專利名稱：角質酶變體的制作方法
技術領域：
本發明涉及角質酶(cutinase)變體，更具體的涉及熱穩定性改善的角質酶變體。本發明還涉及編碼該變體的DNA序列，包含所述DNA序列的載體，攜帶所述DNA序列或所述載體的轉化宿主細胞，還涉及制備所述變體的方法，和所述變體的用途。
背景技術：
角質酶是可以水解底物角質的脂解酶(lipolytic enzyme)。已知角質酶來自不同的真菌(P.E.Kolattukudy在“Lipases”，Ed.B.Borgstrm andH.L.Brockman，Elsevier 1984，471-504)。Fusarium solani pisi角質酶的氨基酸序列和晶體結構已經被描述(S.Longhi et al.，Journal ofMolecular Biology，268(4)，779-779(1997))。已經公開了Humicolainsolens角質酶的氨基酸序列(US5,827,719)。
許多Fusarium solani pisi角質酶的變體已經被公開WO 94/14963；WO94/14964；WO00/05389；Appl.Environm.Microbiol.64，2794-2799，1998；ProteinsStructure，Function and Genetics 26，442-458，1996；J.of Computational Chemistry 17，1783-1803，1996；ProteinEngineering6，157-165，1993；ProteinStructure，Function，andGenetics33，253-264，1998；J.of Biotechnology66，11-26，1998；Biochemistry35，398-410，1996；Chemistry and Physicsof Lipids97，181-191，1999；ProteinsStructure，Function andGenetics 31，320-333，1998；Biochimica et Biophysica Acta1441，185-196，1999；Appl.Environm.Microbiol.64，316-324，1998；BioTechniques 27，1102-1108，1999。
真菌角質酶可以用在聚(對苯二甲酸乙二酯)(poly(ethylene terephthalate))的環狀寡聚體(cyclicoligomers)的酶水解上，例如在自聚(對苯二甲酸乙二酯)纖維(WO97/27237)的紗或織品整理(finishing)中應用。期望改善真菌角質酶的熱穩定性以允許有更高的處理溫度。
發明概述本發明人已經發現某些真菌角質酶的變體有改善的熱穩定性。所述變體包括在如下位點的一個或多個氨基酸殘基的取代，Q1，L2，A4，G8，S11，N15，A16，T29，V38，N44，S48，H49，L66，A88，N91，S116，S119，G120，A130，Q139，T164，T166，L167，I168，I169，L174，I178，R189和/或N末端延伸AAVDSNHTPAVPELVAR(SEQ ID NO2)。這些變體還可選擇地包括在其它位點的額外改變。
本發明還提供了編碼本發明變體的DNA序列，包含此DNA序列的表達載體，攜帶該DNA序列或表達載體的轉化宿主細胞，一種制備所述變體的方法，以及應用該變體的方法和包含該變體的去污劑組合物。
本發明還提供了一種制備角質酶變體的方法，所述方法是通過在一個或多個指示位點或包含這樣位點的區域引入氨基酸的改變(取代，缺失或插入)，并且篩選熱穩定性改善的變體而進行的。所述氨基酸的改變可以由例如定位隨機突變(localized random mutagenesis)或定點誘變而產生。
發明詳述真菌角質酶親代酶是根據酶命名法(在http//www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme中可得到)被分類為EC3.1.1.74的角質酶。它是一種真菌角質酶，諸如絲狀真菌角質酶，例如來自腐質霉屬或鐮孢屬菌株，具體為H.insolens或腐皮鐮孢pisi，更具體為H.insolens菌株DSM 1800。
SEQ ID NO1顯示了Humicola insolens菌株DSM1800的角質酶氨基酸序列(成熟肽)和本文對Humicola insolens角質酶所用的編號系統。該氨基酸序列和編碼它的DNA序列以前公布為US5,827,719的SEQ ID NO2和SEQ ID NO1。
Fusarium solani pisi角質酶的氨基酸序列如WO94/14964的

圖1D中的成熟肽所示。本文對Fusarium solani pisi角質酶所用的編號系統是WO94/14964中所用的；它包括所述圖1D中的前體序列(pro-sequence)；所以成熟角質酶在位點16-215。
所述親代角質酶與Humicola insolens菌株DSM 1800角質酶有至少50％(特別是至少70％或至少80％)同源性的氨基酸序列。更具體地，該親代角質酶是可與Humicola insolens菌株DSM1800角質酶序列對比的。
氨基酸和其改變的命名法說明書與權利要求書中在提到氨基酸時使用它們的單字母密碼。序列中特定的氨基酸用其單字母編碼和其位置來確定，例如，Q1表示Gln(谷氨酸在位置1，即，在N末端)。
本文用來定義取代的命名法以WO92/05249中所述的命名法為基礎。所以，S11T表示在位點11用T(Thr)來取代S(ser)。Q1C/L表示用C(Cys)或L(Leu)取代Q(Gln)。
同源性與序列對比為了本發明的目的，同源性(同一性)的程度可根據Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-45中描述的方法來適當的測定，并且遵循以下的肽段序列比較設定GAP生成罰分值(creation penalty)為3.0，GAP延伸罰分值為0.1。同源性的測定可用例如GCG軟件包(Program Manual for the Wisconsin Package，第八版，1994年八月，Genetics，Computer Group，575Sciences Drive，Madison，Wisconsin，USA53711)中提供的GAP計算機程序來進行。
兩個給出的序列可以根據Neddleman(同上)中描述的方法，使用相同的參數來進行序列對比。這些可以通過GAP程序(同上)完成。
親代角質酶和角質酶變體間的同源性可以高于80％，例如，高于85％或90％，尤其是高于95％。
特定的取代變體尤其包括相應于下面Humicola insolens角質酶中(Humicolainsolens角質酶的編號)的一個或多個取代Q1C/L，L2K/Q/V，A4V，G8D，S11T，N15D，A16T，T29C/I/M，V38H，N44D，S48E/K，H49Y，L66I，A88H/L/V，N91H，S116K，S119P，G120D，A130V，Q139R，T164S，T166M/I，L167P，I168F，I169A/G/T/V，L174F，I178V和/或R189A/H/V。
更具體地，角質酶變體可包括如下所述取代或取代的組合
可選的取代除了上面描述的取代，該角質酶變體還可選擇的包括一個或多個其它氨基酸的改變，尤其是相應于下面Humicola insolens角質酶中(Humicolainsolens角質酶的編號)的一個或多個氨基酸殘基的取代Q1，L2，E6，E10，S11，A14，N15，F24，L46，E47，R51，D63，L138和/或E179，更具體地，有相應如下的一個或多個取代Q1P，L2V，E6Q，E10Q，S11C，A14P，N15T，F24Y，L46I，E47K，R51P，D63N，L138I和/或E179Q。
更具體地，角質酶變體還可包括如下取代或取代的組合R51PE6N/Q+L1381A14P+E47KE47KE179N/QE6N/Q+E47K+R51PA14P+E47K+E179N/QE47K+E179N/QE47K+D63NE6N/Q+E10N/Q+A14P+E47K+R51P+E179N/QE6N/Q+A14P+E47K+R51P+E179N/QQ1P+L2V+S11C+N15T+F24Y+L461+E47K角質酶變體的用途本發明的角質酶變體可以用來，例如，酶水解聚對苯二甲酸乙二酯環狀寡聚體，例如環狀三聚對苯二甲酸亞乙酯(cyclic tri(ethyleneterephthalate))，簡稱c3ET。
尤其是，本發明可以通過用角質酶處理織品或紗，來去除含聚酯的織品或紗中的所述環狀寡聚體，任選地，然后還可用pH值在約7到約11范圍內的水溶液沖洗。對聚酯的處理可以在高于c3ET的玻璃化轉變(glasstransition)溫度(約55℃)而低于聚酯的玻璃化轉變溫度(約70℃)的條件下進行。該方法可以參考WO97/27237進行。
所述角質酶變體可以用來處理含聚酯的紡織品，例如，PET(乙二醇和對苯二酸的聚合物)，P3GT(1，3丙二醇和對苯二酸的聚合物)或聚酯/棉混合物。這種處理對聚酯紡織品有好處，例如，耐磨損度增加，更加舒適，透水性增加，抗靜電(reduced antistatic behavior)，改善手感和柔軟度，改變再沉積特性和/或顏色澄清(color clarification)。
通過用該角質酶變體處理，所述角質酶變體可以用于改善對含PET的紗或紡織品的功能性整理，然后再加入整理劑(finishing agent)，例如，軟化劑(softener)，抗皺樹脂，抗靜電劑，抗油劑，或能賦予(impair)無皺褶(wrinkle free)，永久緊縮，防火(permannene press ior fireresistance)等效果的試劑。用角質酶變體進行處理可以增加表面的官能團的數量，可以用以附著功能性整理劑。修飾劑的實例在由Nihon Seni SentaaKK在1998-10-15出版的“SENSHOKUSIAGEKAKO BENRAN”中描述。
本發明所述角質酶變體還可用在去污劑中，可將其整合用來增加去除脂肪污的作用，例如WO94/03578和WO94/14964中所述。在洗滌去污劑中添加角質酶變體可以去除衣物經多次洗/穿循環所積累的惡臭。
本角質酶變體還可用于降解和回收聚酯，例如聚己酸丙酯(PCL)，聚-乙二醇-對苯二酸(PET)，聚乳酸，聚丁烯琥珀酸酯(polybutylenesuccinate)，和聚(羥基丁酸)合(羥基戊酸)，例如，膠片和瓶子，例如，JP-A5-344897中所述。
角質酶變體還可用于其它已知的脂肪酶和角質酶的應用中，例如，烘烤工業(例如WO94/04035和EP585988中所述)，造紙工業(如去除樹脂(pitch removal)見EP374700)，和皮革，毛織品或相關工業(如動物皮革，羊皮革或羊毛的去脂)，和其它涉及到去脂/去油的應用。它還可在油脂工業中以固定化形式使用，作為有機合成的催化劑(如，酯化作用，酯基轉移或酯水解反應)。
聚酯染色本發明提供了一種對聚酯織品或紗(yarn)進行染色的方法。該方法中，先用角質酶處理織品或紗，例如，在50-70℃或65-70℃，pH7-10的條件下處理12-48小時，然后用染料染色，例如，活性染料，分散染料或陽離子染料。所述活性染料可以是一種可與OH或COOH基團反應的染料，例如，具有生色團(chromophore)-NHPh-SO2CH2CH2OSO3Na結構。染色可以在40-80℃條件下進行，例如，染色20-60分鐘。
所述角質酶可以是熱穩定角質酶，其熱變性溫度Td，在pH8.5至少高出親代角質酶5℃，例如，高出7-10℃，例如一個65℃或更高的值。可通過說明書中實施例所描述的DSC方法進行測量。
表面活性劑在處理織品或紗的時候，可以使用常規濕潤劑和/或分散劑來改善與酶的接觸。濕潤劑可以是非離子型表面活性劑，例如，乙氧基脂肪醇。非常有用的濕潤劑是乙氧基(ethoxylated)和丙氧基脂肪酸酯如Berol 087(AkzoNobel產品，瑞典)。
分散劑可以適當選自非離子的，陰離子的，陽離子的，兩性電解質的或兩性離子的表面活性劑。更具體的，分散劑可以選自羧甲基纖維素，羥丙基纖維素，烷基芳基磺化物，長鏈醇硫酸鹽(sulfates)(一級和二級的烷基硫酸鹽)，磺化石蠟，硫酸化甘油單脂肪酸酯，硫酸化醚，磺酸琥珀酸鹽，磺酸化甲醚，鏈烷磺酸鹽(alkane sulfonates)，磷酸酯，烷基isothionates，acylsarcosides，烷基牛磺酸鹽，氟化物表面活性劑(fluorosurfactants)，脂肪醇和烷基苯酚縮合物(condensates)，脂肪酸縮合物，乙烯氧化物和胺的縮合物，乙烯氧化物和酰胺的縮合物，蔗糖酯，山梨糖酯，alkyloamides，脂肪胺氧化物，乙氧基化一元胺，乙氧基化二元胺，脂肪醇乙氧基化物和它們的混合物。一個非常有用的分散劑是脂肪醇乙氧基化物(alcoholethoxylate)，例如Berol 08(Akzo Nobel產品，瑞典)。
制備角質酶變體的方法本發明的角質酶變體可以用本領域已知的方法制備，例如，WO94/14963或WO94/14964(Unilever)中所描述。下面描述了克隆角質酶編碼DNA序列的方法，然后是在角質酶編碼序列的特定位點產生突變的方法。
編碼角質酶的DNA序列的克隆利用本領域所熟知的各種方法，編碼親代角質酶的DNA序列可以從任意一種產生所述角質酶的細胞或微生物中分離。首先，用產生所述角質酶的生物的染色體DNA或信使RNA來構建基因組DNA和/或cDNA文庫。然后，例如果該角質酶的氨基酸序列已知，合成標記的寡核苷酸探針，用它從上面所述生物的基因組文庫中鑒定出編碼角質酶的克隆。或者，低嚴緊度的雜交和洗脫條件下，還可選擇用包含與另一已知的角質酶基因具有序列同源的標記寡核苷酸探針來鑒定編碼角質酶的克隆。
還有一種鑒定編碼角質酶克隆的方法是把基因組DNA片斷插入表達載體，例如質粒，用得到的基因組DNA文庫轉化角質酶陰性細菌，然后把轉化過的菌在含有角質酶底物(即麥芽糖)的瓊脂上涂板，以使表達角質酶的克隆能被鑒定出來。
或者，編碼所述酶的DNA序列可以用已確定的標準方法來合成制備，例如，用S.L.Beaucage和M.H.Caruthers，(1981)，Tetrahedron Letters22，p.1859-1869中描述的phosphoroamidite法，或Matthes et al.(1984)，EMBO J.3，p.801-805中描述的方法。在phosphoroamidite中，寡核苷酸的合成是在DNA自動合成儀中合成，純化，退火，連接和克隆在合適的載體中進行。
最后，應用標準技術，DNA序列可以是來自基因組和合成的混合來源，合成物和cDNA的混合來源或基因組和cDNA的混合來源，通過連接合成的，基因組，cDNA來源的片斷來制備(合適地，相應于整個DNA序列的各部分片斷)。DNA序列還可以用特異引物，經聚合酶鏈式反應(PCR)制備，例如，如US4,683,202或R.K.Saiki et al.，(1988)，Science239，1988，pp.487-491中描述。
角質酶變體的構建角質酶變體可以用在選定位點進行定點誘變或局部隨機誘變得到，即在親代角質酶的選定位點或區域引入隨機的氨基酸殘基，例如，WO95/22615中描述的。更優選的方法使用摻雜的(doped)的或摻加的(spiked)寡核苷酸來進行突變。
選定的位點可以是上面說的一個或多個位點，選定的區域可以是包含一個或多個這樣位點的區域。下面是一些特例A.摻加的寡改組(oligo shuffling)文庫(Library S144，46，48，51，55文庫S248，66，88，91，119，169，189文庫S326，66，70，139，167，168，169，174文庫S44，5，6，33，34文庫S56，7，8，9，55，56，57B.摻雜的文庫文庫142-52文庫259-77文庫3116-122文庫41-16文庫569，70，73文庫6140-145文庫7161，162，164-174定點誘變當角質酶編碼DNA序列被分離出來，并且希望突變的位點鑒定出后，就可以用合成的寡核苷酸引入突變。這些寡核苷酸包括側接希望突變的位點的核苷酸序列。用一種具體的方法，在攜帶所述角質酶基因的載體中產生DNA的一個單鏈缺口，所述DNA為角質酶編碼序列。然后，攜帶所希望的突變的合成核苷酸，被退火到所述單鏈DNA的同源部分。余下的缺口被DNA聚合酶I(Klenow片斷)補齊，用T4連接酶連接該構建體。所述方法的以特定實例在Morinaga et al.，(1984)，Biotechnology2，p.646-639中描述。US4,760,025公開了通過盒(cassette)的微量變化來引入編碼多突變的寡核苷酸。然而，用Morinaga方法可以在任意一次引入有更大多樣性的突變，因為一個很大數量的不同長度的寡核苷酸可以被引入。
另一種在角質酶編碼DNA序列中引入突變的方法在Nelson和Long，(1989)，Analytical Biochemistry 180，p.147-151中描述。它涉及到產生包括所希望的突變的PCR片斷3個步驟，其中的突變是在PCR反應中用化學合成的DNA鏈作為一個引物而引入的。攜帶突變的DNA片斷可以用限制性內切酶切割而分離，然后再重新插入表達質粒中。
角質酶變體的表達根據本發明，用上述方法或其它本領域所任何可選擇的方法得到的編碼所述變體的DNA序列，可以利用表達載體，以酶的形式表達，其中所述表達載體典型的包括編碼啟動子，操縱子，核糖體結合位點，翻譯起始信號，還可以選擇的包括抑制基因或不同的激活基因的控制序列。
表達載體攜帶編碼本發明角質酶變體的重組表達載體可以是任意一種能方便的進行重組DNA方法的載體，它的選擇常常要取決于它所要引入的宿主細胞。這個載體可以是一種當引入到宿主細胞時，就整合入宿主細胞的基因組，然后隨著所整合的染色體一同進行復制的載體。合適的表達載體實例包括pMT838。
啟動子在載體中，該DNA序列必須可操縱的與合適的啟動子序列相連。所述啟動子可以是任何在所選宿主細胞中顯示出轉錄活性的DNA序列，并且可以衍生自編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白的基因。
可指導本發明的編碼角質酶變體DNA序列進行轉錄的合適的啟動子，尤其是在以細菌為宿主時，是大腸桿菌的lac操縱子的啟動子，天藍色鏈霉菌(5treptomyces colicolor)的瓊脂水解酶(agarase)基因dagA啟動子，地衣形芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的α-淀粉酶(amyL)啟動子，嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearotherophilus)的麥芽淀粉酶基因(amyM)啟動子，解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶(amyQ)啟動子，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的xylA和xylB基因啟動子等等。在真菌宿主中轉錄時，有用的啟動子的實施例是那些衍生自編碼米曲霉(A.oryzae)的TAKA淀粉酶，釀酒酵母(S.cerevisiae)的TPI(丙糖磷酸異構酶)啟動子(Alber et al.(1982)，_J.Mol.Appl.Genetl，p.419-434，R)，米赫根毛霉的天冬氨酸蛋白酶啟動子，黑色曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶啟動子，黑曲霉酸穩定α-淀粉酶啟動子，黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子，米赫根毛霉脂酶啟動子，米曲霉堿性蛋白酶啟動子，米曲霉丙糖磷酸異構酶啟動子或構巢曲酶(A.nidulans)乙酰胺酶啟動子的基因。
表達載體本發明的表達載體還包括合適的轉錄終止子，和在真核細胞中，與本發明的編碼α-淀粉酶的DNA序列可操縱連接的聚腺苷酸化序列。終止和聚腺苷酸序列可以適合的衍生自與啟動子有相同的來源。
所用載體還可以包括一段可以讓載體在所討論的宿主細胞中復制的DNA序列。這樣序列的實施例有質粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的復制起始位點。
所用載體還可包括一個選擇性標記，例如，基因，其產物補充了宿主細胞的缺陷，例如枯草芽孢桿菌或地衣形芽孢桿菌的dal基因，或帶來對抗生素的抗性，例如氨芐青霉素，卡那霉素，氯霉素或四環素抗性。此外，所用載體可包含曲霉屬(Aspergillus)選擇標記，例如amdS，argB，niaD和sC，帶來潮霉素抗性的標記，或用共轉化來實現的選擇，例如WO91/17243中所述。
本方法分別用來連接編碼角質酶變體的本發明DNA構建體，啟動子，終止子，和其它元件，與把它們插入到合適的具有復制所必需的信息的載體中，這些都是本領域技術人員所熟知的(比較，例如，Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor，1989)。
宿主細胞本發明所用宿主細胞，其包括本發明的DNA構建體或如上所定義的表達載體，被方便的用作本發明角質酶變體的重組產生的宿主細胞。該細胞可以很方便的通過整合DNA構建體(一拷貝或多拷貝)到宿主染色體中，而被本發明編碼變體的DNA構建體所轉化。這種整合一般被認為是有利的，因為這樣所述DNA序列在所述細胞中更可能被穩定的維持。將所述DNA構建體整合到宿主染色體中，可以按照常規的方法進行，例如，用同源或異源重組。或者，所述細胞還可以根據宿主細胞類型的不同，用上面所述的表達載體來轉化。
本發明所述細胞可以是高等生物體的細胞，例如，哺乳動物或昆蟲的細胞，尤其是微生物細胞，例如，細菌或真菌(包括酵母)的細胞。
合適的細菌的實施例有，革蘭氏陽性菌如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，緩慢芽孢桿菌(Bacillus lentus)，短芽孢桿菌(Bacillus brevis)，嗜熱脂肪芽孢桿菌，Bacillus alkalophilus，解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)，凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)，環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)，燦爛芽孢桿菌(Bacill lautus)，巨大芽孢桿菌(bacillus megaterium)，蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)，或變青鏈霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰鏈霉菌(Streptomycesmurinus)，或革蘭氏陰性菌例如大腸桿菌。細菌的轉化可以例如，按照熟知的方法用原生質或感受態細胞實現。
酵母有機體優先選自糖酵母屬(Saccharomyces)或裂殖糖酵母屬(Schizos-accharomyces)菌株中選擇，例如啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)。
宿主細胞還可以是絲狀真菌，例如菌株選自曲霉屬(Aspergillus)，尤其是米曲霉或黑色曲霉，或鐮孢屬(Fusarium)的菌株，例如尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)，禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)(在perfectstate叫玉蜀黍赤霉，還曾叫Sphaeria zeae，也稱Gibberella roseum和Gibberella roseum f.sp.cerealis)或硫色鐮孢(FusariumSulphureum)(在perfects tate叫Gibberella puricaris，也叫Fusariumtrichothecioides，桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)，接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)，玫瑰色鐮孢(Fusarium roseum)，與玫瑰色鐮孢var.graminearum)，Fusarium cerealis(也叫Fusarium crokkwellense)，或Fusarium venenatum的菌株。
在本發明特定的實施方案中，宿主細胞是蛋白酶缺陷型或蛋白酶minusstrain。
上述可以是例如的蛋白酶缺陷型菌株米曲霉JaL125，缺失了稱作“alp”的堿性蛋白酶基因。該菌株在WO97/35956(Novo Nordisk)中描述。
絲狀真菌細胞的轉化可通過本領域已知的涉及到原生質的形成和其轉化，然后進行細胞壁的再生的方法進行。利用曲霉屬作宿主微生物在EP238023(Novo Nordisk A/S)中有所描述，在此引入用作參考。
通過培養轉化體制備角質酶變體本發明尤其涉及一種制備本發明角質酶變體的方法，所述方法包括在易于制備所述變體的條件下培養宿主細胞，和從細胞和/或培養基中回收該變體。
用來培養細胞的培養基可以是常規的，適合所述的細胞生長并能得到本發明角質酶變體表達的任何培養基。合適的培養基可以從供應商處得到，或根據公開的配方制備(例如，American Type Culture Collection的目錄中所述)。
宿主細胞中分泌的角質酶變體，通過熟知的方法可以很方便的從培養基中回收，包括用離心或過濾將細胞從培養基上分離，通過鹽，例如硫酸銨，沉淀培養基中的蛋白成份，然后使用層析方法，例如離子交換層析，親和層析等。
在植物中表達變體本發明還涉及到轉基因植物，植物部分或植物細胞，其是被編碼本發明變體的DNA序列所轉化，以使所述酶的表達與制備達到一個可回收的數量。酶可以從植物或植物部分中回收。或者，包含重組酶的植物或植物部分可以同樣的被應用。
所述轉基因植物可以是雙子葉的，或是單子葉的，簡寫為dicot或momocot。單子葉植物的實例有草，例如牧場草(禾本科，bluegrass，Poa)，飼料草，例如festuca，lolium，溫帶草，例如翦股穎，禾谷類，例如小麥，燕麥，黑麥，大麥，水稻，高粱和玉米。
雙子葉植物的實施例有煙草，豆類，例如羽扇豆，馬鈴薯，甜菜，豌豆，豆(bean)，大豆，和十字花科(家種的菜)，例如，花椰菜，菜籽油菜，和親緣關系很近的模式生物擬南芥(Arabidopsis thaliana)。
植物部分的實施例有莖，愈傷組織，葉，根，果實，種子，和塊莖。在本文中，還有一些特定的植物組織，例如葉綠體，質外體，線粒體，液泡，過氧化物酶體和細胞質，也被認為是植物部分。此外，任何植物細胞，無論其組織來源，也被認為是植物部分。
本發明的范圍還包括這些植物，植物部分和植物細胞的后代。
表達本發明變體的轉基因植物和植物細胞可以按照本領域已知的方法構建。簡而言之，植物或植物細胞通過一個或多個編碼本發明所述酶的表達構建體整合到該植物宿主基因組中，然后增殖所得到的修飾過的植物或植物細胞，使它們成為轉基因植物或植物細胞而得以構建。
便利地，所述表達構建體是包括編碼本發明酶基因的DNA構建體，其可操縱地與在選擇的植物或植物細胞中表達該酶基因所需要之合適的調控序列相連接。此外，該表達構建體可以包含選擇性標記，所述選擇性標記可用于鑒定整合了表達構建體的宿主細胞和將構建體導入所述植物中所必需的DNA序列(后者取決于所用的導入DNA的方法)。
調控序列，例如啟動子和終止子序列和其它任選的信號或轉運(transit)序列的選擇的決定，例如是以希望酶何時，何處，怎么表達為基礎的。例如，編碼所述發明酶基因的表達可以是組成型的，誘導型的，或發育，時期或組織特異性的，并且基因產物可以靶向特定的組織或植物部分，例如種子或葉中。調控序列在Tague et al，Plant，Phys.，86，506，1988中有描述。
組成型表達可以應用35S-CaMV啟動子(Franck et al.，1980.Cell 21285-294)。器官特異性啟動子可以是例如用來自貯藏組織(storage sinktissue)，例如種子，馬鈴薯塊莖，果實的(Edwards & Coruzzi，1990.Annu.Rev.Genet.24275-303)，或來自代謝庫組織(metabolic sink tissue)，例如分生組織的(Ito et al.，1994.Plant Mol Biol.24863-878)，種子特異性啟動子例如來自水稻的谷蛋白，醇溶谷蛋白，球蛋白或清蛋白啟動子(Wu et al.，Plant and Cell Physiology Vol.39，No.8pp.885-889(1998))，蠶豆(vicia faba)的B4豆球蛋白的啟動子和由Conrad U.et al，Journal of Plant PhysiologyVol.152，No.6pp.708-711(1998)中所述的蠶豆的未知種子蛋白基因，和來自種子油體(seed oil body)蛋白的啟動子(Chen et al.，Plant and Cell Physiology vol.39，No.9 pp.935-941(1998))，來自歐洲油菜(Brassica napus)的貯藏蛋白napA啟動子，或其它本領域已知的種子特異性啟動子，例如WO91/14772中所描述的。此外，啟動子可以是葉特異性的啟動子，例如來自水稻和番茄的rbcs啟動子(Kyozuka et al.，Plant Physiologyvol.102，No.3pp.991-1000(1993))，小球藻病毒腺嘌呤甲基轉移酶啟動子(Mitra，A.and Higgins，DW，Plant Molecular BiologyVol.26，No.1pp.85-93(1994))，或來自水稻的aldP基因啟動子(Kagaya et al.，Molecular and General GeneticsVol.248，No.6pp.668-674(1995))，或創傷誘導(wound inducible)啟動子例如馬鈴薯pin2啟動子(Xu et al.，Plant Molecular BiologyVol.22，No.4pp.573-588(1993))。
啟動子增強子元件可以用來實現酶在植物中的較高表達。例如，所述啟動子增強子元件可以是位于啟動子和編碼酶的核苷酸序列之間的內含子。例如，Xu et al.，op cit公開了用來促進表達的水稻actin1基因的第一個內含子。
選擇性標記基因和表達構建體的其它任何部分可以從本領域可得到那些中選取。
將DNA構建體用所述領域熟知的常規技術整合到植物基因組中，包括農桿菌屬介導的轉化，病毒介導的轉化，微注射，粒子轟擊，基因槍轉化(blolistic transformation)，電穿孔(Gasser et al.，Sciences，244，1293；Potrykus，Bio/Techn.8，535，1990；Shimamoto et al.，Nature，338，274，1989)。
目前，產生轉基因雙子葉植物的方法是選用根癌土壤桿菌介導的基因轉移(參看Hooykas & Schilperoort，1992.Plant Mol.Biol.1915-38)，雖然這個方法也可用來轉化單子葉植物，然而對于這些植物，通常其它轉化方法是優選的。目前，用來產生轉基因單子葉植物的方法選擇粒子轟擊(用要轉化的DNA包被微小的金或鎢顆粒)胚愈傷組織或發育的胚芽(Christou，1992.Plant J.2275-281；Shimamoto，1994.Curr.Opin.Biotechnol.5158-162；Vasil et al.，1992 Bio/Technology 10667-674)。另一種轉化單子葉植物的方法基于原生質轉化，例如OmirullehS，et al.，Plant Molecular Biology Vol.21，No.3pp.415-428(1993)中所述。
轉化以后，根據本領域所熟知的方法篩選整合了表達構建體的轉化體，并再生成整株植物。
材料與方法菌株和質粒大腸桿菌DH12S(來源于Gibco BRL)用與酵母質粒拯救(rescue)。
大腸桿菌JM11O(來源于Toyobo K.K.，Japan)用來制備重組質粒。
pJS0026是釀酒酵母的表達質粒，描述于WO97/07205和J.S.Okkels，(1996)中，pYES載體的A URA3啟動子的缺失增加真菌脂肪酶在啤酒糖酵母中的表達水平。重組DNA生物技術IIIThe Integration of Biological andEngineering Sciences，vol.782 of the Annals of the New York Academyof Sciences)。
pJC039是酵母和大腸桿菌的穿梭質粒，用于表達“參考(reference)”角質酶變體，在TPI啟動子控制的實施例中有所描述，其構建自pSJO026。
啤酒糖酵母YNG318MATa Dpep4[cir+]ura3-52，leu2-D2，his4-539用作構建酵母文庫和H.insolens的角質酶表達。其在J.Biol.Chem.272(15)，9720-9727，1997中描述。
培養基與底物SC-葡萄糖
10X基礎溶液
YPD
BETEB對苯二酸二(2-羥乙基) 酯二苯甲酰酯(Terephthdic acidbis(2-hydroxyethyl)ester dibenzoate)在這里簡寫為BETEB(苯甲酰基-乙烯-對苯二酸-ethelene-苯甲酰酯)。它是由對苯二酸二(2-羥乙基)酯與苯甲酸制成。
BETEB平板
PEG/LiAc溶液
Dop83-2的核苷酸混合物(SEQ ID NO5)1(核苷酸25)G91％，A9％2(核苷酸26)G96％，C4％3(核苷酸37)G92.5％，A7.5％4(核苷酸38)A96％，C4％5(核苷酸39)G0.5％，A3.5％，T96％6(核苷酸40)G96％，A2％，T2％7(核苷酸41)A4.5％，C95.5％8(核苷酸42)A2.5％，T97.5％9(核苷酸43)G92％，A2.5％，T3％，C2.5％10(核苷酸45)G71.5％，A1％，T27.5％11(核苷酸46)G3.5％，A2％，T43％，C51.5％12(核苷酸47)T93.5％，C6.5％13(核苷酸49)G92％，A2.5％，T3％，C2.5％
14(核苷酸51)G71.5％，T27.5％，A1％15(核苷酸52)A98％，C2％16(核苷酸53)G2.5％，T4.5％，C93％17(核苷酸54)G54.5％，A9.5％，T36％18(核苷酸58)G2％，A3.5％，T94.5％19(核苷酸59)A4％，T91％，C5％20(核苷酸61)G4.5％，T95.5％21(核苷酸62)T95.5％，C4.5％22(核苷酸63)G98％，A2％方法脂酶活性(LU)用阿拉伯樹膠作乳化劑乳化甘油三丁酸酯(甘油三丁酸酯)，來制備脂酶的底物。30℃，pH為7時水解甘油三丁酸酯，然后進行pH-stat滴定試驗。一單位的脂酶活性(11U)等于在標準條件下，能夠釋放1μml丁酸/min的酶的量。
初步篩選方法1.將酵母文庫涂布到SC-葡萄糖平板上，在30℃下溫育3天。
2.通過應用絨布(velvet cloth)把菌復制到有硝酸(nitrate)濾膜的新的SC-葡萄糖平板上，在30℃溫度下溫育1天(或20℃ O/W)。
3.將濾膜轉移到預熱的加/未加50ppm的Avolan的0.1％BETEB平板(pH8.5)上。
4.加入Avolan的BETEB平板70℃溫育，并且w/o Avolan的在73℃O/N。
5.除去濾膜，找到清晰區(zone)的酵母菌落。
6.從主平板上分離候選菌落，并接種到新的SC-葡萄糖平板和1mlYPD培養基的24孔板上。
次級篩選的方法1.在30℃下，180rpm，培養24孔板的YPD培養基2天。
2.離心平板/或靜置幾小時。
3.把5μl和10μl的上清液加到BETEB平板有Avolan的孔中，再加兩個沒有Avolan的。
4.在60℃培養一個BETEB平板和加過Avolan的BETEB平板，其它BETEB平板在68℃，過夜。
5.檢查清晰區的直徑。
6.測定68℃或60℃的加有Avolan的保留有活性的上清液之LU活性。
7.調LU活性至10LU/ml，并如4)應用到BETEB平板。
8.檢查清晰區的直徑。
酵母文庫的構建方法1.混合0.5μl載體(經Hind III-Xba I消化)和1μl的PCR片斷。
2.在冰上解凍YNG318感受態細胞。
3.混合100μl所述細胞，DNA混合物和10μl載體DNA(Clontech)在Falcon 1058中。
4.加入0.6mlPEG/LiAc溶液，溫和地混合。
5. 30℃，200rpm，溫育30分鐘。
6. 42℃，溫育15分鐘(熱激(heat shock))。
7.轉移到eppendorf管，離心5秒。
8.除去上清，用3mlYPD溶解。
9. 30℃，30rpm，溫育細胞懸浮液45分鐘。
10.將懸浮液倒到SC-葡萄糖平板上，以得到ca.300菌落/平板。
文庫構建通過SOE方法構建Dop文庫在酵母重組后。
其它方法■用來構建文庫和亞克隆的大腸桿菌轉化是用電穿孔(BIO-RAD GenePulser)。
■DNA質粒是用堿法制備(Molecular cloning，Cold Spring Harbor)或Qiagen質粒試劑盒制得。
■從瓊脂糖膠中回收DNA片斷是用Qiagen膠提取試劑盒回收。
■PCR是用PTC-200 DNA Engine完成。
■ABI PRISMTM310 Genetic analyzer用來測定所有的DNA序列。
■酵母的轉化是用醋酸鋰法完成。
■酵母總DNA是用Robzyk和Kassir’s方法提取的，在Nucleic acidsresearch vol.20，No14(1992)3790中描述。
■次級分析中的所有陽性菌落都是在1mlYPD中，30℃下溫育過夜，以用來提取酵母總DNA。所制備的DNA被導入大腸桿菌(E.coli)，分離大腸桿菌菌落并制備其質粒，以備序列測定和進一步評估。
實施例實施例1通過摻雜(doping)構建角質酶變體第一次PCR反應是用如下兩對引物，620AM34(SEQ ID NO3)和Dop2-R(SEQ ID NO4)，及Dop83-2(具有如上所述核酸序列混合物的SEQ IDNO5)和680AM35(SEQ ID NO6)，在如下條件下進行的
得到的片斷用膠純化(gel-purified)，用作第二次PCR反應的模板。第二次PCR反應用620(SEQ ID NO7)和680(SEQ ID NO8)作為引物，反應條件如下。
摻加寡改組文庫(spiked oligo shuffling library)摻入文庫按照如下構建制備后面實施例中描述的參考變體的基因片斷之PCR反應是用rTth聚合酶與引物AM34(SEQ ID NO9)和AM35(SEQ ID NO10)如上所述進行的，片斷用膠純化。
約10ug DNA/250μl與0.8μl DNasel(Gibco BRL 18068-015)和30μl 10X緩沖液在25℃溫育7-10分鐘。加入EDTA至終濃度為10mM，停止反應。
大小正確的DNA片斷(50-150bp)用Whatman玻璃濾器純化。
然后在如下條件重裝DNase處理過的片斷。

用上面的PCR混合物為模板，在如下條件進行第二次PCR
實施例2變體的熱穩定性制備許多樣品，每個樣品包含10LU/ml H.insolens角質酶變體。將各樣品20μl應用到BETEB平板的孔，平板在68℃下溫育過夜(14小時)。在孔周圍出現清晰區域，將其作為陽性結果。
將下面本發明的變體進行測試，用于對比的包括參考變體(不是基于所述發明)。
如上所示，每一種變體都包含與參考變體有相同的取代(E6Q+A14P+E47K+R51P+E179Q)，以及額外的一個或多個基于本發明的取代。如上面所示，有4個變體被認為擁有N末端延伸，自前導序列中的取代A(-7)V開始，其導致了切割位點的改變。
結果顯示本發明所有的變體都顯示了明顯的清晰區，而參考變體卻沒有出現。參考變體在60℃的相似試驗中出現了清晰區。所以，根據本發明的每組取代明顯的改善了變體的熱穩定性。
一些變體還在更高的溫度下進行了檢測，上面的一些變體在76℃的高溫下顯示陽性結果。
實施例3在去污劑存在下變體的穩定性角質酶變體和陰離子表面活性劑(10或40ppm的Avolan，Bayer產品)在60℃下溫育，14小時后測定殘余活性。在前面實施例中描述過的變體中8個被發現在與10ppm去污劑溫育后還有明顯的殘余活性，與40ppm去污劑溫育后還有一些活性。參考變體沒有顯示殘余活性。
實施例4通過DSC的熱穩定性角質酶變體的熱穩定性在pH10(50mM甘氨酸緩沖液)的條件下通過DSC進行了研究。以恒定程序的加熱速率加熱酶溶液后所得到的溫譜圖(Cp vs.T)中熱變性曲線的峰值(主熱吸收峰)作為熱變性溫度，Td。
發現上述參考變體其Td為68℃。在實施例2中描述的本發明的變體被發現其Td為71-72℃，即這是一個很明顯的改進。
實施例5變體的清洗性能在下面條件下，參考變體和實施例2中描述的本發明變體在清洗試驗中用兩種不同去污劑進行檢測去污劑商用日本去污劑，含大量陰離子表面活性劑去污劑濃度0.50g/L或0.67g/L每杯測試布樣(swatch)3個棉布樣(8×8cm)，被豬油/棕脂肪(fat brown)污染3個棉/聚酯布樣(4.5×4.5cm)被口紅污染2個商用皮脂(sebum)布樣(5×5cm)1個白色聚酯布樣(5×5cm)清洗機器Terg-O-Tometer，100 r.p.m.
角質酶變體劑量0，2000，5000，10000LU/L水硬度3°dH(Ca)清洗溫度25℃清洗液1升/杯清洗時間10min漂洗10min流動自來水干燥line dry，過夜去垢力是通過比較口紅樣品與沒加角質酶變體洗滌的樣品的緩解增加值(remission increase)(ΔR)來測定的。結果顯示在各種去污劑的劑量為2000-10000LU/L時，加入本發明角質酶變體所提供的ΔR為10-16，而參考變體提供的ΔR為3-7。
來自豬油樣品的棕脂肪的再沉積，是通過比較白色聚酯樣品與未加角質酶變體的樣品緩解增加值(ΔR)來測定的。結果顯示，在在各種去污劑的劑量為5000-10000LU/L時，本發明角質酶變體提供的ΔR是參考變體的兩倍多。
此外，所述兩種變體的穩定性也在兩種去污劑溶液中進行了測定。在25℃，10分鐘后，本發明角質酶變體在兩種去污劑中的殘余活性為92-95％，而參考變體的殘余活性為71-72％。結果顯示本發明變體在洗滌性能，抗再沉積效果和在去污劑溶液中的穩定性方面有很明顯改善。
實施例6聚酯織品處理聚酯織品用本發明角質酶變體與參考變體(都在實施例2中作了描述)進行了如下的處理1.測試條件溫度75℃清洗時間3hrspH9.0(50mM甘氨酰甘氨酸緩沖液)織品聚酯(Teijin)，14cmX14cm浴比(bath ratio)5片(pieces)/1000ml(＝約13g/L)酶的劑量0，10，50，100mg/L(基于酶蛋白)T-O-M100rpm漂洗時間用自來水(tap water)處理10min2.程序1.在105℃，干燥一組5片的聚酯2小時2.在干燥器中冷卻至少30分鐘3.稱量該組重量4.在75℃，100rpm，用變體洗滌該組聚酯3小時5.用自來水漂洗該組10分鐘6.將其line dry過夜7.105℃干燥2小時8.在干燥器中冷卻至少30分鐘9.稱量該組重量10.計算重量損失下面結果顯示了重量損失
結果顯示本發明變體在75℃時的熱穩定性足以使其發揮效用，而參考變體沒有什么效果。
實施例7對變性(denatured)廚用油(cooking oil)的清潔效果本發明的角質酶變體(實施例2中描述)被用來測試其對廚房中真實的氧化油污的清潔效果。
在中性pH條件的商用液體洗餐具(dish-washing)去污劑中加入1000LU/ml的角質酶變體。將有角質酶變體的去污劑直接用于粘在廚房通風設備filter上的變性廚用油油漬上，放置15，30，或60分鐘，最后用自來水沖洗1分鐘。
目視可見氧化的油漬被有效的清除。而對照試驗中使用沒有加入角質酶的去污劑顯示去污效果很小。
實施例8角質酶變體的抗-起球(anti-pilling)與去起球(depilling)效果用實施例2中的參考變體作為對照，用本發明角質酶變體(在實施例2中描述)處理聚酯織品。條件是75℃，3小時洗滌，pH9.0(甘氨酰甘氨酸緩沖液)，14×14cm桃色外表聚酯織品(peach skin polyester)(Toray生產，日本)，浴比為5片(約16克)每1000ml，Tergotometer(滌垢儀)為100rpm，然后用自來水漂洗10分鐘。
用10，50和100mg/L角質酶變體處理的織品與對照試驗相比顯示改善的去-起球和抗-起球效果。觀察到紗的網格在處理后變得更加清晰，顯然是因為細毛(fuzz)被去除并且細毛(微纖維)變短。
實施例9角質酶變體在吸水(water absorption)方面的效果用與前述實施例相同的角質酶變體100mg/l和相同條件處理熱帶平織聚酯(Teijin，日本)，然后用蛋白酶(Alcalase)處理以除去殘留在織品表面的任何角質酶蛋白，皂洗，漂洗，干燥。對照試驗除了不用角質酶處理以外同樣進行。
通過切成條，將條的末端浸入色料溶液中，去除條上多余的色料，并測量被染色部分的高度，來檢測處理過的織品。被角質酶變體處理過的增加的染色部分高度從16到77mm，顯示出改善了吸水性。
序列表<110>諾維信公司(NOVOZYMES A/S)<120>角質酶變體<130>10038-WO<160>10<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>194<212>PRT<213>Humicola insolens<400>1Gln Leu Gly Ala Ile Glu Asn Gly Leu Glu Ser Gly Ser Ala Asn Ala1 5 10 15Cys Pro Asp Ala Ile Leu Ile Phe Ala Arg Gly Ser Thr Glu Pro Gly20 25 30Asn Met Gly Ile Thr Val Gly Pro Ala Leu Ala Asn Gly Leu Glu Ser35 40 45His Ile Arg Asn Ile Trp Ile Gln Gly Val Gly Gly Pro Tyr Asp Ala50 55 60Ala Leu Ala Thr Asn Phe Leu Pro Arg Gly Thr Ser Gln Ala Asn Ile65 70 75 80Asp Glu Gly Lys Arg Leu Phe Ala Leu Ala Asn Gln Lys Cys Pro Asn85 90 95Thr Pro Val Val Ala Gly Gly Tyr Ser Gln Gly Ala Ala Leu Ile Ala100 105 110Ala Ala Val Ser Glu Leu Ser Gly Ala Val Lys Glu Gln Val Lys Gly115 120 125Val Ala Leu Phe Gly Tyr Thr Gln Asn Leu Gln Asn Arg Gly Gly Ile130 135 140Pro Asn Tyr Pro Arg Glu Arg Thr Lys Val Phe Cys Asn Val Gly Asp145 150 155 160Ala Val Cys Thr Gly Thr Leu Ile Ile Thr Pro Ala His Leu Ser Tyr165 170 175Thr Ile Glu Ala Arg Gly Glu Ala Ala Arg Phe Leu Arg Asp Arg Ile180 185 190Arg Ala<210>2<211>17<212>PRT<213>人工的/未知的<220><221>misc_feature<222>()..()<223>N-末端延伸<400>2Ala Ala Val Asp Ser Asn His Thr Pro Ala Val Pro Glu Leu Val Ala1 5 10 15Arg<210>3<211>42<212>DNA<213>人工的/未知的<220><221>misc_feature<222>()..()<223>620AM34<400>3gagtactatc ttgcatttgt actaggagtt tagtgaactt gc 42<210>4<211>16<212>DNA<213>人工的/未知的<220><221>misc_feature<222>()..()<223>Dop2-R<400>4gacgccctgg atccag 16<210>5<211>87<212>DNA<213>人工的/未知的<220><221>misc_feature<222>()..()<223>Dop83-2<220><221>modified_base<222>(25)..(63)<223>See text<400>5cggaacatct ggatccaggg cgtcnntggc ccttacnnnn nnncnnngnc nnnnaacnnt60nnnccgcggg gcacctcgca ggccaac87<210>6<211>41<212>DNA<213>人工的/未知的<220><221>misc_feature<222>()..()<223>680AM35<400>6atggttatgg atttcgggga ttcttcgagc gtcccaaaac c41<210>7<211>22<212>DNA<213>人工的/未知的<220><221>misc_feature<222>()..()<223>620<400>7gagtactatc ttgcatttgt ac 22<210>8<211>23<212>DNA<213>人工的/未知的<220><221>misc_feature<222>()..()<223>680<400>8atggttatgg atttcgggga ttc23<210>9<211>20<212>DNA<213>人工的/未知的<220><221>misc_feature<222>()..()<223>AM34<400>9taggagttta gtgaacttgc20<210>10<211>18<212>DNA<213>人工的/未知的<220><221>misc_feature<222>()..()<223>AM35<400>10ttcgagcgtc ccaaaacc 18
權利要求
1.一種親代真菌角質酶的變體，該變體a)包括至少一個相應于Humicola insolens菌株DSM 1800的角質酶中的位點A4，T29，A88，N91，A130，Q139，I169，I178或R189(H.insolens角質酶的編號)的氨基酸殘基的取代，和b)比親代角質酶的熱穩定性更強。
2.前述權利要求的變體，其中包括取代A4V，T29M/I/C，A88H/L/V，N91H，A130V，Q139R，I169A/G/T/V，I178V或R189A/H/V。
3.一種親代真菌角質酶的變體，該變體a)包括至少一個相應于Humicola insolens菌株DSM 1800的角質酶中的位點Q1C/L，L2K/Q/V，68D，S11T，N15D，A16T，V38H，S48E/K，H49Y，L66I，S116K，S119P，G120D，T164S，T166M/I或L167P(Humicola insolens角質酶編號)的氨基酸殘基的取代，和b)比親代角質酶熱穩定性更強。
4.前述任一項權利要求的變體，其中親代角質酶a)原產于絲狀真菌，具體為腐質霉屬或鐮孢屬的菌株，具體為Humicolainsolens或Fusarium solani pisi，更具體為Humicola insolens菌株DSM1800，b)具有可以與Humicola insolens菌株DSM1800角質酶的序列對比的氨基酸序列，或c)具有與Humicola insolens菌株DSM1800角質酶至少有50％的同源性，特別是至少70％同源性，更特別是至少80％同源性的氨基酸序列。
5.一種Humicola insolens菌株DSM1800的角質酶變體，該變體a)包括對氨基酸殘基N44，I168，或L174的取代，和b)比親代角質酶熱穩定性更強。
6.前述權利要求的變體，其中包括取代N44D，I168F，或L174F。
7.前述任一項權利要求的變體，其具有1-20種所述取代，特別是2-15種。
8.前述任一項權利要求的變體，包括相應如下的取代a)S48E+A88H+N91H+R189Vb)Q1L+L2K+G8D+N15Dc)N44D+A130Vd)Q1C+L2V+G120De)A88L+R189Af)S48E+L66I+A88L+I169A+R189Hg)A88V+S116K+S119P+Q139R+I169V+R189Vh)A88V+R189Ai)S48K+A88H+I169G+R189Hj)Q1L+L2Q+A4V+S11Tk)T164SI)L174Fm)H49Yn)Q1L+L2K+G8D+N15D+S48E+A88H+N91H+R189Vo)Q1L+L2K+G8D+N15D+N44D+A130Vp)Q1L+L2K+G8D+N15D+S48E+A88H+N91H+A130V+R189Vq)G8D+N15D+A16Tr)A130Vs)Q1C+L2Vt)G8D+N15D+A16Tu)G8D+N15D+S48E+A88H+N91H+A130V+R189Vv)G8D+N15D+T29M+S48E+A88H+N91H+A130V+R189Vw)G8D+N15D+T291+S48E+A88H+N91H+A130V+R189V and/orx)G8D+N15D+T29C+S48E+A88H+N91H+A130V+R189Vy)G8D+N15D+S48E+A88H+N91H+A130V+L174F+I178V+R189Vz)G8D+N15D+S48E+A88H+N91H+A130V+T166M+I168F+R189Vaa)G8D+N15D+S48E+A88H+N91H+A130V+T1661+L167P+R189Vbb)G8D+N15D+V38H+S48E+A88H+N91H+A130V+1169T+R189Vcc)G8D+N15D+V38H+S48E+A88H+N91H+A130V+R189Vdd)G8D+N15D+T29M+S48E+A88H+N91H+A130V+T1661+L167P+R189V
9.前述任一項權利要求的變體，其還包括至少一個相應于位點Q1，L2，E6，E10，S11，A14，N15，F24，L46，E47，R51，D63，L138和/或E179(H.insolens的角質酶編號)的氨基酸的取代。
10.前述權利要求的變體，其包括至少一個相應于位點Q1P，L2V，E6Q，E10Q，S11C，A14P，N15T，F24Y，L46I，E47K，R51P，D63N，L138I和/或E179Q(H.insolens的角質酶編號)的取代。
11.前述權利要求的變體，其中包括相應E6Q+A14P+E47K+R51P+E179Q的取代。
12.前述任一項權利要求的變體，其具有針對對苯二酸酯，尤其是環三(對苯二甲酸亞乙酯)和/或對苯二酸二(2-羥乙基)二苯甲酸酯(BETEB)的水解活性。
13.前述任一項權利要求的變體，其中具有的變性溫度比其親代角質酶至少高出5℃，尤其是在pH8.5的條件下測量。
14.編碼前述任一項權利要求的變體的DNA序列。
15.包括前述權利要求的DNA序列的載體。
16.一種攜帶有權利要求14的DNA序列或權利要求15的載體轉化的宿主細胞。
17.一種制備權利要求1-13中任一項的變體的方法，包括a)培養權利要求16的細胞，以表達并可選擇地分泌變體，和b)回收該變體。
18.一種制備角質酶變體的方法，其中包括a)選擇親代真菌角質酶，b)在H.Insolens角質酶的位點A4，G8，A16，T29，V38，N44，S48，H49，L66，A88，N91，S116，S119，G120，A130，Q139，T164，T166，L167，I168，I169，L174，I178或R189或包括所述位點的區域(H.insolens的角質酶編號)的親代角質酶取代，缺失，或插入中改變至少一個氨基酸殘基，并且也可任選在其它位點進行以得到角質酶變體，c)測試角質酶變體的熱穩定性，d)任選重復步驟b-c，e)選擇熱穩定性比其親代角質酶更高的角質酶變體，和f)制備所選出的角質酶變體。
19.權利要求18的方法，其中的氨基酸的改變是在包括至少一個所示位點的區內進行定位隨機突變而完成的。
20.權利要求18的方法，其中的氨基酸的改變是通過在至少一個所示位點進行點特異性突變而完成的，具體是通過在一個，兩個，三個，四個，五個或六個所述位點進行取代。
21.前述任一項權利要求的方法，其中所選出的變體角質酶的變性溫度至少比其親代角質酶高5℃，特別是在pH為8.5時測量。
22.前述任一項權利要求的方法，其中親代角質酶a)原產于絲狀真菌，具體為腐質霉屬或鐮孢屬，具體為Humicolainsolens或Fusarium solani pisi，更具體為Humicola insolens菌株DSM1800，b)具有可以與Humicola insolens菌株DSM1800角質酶序列對比的氨基酸序列，或c)具有與Humicola insolens菌株DSM 1800角質酶至少有50％的同源性，具體為至少70％同源性，更具體為至少80％同源性的氨基酸序列。
23.一種酶水解對苯二甲酸亞乙酯的環狀寡聚物的方法，其包括用親代真菌角質酶的變體處理環狀寡聚物，其中所述變體包括一個或多個相應如下位點的氨基酸殘基的取代Humicola insolens角質酶的A4，G8，A16，T29，V38，N44，S48，H49，L66，A88，N91，S116，S119，G120，A130，Q139，T164，T166，L167，I168，I169，L174，I178或R189(H.insolens角質酶編號)。
24.前述權利要求的方法，其中的環狀寡聚物為環三(對苯二甲酸亞乙酯)。
25.權利要求23或24的方法，其中的處理在55℃以上進行。
26.權利要求23-25的任一項所述方法，其中的環狀寡聚物出現在含聚酯的織品或紗的纖維中。
27.權利要求23-26的任一項所述方法，其進一步包括隨后的漂洗織品或紗，特別是用pH值范圍在約7-約11的水溶液漂洗。
28.一種改善含PET紗或織品的功能性整理劑的方法，包括a)用親代真菌角質酶變體處理紗或織品，其變體包括相應如下位點的一個或多個氨基酸殘基的取代Humicola insolens角質酶的A4，G8，A16，T29，V38，N44，S48，H49，L66，A88，N91，S116，S119，G120，A130，Q139，T164，T166，L167，I168，I169，L174，I178或R179(H.insolens的角質酶編號)，和b)用選自軟化劑，防皺樹脂，抗靜電劑，抗污染劑的整理劑處理紗或織品。
29.一種聚酯織品或紗染色的方法，包括a)使用在pH8.5的條件下，熱變性溫度為65℃或高于65℃的角質酶處理織物或紗；和b)用活性染料或分散染料對處理過的織品進行染色。
30.前述權利要求的方法，其中角質酶是親代真菌角質酶的變體，所述變體包括相應如下位點的一個或多個氨基酸殘基的取代Humicolainsolens角質酶的A4，G8，A16，T29，V38，N44，S48，H49，L66，A88，N91，S116，S119，G120，A130，Q139，T164，T166，L167，I168，I169，L174，I178或R179(H.insolens角質酶編號)。
31.一種去污劑組合物，包括表面活性劑和權利要求1-13任一項所述的變體。
32.一種真菌角質酶，其在N末端有一肽段延伸AAVDSNHTPAVPELVAR(SEQ ID NO2)。
全文摘要
具有改善熱穩定性的真菌角質酶變體包括一個或多個特定氨基酸殘基的取代和/或特定的N末端延伸。變體還可選擇地包括在其它位點的額外改變。
文檔編號C12N15/09GK1426463SQ01808568
公開日2003年6月25日 申請日期2001年5月22日 優先權日2000年6月2日
發明者阿倫·斯文德森, 桑尼·O·S·格拉德, 福山志朗, 松井知子 申請人:諾維信公司