉米漿培養(yǎng)基等),37'C振蕩培養(yǎng)過夜;次日，按1 %的接種量將飽和菌液加入到100-200 ml新鮮液體培養(yǎng)基中，37'C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)直到A6oo為0.6 1時，加入異丙基硫代P-D-半乳 糖苷(IPTG)，終濃度為1 mmol/L， 28'C振蕩培養(yǎng)12-16小時，離心(6,000 rpm, 4'C, 15 min) 收集菌體。表達的耐熱纖維素酶蛋白以可溶蛋白的形式存在于菌體細胞中，破碎細胞即可得到 耐熱纖維素酶的粗酶產物。
6、 工程菌發(fā)酵及目的蛋白的誘導表達
挑取工程菌少許，置于50ml含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基的選擇可以是實 驗室經常使用的2xYT (配制每升培養(yǎng)基，應在900ml去離子水中加入16g胰化蛋白胨、10g 酵母提取物、5gNaCI，用5mol:1NaOH (約0.2ml)調pH值至7.0，用去離子水定容至1L， 在1.05kg/crr^高壓下蒸汽滅菌20min)、 LB (配制每升培養(yǎng)基，應在950ml去離子水中加入 10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCI，用5mo卜L"NaOH (約0.2ml)調pH值至7.0, 用去離子水定容至1L，在1.05kg/crT^高壓下蒸汽滅菌20min)培養(yǎng)基，也可以是工業(yè)發(fā)酵用 培養(yǎng)基(如麥芽汁培養(yǎng)基、玉米漿培養(yǎng)基等)，37'C振蕩培養(yǎng)過夜，制成種子液；將初步放大 的種子液以1 %的比例接入2 L的液體培養(yǎng)基中，37 'C 180 rpm/min條件下空氣搖床培養(yǎng)， 待菌體生長到對數期時(A咖為0.6 1)加入IPTG至終濃度達到1 mM，并降低搖床的溫度 為28°C ，對菌體進行誘導使其產生大量的目的蛋白，同時避免產生酶蛋白的包涵體,培養(yǎng)12-16 小時后即可收獲菌體。
7、 其他耐熱纖維素酶的表達方法
除了用上述的方法表達耐熱纖維素酶外，也可以采取其他生物技術手段進行表達。
可以通過將編碼耐熱纖維素酶蛋白的基因整合至宿主染色體上. 一般認為整合后DNA序 列可以在細胞中更加穩(wěn)定地維持。
宿主細胞不只局限于大腸桿菌細胞，也可以將耐熱纖維素酶的基因載入到其他類型的宿主 細胞中，來表達纖維素酶基因。宿主細胞可以是高等生物，例如動物、植物的細胞'但優(yōu)選其 為微生物細胞，例如細菌或真菌(包括酵母)細胞。
適當細菌的例子是革蘭氏陽性細菌，如枯草芽胞桿菌，乳酸桿菌，地衣芽胞桿菌，短芽
孢桿菌，嗜熱脂肪芽胞桿菌，嗜堿芽胞桿菌，解淀粉芽胞桿菌，凝結芽胞桿菌，環(huán)狀芽胞桿菌， 燦爛芽胞桿菌，巨大芽胞桿菌，蘇云金芽胞桿菌，淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌等；或者是革蘭 氏陰性細菌，如大腸埃希氏菌，假單孢菌等。通過例如原生質體轉化，或通過以本身己知的方 式使用感受態(tài)細胞即可實現細菌的轉化。
酵母細胞可以有利地選自糖酵母屬或裂殖酵母屬的種，例如釀酒酵母；也可以選擇畢赤酵 母、假絲酵母等酵母細胞。
真菌可以是屬于曲霉屬的種，例如米曲霉或黑曲霉；也可以是木霉屬的種，例如里氏木霉。 上述生物體或細胞，載有本發(fā)明涉及的耐熱纖維素酶基因后，同樣也可以表達、產生本發(fā) 明所涉及的耐熱纖維素酶蛋白；這樣的生物體就成為了能表達、生產耐熱纖維素酶的基因工程 菌、基因工程真核細胞、基因工程原核細胞、基因工程動物、基因工程植物、基因工程微生物 等。
實施例2:耐熱纖維素酶的純化流程圖
(1) 粗酶液的獲得
將上面描述的用IPTG誘導表達，培養(yǎng)12-16小時后的工程菌培養(yǎng)液6,000 rpm離心15 分鐘，菌體沉淀用5-20倍體積的蒸餾水重懸，超聲波破碎；將破碎液于60'C加熱處理10-30 分鐘，離心除去變性的大腸桿菌雜蛋白以及細胞碎片(12,000 rpm, 5 min),收集上清得粗酶 液。對應樣品應用SDS-PAGE (15%)蛋白電泳進行檢測，結構如附8中泳道1~3所 示泳道1是工程菌BLFnCel5A菌體破碎后的上清液，在大腸桿菌BL21菌體蛋白的背景下， 在與理論計算的FnCel5A蛋白質同等分子量大小的位置上，有一條蛋白含量非常大的蛋白電 泳帶，這就是大量表達的目的蛋白FnCel5A;泳道2是BLFnCel5A菌體破碎后的上清液經過 60'C、 10min處理后的沉淀，可以看到除了耐熱纖維素酶FnCel5A以外的其他絕大多數的大 腸桿菌BL21菌體內蛋白的電泳帶，這說明通過60'C、 10min的熱處理以后，菌體破碎液中 除了耐熱纖維素酶FnCel5A以外，其他絕大多數雜蛋白通過熱沉淀被除去了；泳道3是工程 菌BLFnCel5A菌體破碎后的上清液經過6(TC、 10min處理后，除去沉淀部分后的上清液， 可以看到通過熱處理，以沉淀的形式除去了大量的雜蛋白后，目的蛋白即耐熱纖維素酶 FnCel5A的含量得到明顯的提高，熱處理起到了初步純化蛋白的目的。
(2) 離子交換層析
載有pCel5A質粒的工程菌BLFnCel5A，表達耐熱纖維素酶的成熟蛋白(FnCel5A)，應 用離子交換層析(q Sepharose Fast Flow)對耐熱纖維素酶進行分離、純化。應用SDS-PAGE (15%)電泳檢測蛋白的純度，結果如圖8中泳道5所示，此時已經基本上看不到其他雜蛋 白的電泳帶了，電泳圖中只有大量的耐熱纖維素酶FnCel5A的電泳帶，說明經過分離、純化 后的耐熱纖維素酶FnCel5A蛋白，已經非常純了，達到了電泳純的純度級別。 (2) 親和柱層析
載有pNHCel5A質粒的工程菌BLFnNHCel5A，可以表達N-末端含有His，Tag的重組蛋 白(R)NHCel5A),應用鎳親和層析(Ni-NTA Agarose)對重組蛋白進行分離、純化。應用 SDS-PAGE (15%)電泳檢測重組蛋白的純度，結果如圖8中泳道4所示。此時已經基本上 看不到其他雜蛋白的電泳帶了，電泳圖中只有大量的耐熱纖維素酶F/7NHCel5A的電泳帶，說 明經過分離、純化后的耐熱纖維素酶F/7Cel5A蛋白，已經非常純了，達到了電泳純的純度級 別。
實施例3:重組耐熱纖維素酶的性質
本發(fā)明涉及到的耐熱纖維素酶FnCel5A和FnNHCel5A具有基本相同的性質，但也存在 細微的差別，下面主要以FnCel5A對耐熱纖維素酶的性質進行表述
(1) 水解羧甲基纖維素(CMC)的纖維素酶活性
以羧甲基纖維素鈉鹽(CMC)作為底物，應用本發(fā)明的耐熱纖維素酶對一定濃度的CMC 水溶液，在一定的理化條件下進行反應， 一定時間后通過檢測反應體系中生成的還原糖的量來 分析纖維素酶的活力。還原糖的生成量采用DNS法迸行測量，實驗操作參照文獻(MillerGL (1959) Use of dinitrasalicyclic acid reagent for determination of reducing sugar. 8/'oe叩Symp 5:193-219)。酶蛋白濃度的測定采用Bradford檢測法。
酶活力單位(U)的定義每分鐘催化分解底物產生1 pmol還原糖所需的酶量為1U。 酶比活力的定義每mg或每g蛋白質所含的酶活力(U/mg或U/g)。 實驗測定本發(fā)明所涉及到的纖維素酶，在高溫下表現出很高的水解CMC的活力(比活 力在800U/mg以上)，通常認為水解CMC的活力常用于表征內切(3-1，4-葡聚糖酶 (Endo-p-1，4-glucanase, EC 3.2.1.4)活力，所以初步確定本發(fā)明所涉及的酶是耐熱內切纖維 素酶。
(2) 耐熱纖維素酶最適反應溫度 反應溫度是影響酶催化活力的重要因素，尤其是耐熱酶在高溫下的反應活力遠遠高于低
溫。以CMC作為酶催化反應底物，我們考察了耐熱纖維素酶在pH 7.0的磷酸緩沖液中不同 溫度對酶活力的影響。在37'C-95'C的溫度范圍內測定耐熱纖維素酶的比活，結果如圖9所示， 當溫度達到8(TC時，該酶表現出最大催化活力。
(3) 耐熱纖維素酶的最適pH 環(huán)境pH值影響酶分子中帶電氨基酸的解離狀態(tài)和酶的構象，進而影響酶的催化活力。以
CMC作為底物，測定耐熱纖維素酶在pH4-8范圍內的比活，以pH為橫坐標，相對酶活為縱
坐標作圖，結果如圖10所示。結果表明，該酶的最適pH為5.8。
(4) 耐熱纖維素酶的熱穩(wěn)定性 將純化的酶溶于pH5.8的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液中，置于70'C、 75'C和8(TC下保溫一
定時間，然后測定其殘留的酶活力，結果分別如圖11、圖12和圖13所示。結果表明，在開 始保溫的階段里，酶活力都有所提高，這可能因為嗜熱酶是使用工程菌在中、低溫條件下表達 的，提高溫度保溫一段時間后有利于嗜熱酶的再折疊和激活；耐熱纖維素酶在70'C、 75'C保 溫7天后損失的活力很少，8CTC保溫6小時內活力降低的不多，這說明該酶的熱穩(wěn)定性較高。
(5) 金屬離子對酶活力的影響
測試了 9種無機離子(Zn2+、 Mg2+、 Co2+、 Ni2+、 Ca2+、 Ba2+、 Na+、 NH4+、 Mn2+ )在 濃度分別為5 mmol/L時對酶活力的影響，測活溫度是80'C，使用的緩沖液是pH5.8檸檬酸 鹽-磷酸鹽緩沖液。以不加這些金屬離子的對照酶液的比活力作為100%，加入金屬離子后的 相對比活力列于下面表1中，結果表明Ca2+、 NH4+、 Mn&對耐熱纖維素酶有輕微的激活作用， 其他離子對酶活力有抑制作用，Z一+對酶活力有很顯著的抑制作用。
表1.金屬離子對酶活力的影響
添加試劑反應濃度相對活力(％)標準偏差
無-1001.62
5mM10483.7
CaClj5mM102.624.02
NH4C15mM100.223.45
MgCy5mM95.83.6
BaOj5mM93.292.21
NaCl5mM93.296.5
叫045mM87.473.21
5mM79.084.85
NiCl25iriM72.662.7
ZnC^5mM3.130.76
Triston-1005mM98.84.7
EDTA,0.25。/。 ( WV )75.591.61
SDS0.25% ( W/V)2.42.4 附本發(fā)明所涉及耐熱纖維素酶基因核苷酸序列表和由該基因表達的耐熱纖維素酶氨基酸序列表 (1) SEQ ID NO. 1 耐熱纖維素酶前體蛋白基因核苷酸序列表 <110>吉林大學
<120>耐熱纖維素酶基因、重組工程菌、耐熱纖維素酶及應用
<160> 6
<210〉 1
<211〉 1032 <212〉腿
<213〉真細菌(Fervidobacterium nodosum)
<220〉
<221> CDS
<222> (1)…(1032)
<400> 1
ATGAAGAAAAAAATATTGAATGTTTTGCTTGGTTTTGCTTTAATTTTT
MetLysLysLyslieLeuAsnValLeuLeuGlyPheAlaLeuliePhe
151015
CTTATGAATGGTAATTGCAAAGCTGACCAAAGTGTGAGTAATGTTGAT
LeuMetAsnGlyAsnCysLysAlaAspGinSerValSerAsnValAsp
202530AAAAGTAGTGCTTTTGAATATAATAAAATGATTGGACATGGGATAAAC
LysSerSerAlaPheGluTyrAsnLysMetlieGlyHisGlylieAsn
354045
ATGGGGAATGCTTTAGAAGCCCCTGTAGAAGGTTCTTGGGGAGTTTAT
MetGlyAsnAlaLeuGluAlaProValGluGlySerTrpGlyValTyr
505560ATTGAGGATGAATATTTTAAAATAATAAAAGAAAGAGGCTTTGATTCT
lieGluAspGluTyrPhetyslielieLysGluArgGlyPheAspSer
65707580
GTAAGGATTCCTATCAGATGGTCTGCACACATTTCTGAGAAGTATCCT
ValArglieProlieArgTrpSerAlaHislieSerGluLysTyrPro
859095
TACGAAATTGATAAATTCTTTTTAGACAGAGTGAAACACGTTGTCGAT
TyrGlulieAspLysPhePheLeuAspArgValLysHisValValAsp
100105110
GTCGCGTTGAAGAATGATTTGGTTGTAATAATCAATTGTCATCATTTC
ValAlaLeuLysAsnAspLeuValValIelieAsnCysHisHisPhe
105120125
GAGGAATTATATCAAGCCCCTGATAAATATGGTCCTGTATTAGTTGAA
GluGluLeuTyrGinAlaProAspLysTyrGlyProValLeuValGlu
130135140
ATTTGGAAACAAGTTGCCCAAGCTTTTAAAGATTATCCAGACAAATTG
lieTrpLysGinValAlaGinAlaPheLysAspTyrProAsplysLeu
145150155160
TTCTTTGAAATATTTAACGAACCAGCTCAAAATTTGACTCCGACTAAG
PhePheGluliePheAsnGluProAlaGinAsnLeuThrProThrLys
165170175
TGGAATGAGCTTTATCCAAAAGTTTTAGGTGAA'ATTCGAAAAACGAAT
TrpAsnGluLeuTyrProLysValLeuGlyGlulieArgLysThrAsn
180185190
CCATCAAGAATTGTAATTATAGACGTTCCAAATTGGTCGAACTACAGC
ProSerArglieVallielieAspValProAsnTrpSerAsnTyrSer
195200205
TACGTAAGAGAGTTAAAGCTTGTTGATGATAAAAATATAATTGTTTCA
TyrValArgGluLeuLysLeuValAspAspLysAsnlielieValSer
210215220
TTCCATTATTACGAACCTTTTAATTTTACTCACCAAGGTGCTGAATGG
PheHisTyrTyrGluProPheAsnPheThrHisGinGlyAlaGluTrp
225230235240
GTTAGTCCAACGCTTCCAATTGGCGTTAAATGGGAAGGAAAAGATTGG
ValSerProThrLeuProlieGlyValLysTrpGluGlyLysAspTrp
245250255
GAAGTGGAACAGATTAGAAATCATTTCAAATATGTTAGTGAGTGGGCA
GluValGluGinlieArgAsnHisPheLysTyrValSerGluTrpAla
260265270
AAGAAAAACAATGTTCCGATATTTTTAGGTGAGTTTGGCGCATATTCA
LysLysAsnAsnValProliePheLeuGlyGluPheGlyAlaTyrSer
275280285
AAAGCAGATATGGAATCACGGGTGAAATGGACCAAAACTGTTAGGAGA
LysAlaAspMetGluSerArgValLysTrpThrLysThrValArgArg
290295300
ATCGCTGAAGAATTCGGATTTTCGCTTGCATATTGGGAATTTTGTGCG
lieAlaGluGluPheGlyPheSerLeuAlaTyrTrpGluPheCysAla305310315
GGG TTCGGGTTGTACGATAGATGGACA AAA ACA TGG ATAGAACCT
Gly PheGlyLeuTyrAspArgTrpThr Lys Thr Trp lieGluPro
325330335
ACT ACCTCTGCACTTGGAAAATAA(1032)
Thr ThrSerAlaLeuGlyLys
340
320
(2) SEQ ID NO. 2 耐熱纖維素酶前體蛋白氨基酸序列表
<210〉 2 <211> 343 <212> PRT
<213>真細菌(Fervidobacterium nodosum) <220>
<222> (l)... (343) <400> 2
MetLysLysLyslieLeuAsnVal LeuLeuGlyPheAlaLeuliePhe
151015
LeuMetAsnGly 20AsnCysLysAls Asp 25GinSerValSerAsn 30ValAsp
LysSerSer 35AlaPheGluTyrAsn Lys 40MetlieGlyHis 45GlylieAsn
MetGly 50AsnAlaLeuGluAla 55Pro ValGluGlySer 60TrpGlyValTyr
lieGluAspGluTyrPheLyslie lieLysGluArgGlyPheAspSer
65707580
ValArglieProlieArgTrpSer AlaHislieSerGluLysTyrPro
859095
TyrGlulieAsp 100LysPhePheLeu Asp 105ArgValLysHisVal 110ValAsp
ValAlaLeuLysAsnAspLeuVal VallielieAsnCysHisHisPhe
105120125
GluGlu 130LeuTyrGinAlaPro 135Asp LysTyrGlyPro 140ValLeuValGlu
lieTrpLysGinValAlaGinAla PheLysAspTyrProAspLysLeu
145150155160
PhePheGluliePhe 165AsnGluPro AlaGin 170AsnLeuThrProThr 175Lys
TrpAsnGluLeu 180TyrProLysVal Leu 185GlyGlulieArgLys 190ThrAsn
ProSerArg 195lieVallielieAsp V3I 200ProAsnTrpSer 205AsnTyrSer
TyrValArgGluLeuLysLeuV3I AspAspLysAsnlielieValSer
210215220
PheHisTyrTyrGluProPheAsn PheThrHisGinGlyAlaGluTrp
225230235240
ValSerProThrLeu 245ProlieGly ValLys 250TrpGluGlyLysAsp 255Trp
GluValGluGin 260lieArgAsnHis Phe 265LysTyrValSerGlu 270TrpAla
LysLysAsnAsnValProliePhe LeuGlyGluPheGlyAlaTyrSer
275280285
LysAlaAspMetGluSerArgVal LysTrpThrLysThrValArgArg
290295300
lieAlaGluGluPheGlyPheSer LysAlaTyrTrpGluPheCysAla
305310315320
GlyPheGlyLeuTyrAspArgTrp ThrLysThrTrplieGluProLeu
325330335
ThrThrSerAla 340LeuGlyLys*
(3) SEQ ID NO. 3 耐熱纖維素酶成熟蛋白基因核苷酸序列表
<210> 3 <211> 963 <212> DNA
<213>真細菌(Fervidobacteri咖nodosum)
<220〉
<221〉 CDS
<222> (l)... (963)
<400> 3
ATG GAC CAA AGT GTG AGT AAT GTT GAT AAA AGT AGT GCT TTT GAA TAT
MetAspGinSerValSerAsnValAspLysSerSerAla Phe GluTyr
151015AATAAAATGATTGGACATGGGATAAACATGGGGAATGCT TTA GAAGCC
AsnLysMetlieGlyHisGlylieAsnMetGlyAsnAla Leu GluAla
202530
CCTGTAGAAGGTTCTTGGGGAGTTTATATTGAGGATGAA TAT TTTAAA
ProValGluGlySerTrpGlyValTyrlieGluAspGlu Tyr PheLys
354045ATAATAAAAGAAAGAGGCTTTGATTCTGTAAGGATTCCT ATC AGATGG
lielieLysGluArgGlyPheAspSerValArgliePro lie ArgTrp
505560TCTGCACACATTTCTGAGAAGTATCCTTACGAAATTGAT AAA TTCTTT
SerAlaHislieSerGlu匕ysTyrProTyrGlulieAsp Lys PhePhe
65707580
TTAGACAGAGTGAAACACGTTGTCGATGTCGCGTTGAAG AAT GATTTG
LeuAspArgValLysHisValValAspValAlaLeuLys Asn AspLeu
859095
GTTGTAATAATCAATTGTCATCATTTCGAGGAATTATAT CAA GCCCCT
ValVallielieAsnCysHisHisPheGluGluLeuTyr Gin AlaPro
100105110
GATAAATATGGTCCTGTATTAGTTGAAATTTGGAAACAA GTT GCCCAA
AspLysTyrGlyProValLeuValGlulieTrpLysGin Val AlaGin
105120125
GCTTTTAAAGATTATCCAGACAAATTGTTCTTTGAAATA TTT AACGAA
AlaPheLysAspTyrProAspLysLeuPhePheGlulie Phe AsnGlu
130135140
CCAGCTCAAAATTTGACTCCGACTAAGTGGAATGAGCTT TAT CCAAAA
ProAlaGinAsnLeuThrProThrLysTrpAsnGluLeu Tyr ProLys
145150155160
GTTTTAGGTGAAATTCGAAAAACGAATCCATCAAGAATT GTA ATTATA
ValLeuGlyGlulieArgLysThrAsnProSerArglie Val lielie
165170175
GACGTTCCAAATTGGTCGAACTACAGCTACGTAAGAGAG TTA AAGCTT
AspValProAsnTrpSerAsnTyrSerTyrValArgGlu Leu LysLeu
180185190
GTTGATGATAAAAATATAATTGTTTCATTCCATTATTAC GAA CCTTTT
ValAspAspLysAsnlielieValSerPheHisTyrTyr Glu ProPhe
195200205
AATTTTACTCACCAAGGTGCTGAATGGGTTAGTCCAACG CTT CCAATT
AsnPheThrHisGinGlyAlaGluTrpValSerProThr Leu Prolie
210215220
GGCGTTAAATGGGAAGGAAAAGATTGGGAAGTGGAACAG ATT AGAAAT
GlyValLysTrpGluGlyLysAspTrpGluValGluGin lie ArgAsn
225230235240
CATTTCAAATATGTTAGTGAGTGGGCAAAGAAAAACAAT GTT CCGATA
HisPheLysTyrValSerGluTrpAlaLysLysAsnAsn Val Prolie
245250255
TTTTTAGGTGAGTTTGGCGCATATTCAAAAGCAGATATG GAA TCACGG
PheLeuGlyGluPheGlyAlaTyrSerLysAlaAspMet Glu SerArg
260265270
GTGAAATGGACCAAAACTGTTAGGAGAATCGCTGAAGAA TTC GGATTT
ValLysTrpThrLysThrValArgArglieAlaGluGlu Phe GlyPhe
275280285
TCGCTTGCATATTGGGAATTTTGTGCGGGGTTCGGGTTG TAC GATAGA
SerLeuAlaTyrTrpGluPheCysAlaGlyPheGlyLeu Tyr AspArg
290295300
TGGACAAAAACATGGATAGAACCTCTTACTACCTCTGCA CTT GGAAAA
TrpThrLysThrTrplieGluProLeuThrThrSerAla Leu GlyLys
305310315320
TAA (963)
(4) SEQ ID NO. 4 耐熱纖維素酶成熟蛋白氨基酸序列表
<210〉 4 <211> 320 <212> PRT
<213>真細菌(Fervidobacteri咖nodosum) <220>
<222> (l)... (320) <400> 4
Met Asp Gin Ser Val Ser Asn Val Asp Lys Ser Ser Ala Phe Glu Tyr
15 10 15
Asn Lys Met lie Gly His Gly lie Asn Met Gly Asn Ala Leu Glu Ala
<formula>formula see original document page 20</formula>TAT CAAGCCCCTGATAAATATGGT CCT GTATTAGTTGAAATTTGGAAA
Tyr GinAlaProAspLysTyrGly Pro ValLeuValGlulieTrpLys
130135140CAA GTTGCCCAAGCTTTTAAAGAT TAT CCAGACAAATTGTTCTTTGAA
Gin ValAlaGinAlaPhe匕ysAsp Tyr ProAspLysLeuPhePheGlu
145150155160
ATA mAACGAACCAGCTCAAAAT TTG ACTCCGACTAAGTGGAATGAG
lie PheAsnGluProAlaGinAsn Leu ThrProThrLysTrpAsnGlu
165170175
tatccaaaagttttaggtgaa att cgaaaaacgaatccatcaaga
Leu TyrProLysValLeuGlyGlu lie ArgLysThrAsnProSerArg
180185190
ATT GTAATTATAGACGTTCCAAAT TGG TCGAACTACAGCTACGTAAGA
lie VallielieAspValProAsn Trp SerAsnTyrSerTyrValArg
195200205
GAG TTAAAGCTTGTTGATGATAAA AAT ATAATTGTTTCATTCCATTAT
Glu LeuLysLeuValAspAspLys Asn lielieValSerPheHisTyr
210215220TAC GAACCTTTTAATTTTACTCAC CAA GGTGCTGAATGGGTTAGTCCA
Tyr GluProPheAsnPheThrHis Gin GiyAlaGluTrpValSerPro
225230235240
ACG CTTCCAATTGGCGTTAAATGG GAA GGAAAAGATTGGGAAGTGGAA
Thr LeuProlieGlyValLysT卬Glu GlyLysAspTrpGluValGlu
245250255
CAG ATTAGAAATCATTTCAAATAT GTT AGTGAGTGGGCAAAGAAAAAC
Gin lieArgAsnHisPheLysTyr Val SerGluTrpAlaLysLysAsn
260265270
AAT GTTCCGATATTTTTAGGTGAG TTT GGCGCATATTCAAAAGCAGAT
Asn ValProliePheLeuGlyGlu Phe GlyAlaTyrSerLysAlaAsp
275280285
ATG GAATCACGGGTGAAATGGACC AAA ACTGTTAGGAGAATCGCTGAA
Met GluSerArgValLysTrpThr Lys ThrValArgArglieAlaGlu
290295300
GAA TTCGGATTTTCGCTTGCATAT TGG GAATTTTGTGCGGGGTTCGGG
Glu PheGlyPheSerLeuAlaTyr Trp GluPheCysAlaGlyPheGly
305310315320
TTG TACGATAGATGGACAAAAACA TGG ATAGAACCTCTTACTACCTCT
Leu TyrAspArgTrpThrLysThr Trp lieGluProLeuThrThrSer
325330335
GCA CTTGGAAAATAA(1023)
Ala LeuGlyLys*
340
(6) SEQ IDNO. 6 耐熱纖維素酶重組蛋白氨基酸序列表
<210> 6
<211> 340
<212> PRT
<213〉真細菌(Fervidobacteriura nodosum)
<220>
<222〉 (l)...(340)
<400〉 6
Met GlySerSerHisHisHisHis His HisSerSerGlyLeuValPro
151015
Arg GlySerHisMetAspGinSer Val SerAsnValAspLysSerSer
202530
Ala PheGluTyrAsnLysMetlie Gly HisGlylieAsnMetGlyAsn
354045
Als LeuGluAlaProValGluGly Ser TrpGlyValTyrlieGluAsp
505560
Glu TyrPheLyslielieLysGlu Arg GlyPheAspSerValArglie
65707580
Pro lieArgTrpSerAlaHislie Ser GluLysTyrProTyrGlulie
859095
Asp LysPhePheLeuAspArgVal Lys HisValValAspValAlaLeu
100105110
Lys AsnAspLeuValVallielie Asn CysHisHisPheGluGluLeu
105120125
Tyr GinAlaProAspLysTyrGly Pro ValLeuValGlulieTrpLys
130135140
Gin ValAlaGinAlaPhe匕ysAsp Tyr ProAspLysLeuPhePheGlu
145150155160
lie PheAsnGluProAlaGinAsn Leu ThrProThrLysTrpAsnGlu
165170175
Leu TyrProLysValLeuGlyGlu lie ArgLysThrAsnProSerArg
180185190
lieVallie 195lieAspValProAsn 200TrpSerAsnTyrSer 205TyrValArg
GluLeu 210LysLeuValAspAsp 215LysAsnlielieVal 220SerPheHisTyr
TyrGluProPheAsnPheThrHisGinGlyAlaGluTrpValSerPro
225230235240
ThrLeuProlieGly 245ValLysTrpGluGly 250LysAspTrpGluVal 255Glu
GinlieArgAsn 260HisPheLysTyrVal 265SerGluTrpAlaLys 270LysAsn
AsnValPro 275liePheLeuGlyGlu 280PheGlyAlaTyrSer 285LysAlaAsp
MetGlu 290SerArgValLysTrp 295ThrLysThrValArg 300ArglieAlaGlu
GluPheGlyPheSerLysAlaTyrTrpGluPheCysAlaGlyPheGly
305310315320
LeuTyrAspArgTrp 325ThrLysThrTrplie 330GluProLeuThrThr 335Ser
AlaLeuGlyLys 340*
權利要求
1.一種如SEQ ID NO1所示核苷酸序列的耐熱纖維素酶前體蛋白基因。
2、 一種如SEQIDN0 2所示氨基酸序列的耐熱纖維素酶前體蛋白。
3、 一種如SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的耐熱纖維素酶成熟蛋白基因。
4、 含有SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的耐熱纖維素酶成熟蛋白基因的重組質粒，其特 征在于為重組質粒pCel5A。
5、 含有權利要求4所述重組質粒的耐熱纖維素酶工程菌，其特征在于為在大腸桿菌￡. co//中表達的工程菌。
6、 一種如SEQ ID NO 4所示氨基酸序列的耐熱纖維素酶成熟蛋白。
7、 含有SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的耐熱纖維素酶重組蛋白基因的重組質粒，其特 征在于為重組質粒pNHCel5A。
8、 含有權利要求7所述重組質粒的耐熱纖維素酶工程菌，其特征在于為在大腸桿菌E. co//中表達的工程菌。
9、 一種與SEQ ID N0 4所示氨基酸序列具有90"/o以上同源性的耐熱纖維素酶重組蛋白。
10、 如權利要求9所述的與SEQ ID NO 4所示氨基酸序列具有90%以上同源性的耐熱纖 維素酶重組蛋白，其特征在于是為如SEQ ID NO 6所示氨基酸序列的耐熱纖維素 酶重組蛋白。
11、 權利要求6所述的耐熱纖維素酶蛋白在纖維素加工領域的應用。
12、 權利要求9或10所述的耐熱纖維素酶重組蛋白在纖維素加工領域的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程領域，具體涉及來源于閃爍桿菌屬(Fervidobacterium)細菌的耐熱纖維素酶基因、重組載體、纖維素酶基因工程菌、耐熱纖維素酶及應用。我們獲得的耐熱纖維素酶(FnCel5A、FnNHCel5A)能在高溫條件(70～80℃)下高效催化反應，而且酶的穩(wěn)定性非常好，運用到生產中，有儲運成本低、加快動力學反應、對反應器冷卻系統要求標準低等優(yōu)點。同時FnCel5A、FnNHCel5A是具有單一內切酶活性的耐熱纖維素酶，在纖維素加工領域具有廣泛的應用。也可以將該重組耐熱纖維素酶應用到洗滌劑、廢水處理、動物飼料等方面，或者應用在紡織工業(yè)、再生紙生產、植物有效成分提取、果汁加工等工業(yè)。
文檔編號C12N1/21GK101372693SQ20081005090
公開日2009年2月25日 申請日期2008年7月1日 優(yōu)先權日2008年7月1日
發(fā)明者雁 馮, 張作明, 王校楠, 王玉國, 鄭柏松 申請人:吉林大學