專利名稱：一種利用喜樹aoc基因轉(zhuǎn)化提高煙草抗凍性能的方法
—種利用喜樹AOC基因轉(zhuǎn)化提高煙草抗凍性能的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于分子生物學以及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用基因工程技術(shù)提高煙草抗凍性能的方法。
背景技術(shù)：
茉莉酸類物質(zhì)是植物界中普遍存在的一種激素，參與植物發(fā)育和逆境脅迫下應(yīng)激反應(yīng)的信號傳導(dǎo)過程。內(nèi)源和外源的茉莉酸類化合物能顯著提高植物對機械損傷、動物撕咬、病蟲害侵染、低溫、高鹽等不利外界環(huán)境的耐受能力。在植物中，茉莉酸類物質(zhì)的合成途徑是從細胞膜上釋放的亞麻酸開始，在脂氧合酶、丙二烯氧化物合成酶、丙二烯氧化物環(huán)化酶、OPDA (12-0X0-(10, 15Z)-phytodienoic acid)還原酶、β _氧化酶、茉莉酸甲基化酶等一系列酶的催化生成茉莉酸和甲基茉莉酸。其中由于丙二烯氧化物會自發(fā)水解，由此丙二烯氧化物環(huán)化酶的作用在茉莉酸類物質(zhì)的合成途徑中尤為重要。
作為一種重要的模式植物，且易于進行遺傳轉(zhuǎn)化，煙草是植物的信號途徑研究中的熱門對象；作為一種廣泛種植的經(jīng)濟作物，煙草的抗逆性能在物種品質(zhì)和經(jīng)濟價值上具有非常重要的意義。煙草的抗凍研究目前涉及葡萄糖醛酸苷酶(GUS)蛋白，超氧物岐化酶(SOD)蛋白等。
相比較而言，利用來源于喜樹的茉莉酸類物質(zhì)合成途徑的關(guān)鍵酶丙二烯氧化物環(huán)化酶的基因工程來系統(tǒng)性地提高煙草的抗凍性能具有很大的優(yōu)勢(I)在茉莉酸類物質(zhì)的合成和信號傳導(dǎo)研究領(lǐng)域，全世界的研究人員已經(jīng)進行了幾十年的深入研究，其生理作用和生化機制比較清楚，為在基因工程中利用茉莉酸類物質(zhì)生物合成途徑的基因打下了良好的理論和實踐基礎(chǔ)。(2)提供一種全新的思路，采用轉(zhuǎn)aoc基因提高煙草抗凍性能的方法。 喜樹是一種和煙草親緣關(guān)系比較遠的植物，來源于喜樹的丙二烯氧化物環(huán)化酶在煙草中能順利表達并達到高活性效果，提高了尼古丁含量。這為開展植物基因工程研究提供了一個新的方向。
目前，尚未有任何與本專利申請中所提及的應(yīng)用基因工程技術(shù)把喜樹的茉莉酸物質(zhì)生物合成途徑的酶基因尤其是丙二烯氧化物環(huán)化酶轉(zhuǎn)到煙草中，提高煙草抗凍性能的相關(guān)報道，包括專利和文獻。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的就是提供一種利用基因工程技術(shù)提高煙草抗凍性能的方法，該方法將來源于喜樹的丙二烯氧化物環(huán)化酶基因轉(zhuǎn)到煙草中。
本發(fā)明的第二目的是提供一種高效表達載體，它包含上述喜樹的丙二烯氧化物環(huán)化酶基因片斷。
本發(fā)明的第三目的是提供一種用上述高效表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。在實例中該宿主細胞是煙草。
本方法的技術(shù)方案如下本發(fā)明分離出的DNA分子，具有編碼丙二烯氧化物環(huán)化酶的核苷酸序列的核心片斷， 該核心片斷來源于由申請人在GenBank中登錄的喜樹iCamptotheca丙二烯氧化物環(huán)化酶基因(登錄號AY863428)的核苷酸序列,用引物Pl (5’-gg actaRt Atg get get tea tea act tc_3’，酶切位點用下劃線表示)和 P2 (5’-ga ggttacc Tea gtc agt gaa gtt agg aa_3’，feiEII酶切位點用下劃線表示),采用PCR法可以從喜樹cDNA文庫中擴增出該核心片斷，喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶基因的cDNA序列見SEQ ID N0:1，其全長 1129bp，開放閱讀框位置為第72位堿基到第812位堿基。
本發(fā)明提出的利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高煙草抗凍能力的方法，是利用具有編碼喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶(AOC)的核苷酸序列(Genbank No. :AY863428)的植物表達載體,采用轉(zhuǎn)基因方法在煙草細胞、組織、器官、植株中過量表達喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶基因的DNA分子。
其具體步驟如下(1)采用任何可能的手段(如基因克隆、人工合成基因等方法)獲得喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶基因的核心片斷；(2)把喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶基因核心片斷可操作地連于表達調(diào)控序列，形成表達載體；(3)采用任何轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶基因核心片斷到煙草細胞、組織、器官、植株中；(4)在特定的條件下篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子；(5)在適合的條件下培養(yǎng)抗凍性能提高的煙草轉(zhuǎn)化子，獲得轉(zhuǎn)基因后代。
本發(fā)明涉及的載體包含具有編碼喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶的核苷酸序列的核心片斷的DNA。
用上述方法獲得的生命體，它是抗凍性能提高了的煙草的細胞、組織、器官、植株。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒等。在本發(fā)明中，術(shù)語“生命體”指煙草的細胞、組織、器官，或植株。
在本發(fā)明中，術(shù)語“任何可能的手段”為獲得喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶基因的方法，具體包括同源性克隆(如RT-PCR、RACE等)、文庫篩選而后人工合成喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶基因及其變異體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“任何轉(zhuǎn)基因方法”包括根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、植物病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、電擊法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、超聲波介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、顯微注射介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、激光微束介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、基因槍介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、花粉管通道介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、生殖細胞浸泡法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化。
在本發(fā)明中，術(shù)語“在特定的條件下篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子”是指在離體培養(yǎng)的條件下用抗生素(卡那霉素、潮霉素、G418等)選擇出有抗生素抗性的轉(zhuǎn)化子；可以使用PCR、 Southern雜交、Northern雜交和Western印跡等方法來鑒定轉(zhuǎn)化子。
在本發(fā)明中，術(shù)語“在適合的條件下培養(yǎng)抗凍性能提 高的煙草轉(zhuǎn)化子，獲得轉(zhuǎn)基因后代”是指對經(jīng)過鑒定的轉(zhuǎn)化子離體培養(yǎng)，并檢測抗凍性能，篩選抗凍性能提高的優(yōu)良轉(zhuǎn)化子進行培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因后代。
本發(fā)明從喜樹中克隆丙二烯氧化物環(huán)化酶基因核心片斷，并構(gòu)建了植物高效表達載體，導(dǎo)入農(nóng)桿菌并遺傳轉(zhuǎn)化煙草，以提高煙草的抗凍性能，提高了煙草的種質(zhì)，增強了栽培適宜性。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件， 例如《分子克隆》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照廠商所建議的條件。
實施例1 喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶基因核心片斷的合成，及表達載體和工程菌的構(gòu)建。
1、喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶基因核心片斷的獲得根據(jù)喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶基因的全長序列，在該基因的內(nèi)部第72堿基至第812堿基之間設(shè)計引物，擴增741bp序列作為基因片斷，并根據(jù)植物表達載體PCAMBIA1304的多克隆酶切位點，分別設(shè)計兩條含有5^1和^siEII限制性內(nèi)切酶位點以及保護堿基的PCR擴增引物，其引物序列為Pl 5' -ggactagtAtggctgcttcatcaacttc-3' (SEQ ID NO:2) ,酶切位點用下劃線表示P2 5' -gaggttaccTcagtcagtgaagttaggaa-3' (SEQ ID NO 3) , ifeiEII 酶切位點用下劃線表示從喜樹的葉片抽提總RNA (上海華舜生物工程有限公司植物RNA提取試劑盒)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA(TaKaRa RNA PCR Kit)，然后進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為50 μ L，包含去離子水， 10XPCR 緩沖液 5yL，dNTP I μ LjMgCl2 3 μ L，引物各 I μ L，cDNA 模板 I μ L，Taq 酶 O. 5 μ L。 PCR條件為94° C 3分鐘，隨之以94° C 50秒、60° C 50秒、和72° C 50秒進行28個循環(huán)，最后在72° C延伸8分鐘。1%瓊脂糖電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，獲得擴增片斷長度為 758bp0
電泳分離后，回收(上海華舜生物工程有限公司PCR產(chǎn)物回收試劑盒)目的片斷， 取適量回收產(chǎn)物與pMD 18-T載體(TaKaRa PMD 18-T Vector試劑盒)連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5a，在LB+氨芐青霉素(lOOmgL—1)固體培養(yǎng)基上抗性篩選陽性克隆，PCR鑒定后測序(上海博亞生物工程公司完成)。
2、CaMV35S組成型啟動子表達載體pCAMBIA-CaAOC的構(gòu)建將經(jīng)過測序驗證正確后的DH5 α (已經(jīng)轉(zhuǎn)入帶有喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶基因核心片斷的pMD 18-T載體)搖菌，擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用5^1和fciEII雙酶切，1%瓊脂糖電泳后回收小片斷。
將pCAMBIA1304用5^1和fciEII雙酶切，1%瓊脂糖電泳后回收大片斷。
將回收的pCAMBIA1304大片斷和喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶基因核心片斷用T4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，LB+卡那霉素(100 mgL—1)固體培養(yǎng)基上篩選陽性抗性克隆，PCR和雙酶切鑒定。獲得轉(zhuǎn)喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶基因核心片斷的重組質(zhì)粒并命名為 pCAMBIA1304-CaA0C。
3、pCAMBIA1304-CaA0C 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 EHA105將pCAMBIA1304-CaA0C轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌菌株EHA105，劃板挑取陽性單菌落搖菌，取少量菌液抽提質(zhì)粒，進行PCR和酶切鑒定。陽性克隆定義為EHA105-CaA0C。
實施例2獲得抗凍能力提聞的轉(zhuǎn)基因煙草。
1、農(nóng)桿菌EHA105-CaA0C。使用前自冰箱取出，接種于50 ml YEB液體(Rif+，Str+， Kan+), 28度，200rpm振蕩培養(yǎng)兩次。
2、第二次活化OD600達O. 3時加100 μ mo I Γ1乙酰丁香酮，繼續(xù)28度，200rmp振蕩培養(yǎng)，OD600達O. 6時室溫下4000rpm離心10分鐘。
3、棄上清，菌體用MS (加100 μ mo I Γ1乙酰丁香酮)液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的0D_=0. 3左右，稱轉(zhuǎn)化液。
4、取煙草無菌苗的幼嫩、健壯葉片，去主脈，將葉片剪成O. 8 cmX0.8 cm左右的葉盤，放在MS (加I mg Γ1 6-芐氨基嘌呤，I mg L—1萘乙酸)培養(yǎng)基上，防止葉盤脫水；將葉盤放入農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中，190 rpm, 28°C搖床上浸染10 min ;用藥勺撈出葉盤，放在滅菌的吸水紙上，吸干葉盤上的多余菌液；將吸干的葉盤平放在加蓋一層濾紙的MS (加I mg Γ1 6-芐氨基嘌呤，I mg L—1萘乙酸)培養(yǎng)基上，25°C左右，于暗處共培養(yǎng)約2天。
5、共培養(yǎng)后，按以下步驟將葉盤表面的農(nóng)桿菌洗掉，其間不時搖動，使葉盤充分接觸溶液a)無菌水15分鐘 b)無菌水+羧節(jié)青霉素(500mg L—1)15分鐘c)MS+羧芐青霉素(500 mg I/1)20分鐘接著用藥勺撈出葉盤，放在吸水紙上，吸干多余水分；將葉盤放在MS (含30 mg Γ1潮霉素和250 mg Γ1羧芐青霉素)培養(yǎng)基上，葉盤邊緣輕壓入培養(yǎng)基中；25°C左右，16 h/24 h光照培養(yǎng)；約20天后可見分化芽長出，待芽長大后，切下，置于MS(含O. 5 mg Γ1萘乙酸、 30 mg/T1潮霉素和250 mg/T1羧芐青霉素)培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)；約14天之后將幼苗移栽到裝有1:1:1的泥炭土、蛭石和珍珠巖混合物小型的塑料花盆中在25 °C、14 h光/24 h 的條件下生長。
6、用PCR分別檢測潮霉素抗性基因和喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶基因在轉(zhuǎn)基因煙草的基因組中的整合，確認轉(zhuǎn)基因事件。
實施例3轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草對照的抗凍能力檢測1、比較轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因煙草抗凍能力，用煙草葉片低溫處理后的離子泄漏率來表征其對低溫的耐受性能。(參考文獻Wallis，J. G., Wang, H. Y., and Guerra, D. J. (1997) Expression of a synthetic antifreeze protein in potato reduces electrolyte release at freezing temperatures. Plant Mo1. Biol. 35, 323-330 ； Nunes, M. E. S. and Smith, G. R. (2003). Electrolyte leakage assay capable of quantifying freezing resistance in rose clover. Crop ScL 43, 1349-1357)；2、分別稱取對照和轉(zhuǎn)基因煙草生長期和生長狀態(tài)較一致的葉片每份0.5克，用去離子的蒸餾水沖洗三次，放入一 20° C處理30分鐘；3、在室溫解凍I小時，每份樣品中加入30ml超純水，再于25°C、100 rpm振蕩2小時，用數(shù)字式電導(dǎo)率儀測定溶液的電導(dǎo)率Re ；4、接著將樣品在原溶液中煮沸30min，再測定溶液的電導(dǎo)率Re’ ；5、定義相對電導(dǎo)率=Rc/Rc’X 100% ；6、六個被檢測的轉(zhuǎn)基因系都顯示出對低溫處理較高的耐受性。經(jīng)過-20°C處理后， 六個轉(zhuǎn)基因系植株的葉片離子的泄漏率分別為15. 04% (1. 81%)，15. 51% (1. 94%)，12. 82% (1. 18%), 17. 28 % (3. 64%), 11. 07% (O. 86%), 23. 45% (4. 96%);野生型煙草-20。C 處理后的離子泄漏率為75. 65% (2. 62%);轉(zhuǎn)空載體對照煙草-20° C處理后的離子泄漏率為74. 36% (3.52%)。其中括號中為標準偏差。轉(zhuǎn)基因煙草的離子泄漏率水平為空白對照和空載體對照的四分之一左右。
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，具有編碼丙二烯氧化物環(huán)化酶的核苷酸序列的核心片斷， 該核心片斷來源于丙二烯氧化物環(huán)化酶基因的核苷酸序列，用引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO: 3，采用PCR法從喜樹cDNA文庫中擴增獲得，喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶基因的cDNA序列見SEQ ID NO :1，其全長1129bp，開放閱讀框位置為第72位堿基到第812位堿基。
2.—種高效表達載體,其特征在于它包含如權(quán)利要求1所述的DNA分子。
3.一種用如權(quán)利要求2所述高效表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
4.一種利用基因工程方法增強煙草抗凍性能的方法，其特征在于利用具有編碼喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶的核苷酸序列的植物表達載體，采用轉(zhuǎn)基因方法在煙草細胞、組織、器官或植株中過量表達喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶基因的DNA分子；其具體步驟如下(1)采用基因克隆或人工合成基因方法獲得喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶基因的片斷；(2)把喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶基因片斷連于表達調(diào)控序列，形成植物高效表達載體；(3)采用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶基因片斷到煙草的細胞、組織、器官或植株中；(4)篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子；(5)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，獲得轉(zhuǎn)基因后代；(6)測定轉(zhuǎn)基因后代的抗凍性能。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學以及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種利用喜樹AOC基因轉(zhuǎn)化提高煙草抗凍性能的方法。本發(fā)明包含利用喜樹丙二烯氧化物環(huán)化酶(AOC)基因構(gòu)建植物表達載體，利用基因工程技術(shù)在煙草中過量表達喜樹AOC基因，增強煙草抗凍性能。其過程是從喜樹中克隆AOC基因，構(gòu)建了植物高效表達載體，導(dǎo)入農(nóng)桿菌并遺傳轉(zhuǎn)化煙草，測定轉(zhuǎn)基因煙草葉片低溫處理后的電導(dǎo)率。本方法可以在煙草中過量表達喜樹AOC基因，提高煙草的抗凍性能。
文檔編號C12N15/61GK102994533SQ20121057805
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者皮妍, 崔勇, 蔣科技, 孫小芬 申請人:復(fù)旦大學