專利名稱：一種應用角質酶進行酯合成的方法
技術領域：
本發明涉及一種應用角質酶合成酯的方法，屬于酶工程技術領域。
背景技術：
酯是由酸與醇反應失水而生成的一類化合物，廣泛應用于食品、釀酒、飲料、醫藥、保健品、日用化工等各領域。目前酯類物質的生產基本采用化學法，由無機催化劑(如濃硫酸)在高溫下催化酸和醇的酯化反應而得。雖然生產成本較低，但過程中一些難以控制的副反應使得產品品質不高，強酸對設備的腐蝕也會增加維修費用，更重要的是，此法造成的環境污染不符合當今可持續發展的主流。而酶法合成酯類物質具有反應條件溫和、能耗低、環 境污染小、并且產品品質好的優勢，因此開發酶制劑在酯合成中的應用重要的現實意義和經濟價值。角質酶是一種多功能酯酶，既可催化水解不溶性多聚物角質和各種聚酯的酯鍵，也可以作用于其它長鏈、短鏈脂肪酸酯、乳化的甘油三酯等。除了水解反應外，角質酶還能催化酸與醇的酯化、一些脂肪酸鹽與醇的轉酯化。目前已有報道來源于真菌F. solani的角質酶在短鏈酯合成中的應用，其中己酸乙酯合成的轉化率最高,為97%，但加酶量很高，為240U/mL,且中長鏈的酯合成轉化率很低。本研究室在前期工作中鑒定了來源于Thermobifida fusca的兩種角質酶Tfu_0882和Tfu_0883。本發明提供了該角質酶在酯合成中的應用方法。

發明內容
本發明提供了 Thermobifida fusca角質酶在酯合成中的應用方法。為解決上述問題，本發明技術方案為采用來源于Thermobififda fusca的角質酶進行酯合成,底物濃度為O. 1_1M,酸與醇的摩爾比為 1:1-2，加水量 O. 03-0. 08%,加酶量為 10-80U/mL，40-60°C、100-200rpm,反應時間4-15h，不同鏈長的酯的反應時間依據達到最高轉化率時所需的時間而定。轉化率以消耗的酸與初始的酸含量的比值來計。上述酶促反應條件與酶的性質有關系，也可根據酶加入量調整相應的工藝參數。所述酶促反應優先在有機溶劑中進行，并且有機溶劑的選用為本領域常規技術手段，更進一步地優先選用異辛烷或正己烷。所述角質酶的生產方法為在一定培養條件下，以生產角質酶的重組大腸桿菌(Chen S，Tong X, Woodard Rff,Du GC, Wu J, Chen J, Identification and Characterizationof Bacterial Cutinase,The Journal of Biological Chemistry,2008,283 (28)25854-25862)發酵一定時間，經過12000rpm，離心lOmin，去除菌體，上清即為粗酶液，再經過真空冷凍干燥，獲得角質酶的酶粉。所述角質酶活性的測定方法為以對硝基苯丁酸酯(PNPB)為底物，采用分光光度法在20° C下測定。反應體系為111^，包括96(^1^緩沖液(201111 Tris - HCl, IOmM NaCl,50mM sodium taurodeoxycholate, ρΗ8· 0), 20 μ L 酶液，20 μ L ρΝΡΒ (ImM,乙臆中保存)，在405nm處，記錄對硝基酚的生成速率。酶活定義20° C下，每分鐘催化對硝基苯丁酸酯生成I μM對硝基酚的酶量即為一個酶活力單位。所述有機試劑和底物酸、醇均需用4Α型分子篩除水，防止對反應體系中水含量的影響。所述酸的檢測方法為氣相檢測儀器為GC-2010，GAS CHROMATOGRAPH SHIMADZU,色譜柱為RTX-WAX(30mX 0. 32mm)，檢測器為FID，載氣為N2,流速3mL/min，柱溫條件為50°C(3min) -10°C min_1-220°C (lmin)。
具體實施例方式實施例1本實施例以Thermobifida fusca來源的角質酶Tfu_0883進行催化反應。有機試劑和底物酸、醇采用4A型分子篩除水之后用于酯合成。反應條件0.1M酸、0. 2M醇，加水量0. 03%, 500C，150rpm,酶30U/ml，反應溶劑異辛烷，具體結果見表1、表2。表I
權利要求
1.一種應用角質酶進行酯合成的方法，其特征在于，在酸與醇的反應體系中加入Thermobifida fusca 角質酶。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述角質酶為來源于Thermobifidafusca, NCBI 編號分別為 AAZ54920 和 AAZ54921。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述酸的碳鏈長度為C1-C18。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述醇的碳鏈長度為C1-C10。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述酸與醇的摩爾比為O.5-1。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述反應體系為反應溶劑為有機溶劑，加水量O. 03-0. 08%，加酶量為10-80U/mL。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述有機溶劑為異辛烷或正己烷。
8.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，反應體系為異辛烷，加水量O.03-0. 08%,加酶量為10-80U/mL。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，酶催化反應條件為40-60°C，100-200rpm。
全文摘要
本發明公開了一種應用角質酶進行酯合成的方法，在酸與醇的反應體系中加入Thermobifida fusca角質酶，角質酶為來源于Thermobifida fusca，NCBI編號分別為AAZ54920和AAZ54921，所述反應體系為反應溶劑為有機溶劑，加水量0.03-0.08%，加酶量為10-80U/mL。本發明的生產工藝，具有流程簡單、轉化率高、適用范圍廣等優勢。
文檔編號C12P7/62GK103014079SQ20121058108
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者吳敬, 宿玲恰, 陳堅 申請人:江南大學