RhoA重組蛋白在制備提高胚胎抗凍性以及解凍后復蘇率的培養液中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了RhoA重組蛋白在制備提高胚胎抗凍性以及解凍后復蘇率的培養液中的應用。研究發現，在小鼠正常孵化胚胎的培養液中添加體外重組RhoA蛋白與對照組相比能夠顯著提高正常孵化胚胎的解凍復蘇率。本發明將RhoA重組蛋白首次應用于胚胎冷凍領域，通過RhoA重組蛋白的添加顯著提高胚胎的抗凍性以及解凍后的復蘇率，一定程度上減少了有毒冷凍保護劑的使用，從而降低了對胚胎的不利影響，RhoA重組蛋白在胚胎的冷凍保存【技術領域】將具有廣泛的應用前景。
【專利說明】RhoA重組蛋白在制備提高胚胎抗凍性以及解凍后復蘇率 的培養液中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及RhoA重組蛋白的新用途，特別涉及RhoA重組蛋白在制備提高胚胎抗 凍性以及解凍后復蘇率的培養液中的應用，本發明屬于胚胎冷凍保存【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 在家畜繁殖領域中，胚胎冷凍保存技術等方面發展迅速，在畜牧業中，通過對冷凍 保存的囊胚進行解凍，之后在適當的時間移植到受體母畜中已成為一種十分普遍的操作方 法。到目前為止，實際生產過程中采用進口的聚乙二醇作為冷凍液的使用已經在實際的冷 凍應用中起到了較好的效果。但是胚胎經過過冷凍后40%都會在冷凍過程中受到損傷，使 得胚胎在移植后的成活率降低，而且這些冷凍液仍會給胚胎帶來或多或少的毒性及危害。
[0003] 因此，開發出一種可提高胚胎的抗凍性以及解凍后的復蘇率的方法是目前十分迫 切的需要。
[0004] 本發明通過體外培養液中添加一定RhoA體外重組蛋白，胚胎培養6h后經過程序 化冷凍后觀察其解凍復蘇率，希望能夠從中找出一種毒性低且能夠提高胚胎抗凍機能的物 質，從而應用在家畜胚胎冷凍行業。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供RhoA重組蛋白在制備提高胚胎抗凍性以及解凍后復蘇率 的培養液中的應用。
[0006] 為了達到上述目的，本發明所采用的技術手段為：
[0007] 本發明通過在試驗中添加體外重組的RhoA蛋白進行胚胎的體外培養，探索這種 體外重組的RhoA蛋白是否使小鼠胚胎抗凍性提高，從而是否可以將其應用在規模化的胚 胎冷凍領域。研究發現，在小鼠正常孵化胚胎的培養液中添加體外重組RhoA蛋白與對照組 相比能夠顯著提高正常孵化胚胎的解凍復蘇率（P〈〇. 05)。在Y-27632中培養2h后再放到 RhoA體外重組蛋白中培養6h后進行冷凍，解凍復蘇后結果與對照組相比極顯著的降低。說 明RhoA重組蛋白不能夠使Y-27632對于胚胎的損傷可逆。以上研究證明：體外添加重組的 RhoA蛋白可以顯著提高正常孵化胚胎的解凍復蘇率。
[0008] 在此研究的基礎上，本發明提出了 RhoA重組蛋白在制備提高胚胎抗凍性以及解 凍后復蘇率的培養液中的應用。
[0009] 在本發明中，優選的，所述的RhoA重組蛋白為人源RhoA重組蛋白，其gene bank 登錄號為 Accession:NP_001655. 1。
[0010] 進一步的，本發明還提出了一種提高胚胎抗凍性以及解凍后復蘇率的培養方法， 其特征在于包括向胚胎培養液中加入RhoA重組蛋白。
[0011] 其中，優選的，所加入的RhoA重組蛋白在培養液中的終濃度為1 μ g/μ 1。
[0012] 其中，優選的，所述的培養方法包括以下步驟：
[0013] 獲取的正常孵化胚胎用CZB溶液清洗3次，之后再進行體外培養，具體為在37°C、 5%的CO 2空氣和100%濕度條件下，用四孔板進行體外培養，且分別向培養液中添加 RhoA 重組蛋白，使其終濃度為1 μ g/μ 1，經過體外培養6h后將胚胎進行程序化冷凍，解凍復蘇 后再放入平衡過的新CZB溶液中進行24h的復蘇。
[0014] 相較于現有技術，本發明的有益效果在于：
[0015] 1、將RhoA重組蛋白首次應用于胚胎冷凍領域，通過RhoA重組蛋白的添加顯著提 高胚胎的抗凍性以及解凍后的復蘇率；
[0016] 2、通過在含RhoA重組蛋白的培養液中培養，一定程度上增強了胚胎在冷凍過程 中的抗低溫能力，減少其在冷凍過程中受到的損傷，從而降低了冷凍過程對胚胎的不利影 響。
[0017] 3、將RhoA重組蛋白直接添加到即將要冷凍胚胎的培養液中，增強其抗低溫損傷 的能力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為添加抑制劑及重組蛋白后對小鼠正常解凍復蘇率的影響；
[0019] 圖2為正常孵化胚胎在冷凍前、添加或不添加人源體外重組RhoA蛋白冷凍后Oh、 添加或不添加人源體外重組RhoA蛋白冷凍后24h后的圖；
[0020] 其中，1?3圖分別為正常孵化胚胎的冷凍前、不添加人源體外重組RhoA蛋白冷凍 后Oh、不添加人源體外重組RhoA蛋白冷凍后24h，4?6圖分別為正常孵化胚胎的冷凍前、 添加人源體外重組RhoA蛋白冷凍后Oh、添加人源體外重組RhoA蛋白冷凍后24h。

【具體實施方式】
[0021] 下面結合具體實施例來和附圖進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著 描述而更為清楚"但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制"本領 域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節 和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0022] 實施例1
[0023] 1、材料
[0024] I. 1主要儀器和設備
[0025] 移液器：北京百晶移液器（lmL、200y L、100y L、10y L)
[0026] 醫用離心機：北京醫用離心機廠，LDZ4-0. 8
[0027] CO2 培養箱：Heal Force 公司，HF9O
[0028] 體視顯微鏡：江南顯微鏡廠，Xl 1-3
[0029] 超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司，ZHJH-1112B
[0030] 電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司，BS124S
[0031] 酸度計：Thermo 公司，868
[0032] 精密加熱板：貝達儀器公司，MEH-2
[0033] 水浴鍋：北京長安科學儀器廠，HH · Sl-Ni
[0034] 1. 2主要試劑
[0035] I. 2· 1 人源體外重組 RhoA 蛋白，購自 Sino Biological 公司，貨號：12441-H07B。
[0036] 1. 2. 2配重組蛋白體外培養液：在50 μ g的體外重組蛋白配成10 μ g/ μ 1的儲液。 保存在4°C。
[0037] L 2. 3培養液配制（CZB儲液）：
[0038]

【權利要求】
1. RhoA重組蛋白在制備提高胚胎抗凍性以及解凍后復蘇率的培養液中的應用。
2. 如權利要求1所述的應用，其特征在于所述的RhoA重組蛋白為人源RhoA重組蛋白， 其 gene bank 登錄號為 Accession:NP_001655. 1。
3. 如權利要求1所述的應用，其特征在于所述的胚胎為正常孵化胚胎。
4. 一種提高胚胎抗凍性以及解凍后復蘇率的培養方法，其特征在于包括向胚胎培養液 中加入RhoA重組蛋白。
5. 如權利要求4所述的培養方法，其特征在于所加入的RhoA重組蛋白在培養液中的終 濃度為1 μ g/μ 1。
6. 如權利要求5所述的培養方法，其特征在于包括以下步驟： 獲取的正常孵化胚胎用CZB溶液清洗3次，之后再進行體外培養，具體為在37°C、5 %的 C02空氣和100%濕度條件下，用四孔板進行體外培養，且分別向培養液中添加 RhoA重組蛋 白，使其終濃度為1 μ g/ μ 1，經過體外培養6h后將胚胎進行程序化冷凍，解凍復蘇后再放 入平衡過的新CZB溶液中進行24h的復蘇。
【文檔編號】A01N1/02GK104278011SQ201410483815
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月19日 優先權日:2014年9月19日
【發明者】郭勇, 倪和民, 劉云海, 顧美超, 齊曉龍 申請人:北京農學院