專利名稱：：一種耐熱中性木聚糖酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種耐熱中性木聚糖酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：木聚糖是自然界中的一種豐富的再生資源，是最具代表性的半纖維素，占半纖維素的1/31/2，是除纖維素外，自然界中最豐富的多糖。與纖維素相比，半纖維素更易被微生物降解轉(zhuǎn)化。木聚糖酶是木聚糖水解酶系中最關(guān)鍵的水解酶，通過(guò)水解木糖分子β-1，4_糖苷鍵，將木聚糖水解為木寡糖和木二糖等低木聚糖，及少量木糖和阿拉伯糖。用木聚糖酶處理硫酸鹽紙漿可減少后續(xù)漂白處理化學(xué)劑的用量。由于木聚糖酶可以用于紙漿的預(yù)漂白、飼料添加劑提高飼料的能量值及畜禽對(duì)飼料的吸收率、增殖腸道內(nèi)的雙歧桿菌，用于食品改良劑和釀酒等方面，所以作為一種工業(yè)用酶制劑，木聚糖酶具廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蛋白質(zhì)及其編碼基因。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)所示的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將(a)所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有木聚糖酶活性的由(a)或(b)衍生的蛋白質(zhì)。所述編碼基因是如下1)或2)或3)的DNA分子1)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼具有木聚糖酶活性的蛋白的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼具有木聚糖酶活性的蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC,0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC,0.1%SDS和1XSSC,0.1%SDS各洗膜一次。為了使(a)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述(a)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(a)中的蛋白的編碼基因可通過(guò)將序列表1所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體為將上述任一所述編碼基因插入出發(fā)載體pHBM905A的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體；所述重組菌是將上述任一所述編碼基因插入出發(fā)載體PHBM905A的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS115得到的。可用現(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，它們可單獨(dú)使用或與其它的啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。擴(kuò)增上述任一所述編碼基因的全長(zhǎng)及其任意片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述引物對(duì)中的一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。上述任一所述蛋白質(zhì)在降解木聚糖中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述編碼基因在降解木聚糖中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述重組載體在降解木聚糖中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述重組菌在降解木聚糖中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述表達(dá)盒在降解木聚糖中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在降解木聚糖中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述應(yīng)用中，所述降解的條件包括反應(yīng)體系的溫度為55°C-75°C，優(yōu)選為70°C，反應(yīng)體系的pH值為6.0-8.0，優(yōu)選為7.0。上述任一所述應(yīng)用中，所述木聚糖為樺木木聚糖、燕麥木聚糖或山毛櫸材木聚糖。本發(fā)明所提供的木聚糖酶具有耐熱特性和在中性pH條件下活性高的特性。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明木聚糖酶在70°C、pH為7.0的條件下具有最高的酶活性，為92.5U/mg蛋白干粉；該酶在在溫度為55°C_75°C的范圍內(nèi)，酶活均較高；在pH值為6.0-8.0的范圍內(nèi)，酶活也均較高。該酶在60°C條件下保持30分鐘，酶活性未下降，證明該酶耐熱性高。上述特性使本發(fā)明酶比一般的木聚糖酶更適用于高溫、PH中性的條件。圖1為xy10蛋白的SDS-PAGE電泳圖。圖2為耐熱木聚糖酶活性隨溫度的變化。圖3為耐熱木聚糖酶活性隨pH的變化。圖4為耐熱木聚糖酶的熱穩(wěn)定性變化圖。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、蛋白及基因的制備及功能一、基因及蛋白的發(fā)現(xiàn)1、芽孢桿菌Bacillussp.N16-5總DNA的提取采用芽孢桿菌Bacillussp.N16-5,取其新鮮濕菌體20克，懸于10毫升50mMTris緩沖液中(pH8.0)，加入溶菌酶和8毫升0.25mMEDTA(pH8.0)，混勻后37°C放置20min；之后加入2毫升10%SDS，55°C放置5min，分別用等體積酚、氯仿各抽提一次；取最后一次的上清溶液，加入2倍體積乙醇，回收DNA，分別用70%和無(wú)水乙醇洗；沉淀溶于0.5毫升TE緩沖液(pH8.0，IOmMTris,ImMEDTA)，加入10mg/mlRNase3μ1，37°C保溫1小時(shí)，分別用等體積酚、氯仿各抽提一次；上清溶液加入2倍體積乙醇，回收DNA，分別用70%和無(wú)水乙醇洗，真空干燥，用去離子水溶解。2、中性木聚糖酶的發(fā)現(xiàn)1)取總DNA溶液10μ1(約50μgDNA)，用限制性內(nèi)切酶Sau3AI部分酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收3-9kbDNA片段。2)取總DNA溶液10μ1(約50μgDNA)，用限制性內(nèi)切酶Sau3AI部分酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收2-8kbDNA片段。3)連接反應(yīng)16小時(shí)連接體系(20μ1):2μ1(5μg)Sau3AI酶解DNA片段；1μ1(1μg)經(jīng)BamHI酶解并去磷酸化的質(zhì)粒pUC18DNA；2μ1IOx連接緩沖液；1μ1T4DNA連接酶；14μ1/Κ。4)用連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，然后涂于含50ug/mlAmp(氨芐青霉素)、1%交聯(lián)木聚糖的固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)16-18小時(shí)，菌落周圍有透明圈的即為陽(yáng)性克隆。3、陽(yáng)性克隆在Amp-LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)16-18小時(shí)，經(jīng)活性測(cè)試具有木聚糖酶活性。4、對(duì)陽(yáng)性克隆中的重組質(zhì)粒進(jìn)行了測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中，在PUC18(購(gòu)自TAKARA，產(chǎn)品目錄號(hào)為3218)骨架中插入了一個(gè)DNA片段，該DNA片段含有一個(gè)長(zhǎng)1230bp的開(kāi)放閱讀框架(ORF)，ORF核苷酸序列如序列表的序列2所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列1所示，將該蛋白記作xylO蛋白，將該基因記作xylO基因。二、基因及蛋白的制備芽孢桿菌Bacillussp.N16-5CGMCCNo.0369購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)。質(zhì)粒pHBM905A在文獻(xiàn)(MolecularcloningandheterologousexpressionofanewxylanasegenefromPlectosphaerellacucumerinainPichiapastoris.AppliedMicrobialBiotechnology，2007，74:339_346)中公開(kāi)過(guò)。畢赤酵母菌GS115購(gòu)自Invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為K171001。(一)xylO基因的制備可采用如下方法制備xylO基因；也可以采用人工合成的方法得到xylO基因。以芽孢桿菌Bacillussp.N16-5的總DNA為模板，用下述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物對(duì)如下正向弓丨物5'-Ktcagtgtcgtttaggtcatactttttaatttactc-3'(序歹[J3)；反向弓I物5'"Kgccattaatcaataattctccagtaagcaggc-3'(序列4)；正向引物的下劃線部分為酶切位點(diǎn)CpoI的接頭，反向引物的下劃線部分為酶切位點(diǎn)NotI的接頭。PCR反應(yīng)體系IOX緩沖液5μ1dNTP4μ1exTaqDNA聚合酶0·5μ1正向引物Ιμ反向引物Ιμ模板0.5μ1/K38μ1。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5分鐘，然后94°C變性30秒_58°C退火30秒_72°C延伸1分鐘30秒，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)量和特異性，并用DNA純化試劑盒(超薄離心柱型，天根公司生產(chǎn))純化。(二)重組表達(dá)載體的構(gòu)建1、將純化后的PCR產(chǎn)物用T4DNApolymerase處理(處理的方法將PCR產(chǎn)物、dNTP、T4DNApolymerase在12°C混合20min)，得到NotI和CpoI的粘性末端，瓊脂糖電泳回收處理產(chǎn)物。2、將質(zhì)粒pHBM905A用NotI和CpoI雙酶切，瓊脂糖電泳回收酶切載體大片段。3、將步驟1的回收產(chǎn)物和步驟2的酶切載體大片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后涂布于含有50μg/ml氨芐青霉素的LB平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆；將單克隆接入含有50μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質(zhì)粒；將質(zhì)粒用正向引物和反向引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果得到大小正確的擴(kuò)增產(chǎn)物，初步證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確；進(jìn)一步進(jìn)行質(zhì)粒測(cè)序，結(jié)果表明，在PHBM905A的NotI和CpoI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表中序列2所示的xylO基因，插入方向正確，進(jìn)一步證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確，將該重組質(zhì)粒命名為pHBM905A-xyl0。(三)工程菌的制備將質(zhì)粒pHBM905A_xyl0經(jīng)SalI線性化后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GSl15后涂布于MD平板，300C，48h培養(yǎng)，得到含有質(zhì)粒pHBM905A-xyl0的工程菌，記作GS115/pHBM905A_xyl0。用pHBM905A代替pHBM905A_xyl0，轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GSl15，得到含有pHBM905A的重組菌，作為對(duì)照菌。將轉(zhuǎn)入PHBM905A的陽(yáng)性重組菌記作GS115/pHBM905A。MD平板的組成由YNB(YeastNitrogenBase)、生物素(biotin)、右旋葡萄糖(dextrose)、(NH4)2SO4、瓊脂(agar)和水組成；各物質(zhì)在MD平板中的濃度為(YNB)3.4g/L、生物素4xl(T5%、葡萄糖20g/L、(NH4)2SO410g/L、瓊脂15g/L。YNB購(gòu)自Difco公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為0919-07。(四)中性木聚糖酶的制備和純化凝膠過(guò)濾預(yù)裝柱GESuperdex75購(gòu)自AmershamBiosciences，產(chǎn)品目錄號(hào)為17-5174-01。BMGY培養(yǎng)基組成由酵母提取物、蛋白胨、磷酸二氫鉀、YNB、甘油和水組成；各成分在培養(yǎng)基中的濃度為酵母提取物(yeastextract)10g/L、蛋白胨(ρ印tone)20g/L、磷酸二氫鉀(potassiumphosphate)IOOmM,pH6.0、YNB3.4g/L、甘油(glycerol)10g/L。BMMY培養(yǎng)基組成由酵母提取物、蛋白胨、磷酸二氫鉀、YNB和水組成；各成分在培養(yǎng)基中的濃度為酵母提取物(yeastextract)10g/L、蛋白胨(ρ印tone)20g/L、磷酸二氫鉀(potassiumphosphate)IOOmM,pH6.0、YNB3.4g/L。將陽(yáng)性重組菌GS115/pHBM905A-xy10接種于BMGY培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)48h，此時(shí)培養(yǎng)體系的0D_=15時(shí)，轉(zhuǎn)至BMMY培養(yǎng)基25°C繼續(xù)培養(yǎng)72h，每隔12小時(shí)，添加1.5%的甲醇(即使甲醇在培養(yǎng)體系中的體積濃度為1.5%)，將培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)記作發(fā)酵液；將發(fā)酵液5000rpm、IOmin離心收集上清，將上清通過(guò)Millipore超濾管(超濾管的截留分子量為10000)濃縮至400μL；然后用凝膠過(guò)濾預(yù)裝柱GESuperdex75進(jìn)行分子篩純化，去除雜蛋白和色素，純化步驟是先用PH值為7.5的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液平衡柱子，再上樣，收集最大的峰，即為目的蛋白；將收集的洗脫液記作純酶液；將純酶液通過(guò)Mi11ipore超濾管濃縮后，真空冷凍干燥，得到酶蛋白干粉。將對(duì)照菌GS115/pHBM905A采用相同的步驟進(jìn)行培養(yǎng)和純化，得到的溶液作為對(duì)照酶液。將實(shí)驗(yàn)組的純酶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖1中泳道2所示，顯示實(shí)驗(yàn)組純化的XylO蛋白的分子量約為48kDa，比理論推斷的45kDa大，可能是糖基化的結(jié)果。糖基化酶endoH購(gòu)自Biolab公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為P0703S。Denaturebuffer禾口G5buffer均是購(gòu)買酶時(shí)產(chǎn)品自帶的。將純酶液用去糖基化酶endoH處理，處理方法為2μ1Denaturebuffer與18μ1純酶液100°C處理10分鐘，然后加入2.5μ1G5buffer和1.5μ1endoH酶37°C處理1小時(shí)，處理后的酶液再進(jìn)行SDS-PAGE電泳；結(jié)果得到變小的蛋白帶，約為45kDa。電泳效果如圖1所示，圖1中，泳道3表示蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(100，75，50，35，25kDa)，泳道2表示經(jīng)分子篩純化后的XylO蛋白，泳道1表示經(jīng)過(guò)去糖基化酶處理后的XylO蛋白。三、蛋白的酶學(xué)性質(zhì)分析酶活單位定義為lmin內(nèi)催化樺木木聚糖產(chǎn)生1μmol木糖所需的酶量。樺木木聚糖購(gòu)自sigma，產(chǎn)品目錄號(hào)為X0502。(一)最適溫度用pH值為7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液稀釋實(shí)驗(yàn)二中的純酶液，用稀釋后的酶液進(jìn)行酶活測(cè)定。將稀釋后的酶液記作稀釋酶液。實(shí)驗(yàn)組酶活測(cè)定反應(yīng)體系為0.5ml,由0.48ml溶液A和0.02ml稀釋酶液組成；反應(yīng)體系的PH值為7.0；將反應(yīng)體系在特定溫度溫育IOmin后，加入0.5ml二硝基水楊酸溶液(DNS)終止反應(yīng)，然后沸水浴5min后測(cè)定520nm的吸光值。每IOOml溶液A的配制將90mlIOOmM的pH7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液、Ig樺木木聚糖和IOmi水混合，100°C處理3-5分鐘至樺木木聚糖溶解，得到IOOml溶液A。結(jié)果如圖2所示。表明，在70°C時(shí)，木聚糖酶具有最高的酶活性，為92.5U/mg蛋白干粉；將此溫度下的酶活反應(yīng)體系的吸光值作為相對(duì)活性100%，其它溫度下酶活反應(yīng)體系的吸光值與此最高酶活性體系的吸光值的比值作為相對(duì)活性。在溫度為55°c時(shí)的酶活為66.56U/mg，60°C時(shí)的酶活為74.4U/mg，75°C時(shí)的酶活為46.3U/mg。以對(duì)照菌GS115/pHBM905A獲得的蛋白(記作對(duì)照酶液)進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果不管在哪個(gè)溫度條件下，對(duì)照酶液均沒(méi)有降解木聚糖的活性。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果一致。(二)最適pH如下各組中的稀釋酶液均是用各組中的緩沖液稀釋實(shí)驗(yàn)二中的純酶液得到的。實(shí)驗(yàn)組活性測(cè)定體系為0.5ml,由0.48ml溶液B(B1、B2、B3、B4、B5、B6或B7)和0.02ml稀釋酶液組成；每IOOml溶液Bl的配制將90ml50mM的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液、Ig樺木木聚糖混合，調(diào)節(jié)PH值至4.0，再加入IOml水，得到IOOml溶液Bi。每IOOml溶液B2的配制與溶液Bl相同，不同的是溶液B2的pH值為5.0。每IOOml溶液B3的配制將90ml50mM的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液、Ig樺木木聚糖混合，調(diào)節(jié)pH值至6.0，再加入IOml水，得到IOOml溶液B3。每IOOml溶液B4的配制與溶液B3相同，不同的是溶液B4的pH值為7.0。每IOOml溶液B5的配制將90ml50mM的Tris-HCl緩沖液、Ig樺木木聚糖混合，調(diào)節(jié)PH值至8.0，再加入IOml水，得到IOOml溶液B5。每IOOml溶液B6的配制將90ml50mM的Glycine-NaOH緩沖液、Ig樺木木聚糖混合，調(diào)節(jié)pH值至9.0，再加入IOml水，得到IOOml溶液B6。每IOOml溶液B7的配制與溶液B6相同，不同的是溶液B7的pH值為10.0。以上溶液均需要在IOCTC處理3-5分鐘至樺木木聚糖溶解。將反應(yīng)體系在70°C，溫育IOmin后，加入0.5ml二硝基水楊酸溶液(DNS)終止反應(yīng)，然后沸水浴5min后測(cè)定520nm的吸光值。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果如圖3所示。表明，在pH值為7.0時(shí)，木聚糖酶具有最高的酶活性，為92.5U/mg蛋白干粉；將此pH值下的酶活反應(yīng)體系的吸光值作為相對(duì)活性100%，其它pH值下酶活反應(yīng)體系的吸光值與此最高酶活性體系的吸光值的比值作為相對(duì)活性。在PH值為6.0時(shí)的酶活為63.5U/mg，pH值為6.5時(shí)的酶活為88U/mg，pH值為7.5時(shí)的酶活為74U/mg，pH值為8.0時(shí)的酶活為64.8U/mg，。以對(duì)照菌GS115/pHBM905A獲得的蛋白(記作對(duì)照酶液)進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果不管在哪個(gè)PH值條件下，對(duì)照酶液均沒(méi)有降解木聚糖的活性。(三)酶熱穩(wěn)定性用pH值為7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液稀釋實(shí)驗(yàn)二中的純酶液，用稀釋后的酶液進(jìn)行酶活測(cè)定。將稀釋后的酶液記作稀釋酶液。將稀釋酶液分別在60°C、70°C、8(rC水浴放置15和30分鐘，測(cè)定酶的殘余活性。酶活測(cè)定反應(yīng)體系中PH值為7.0、測(cè)定溫度為70°C，其余條件及步驟與實(shí)驗(yàn)(一)中所述相同。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果如圖4，顯示，60°C處理30分鐘未見(jiàn)酶活下降；表明該酶在60°C條件下耐熱性很好。權(quán)利要求一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)所示的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將(a)所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有木聚糖酶活性的由(a)或(b)衍生的蛋白質(zhì)。2.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因是如下1)或2)或3)的DNA分子1)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼具有木聚糖酶活性的蛋白的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼具有木聚糖酶活性的蛋白的DNA分子。4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。5.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述編碼基因的全長(zhǎng)及其任意片段的引物對(duì)。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的引物對(duì)，其特征在于所述引物對(duì)中的一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。7.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)在降解木聚糖中的應(yīng)用；權(quán)利要求2或3所述編碼基因在降解木聚糖中的應(yīng)用；權(quán)利要求4所述重組載體在降解木聚糖中的應(yīng)用；權(quán)利要求4所述重組菌在降解木聚糖中的應(yīng)用；權(quán)利要求4所述表達(dá)盒在降解木聚糖中的應(yīng)用；或權(quán)利要求4所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在降解木聚糖中的應(yīng)用。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述降解的條件包括反應(yīng)體系的溫度為55°C_75°C，優(yōu)選為70°C，反應(yīng)體系的pH值為6.0-8.0，優(yōu)選為7.0。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于所述木聚糖為樺木木聚糖、燕麥木聚糖或山毛櫸材木聚糖。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種耐熱中性木聚糖酶及其編碼基因與應(yīng)用。該酶是如下(a)或(b)所示的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將(a)所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有木聚糖酶活性的由(a)或(b)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的木聚糖酶具有耐熱特性和在中性pH條件下活性高的特性。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明木聚糖酶在70℃、pH為7.0的條件下具有最高的酶活性，為92.5U/mg蛋白干粉；該酶在在溫度為55℃-75℃的范圍內(nèi)，酶活均較高；在pH值為6.0-8.0的范圍內(nèi)，酶活也均較高。該酶在60℃條件下保持30分鐘，酶活性未下降，證明該酶耐熱性高。上述特性使本發(fā)明酶比一般的木聚糖酶更適用于高溫、pH中性的條件。文檔編號(hào)C12N15/11GK101805726SQ20101015282公開(kāi)日2010年8月18日申請(qǐng)日期2010年4月19日優(yōu)先權(quán)日2010年4月19日發(fā)明者張桂敏,毛良偉,薛燕芬,馬延和申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所