一種大曲細菌dgge標準條帶制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種大曲細菌DGGE標準條帶的制備及應用，通過在大曲發酵過程中對優勢細菌的檢測，獲得細菌DGGE指紋圖譜，選取發酵過程中常見的優勢細菌DGGE條帶，制備細菌DGGE標準條帶，并將其應用于發酵階段微生物種群的定性檢測。
【專利說明】一種大曲細菌DGGE標準條帶制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明具體涉及一種大曲細菌DGGE標準條帶的制備及其在發酵過程中優勢菌群檢測中的應用。
【背景技術】
[0002]我國傳統白酒釀造是以酒曲為糖化發酵劑，醬香型白酒則是以高溫大曲為糖化發酵劑。其大曲是以小麥等谷物為原料，網羅自然界微生物，潤水、加入母曲之后入倉發酵，發酵7天左右待堆心溫度升到60°C時進行第一次翻倉，再隔7天左右待堆心溫度升到55°C時進行第二次翻倉，直到40-45天發酵時間結束即可出倉，在適宜的環境放置3-6個月之后方可投入生產。大曲作為白酒釀造中的糖化、發酵和增香劑，其微生物種類繁多，偌大的微生物群棲息在一起，既互相促進又互相抑制，并不斷地進行著盛衰交替。大曲中的微生物組成與大曲酒的香型及酒的質量有密切關系。從根本上說，白酒的獨特風味來源于參與白酒發酵的微生物種類和數量的多寡，白酒整個釀造發酵過程也是依賴微生物及其酶類的繁殖代謝而得以進行，由此大曲成為釀酒品控的核心指標之一，對大曲微生物的研究也成為釀酒行業的關注的熱點。
[0003]在研究傳統發酵食品的微生物菌群變化的研究中，快速而準確的微生物定性鑒別方法是目前許多研究的焦點。以PCR-DGGE為基礎的分子生物學技術，有力地推動了微生態學研究的發展。由于DGGE技術避免了分離培養的缺陷，直觀地顯現了微生物區系菌群的多樣性，目前已成為微生物菌群多樣性和動態變化分析的常用工具。DGGE技術主要根據DNA序列因GC含量的不同，而在變性梯度凝膠中形成不同程度的解鏈，停滯在相應的變性梯度位置，經染色后可以在凝膠上呈現為分散的條帶。理論上DGGE技術可以分辨只有一個堿基差異的基因序列。因此在一塊DGGE膠板上，與DGGE標準條帶中某一個條帶具有相同遷移距離的條帶即可大致認為屬于同一序列。在DGGE指紋圖譜的基礎上，制備大曲發酵過程中常見細菌的DGGE標準條帶，并將其應用于發酵過程中微生物種群的定性檢測，可直觀地看出優勢菌群動態變化，使用方便快捷，并且可以避免重復測序帶來的時間和經費的浪費，具有一定的市場價值。
[0004]本發明利用PCR-DGGE技術監測大曲發酵過程中優勢微生物菌群的變化，其方法是，先制作一種優勢細菌標準條帶(即DGGE標準條帶)，然后從生產過程中的大曲提取優勢細菌DGGE條帶，和上述標準條帶進行比較，如果吻合說明可以保證質量，如果不吻合，通過調整微生物的量或調整工藝方法，使達到吻合，從而保證生產出的白酒質量均一，有利于白酒質量的穩定。此方法克服了傳統的開放式發酵中完全依靠經驗，無法嚴格保證微生物的重復性，也無法抑制有害微生物的弊端。

【發明內容】

[0005]本發明提供一種大曲DGGE優勢細菌標準條帶的制備方法。本發明還提供一種該大曲DGGE優勢細菌標準條帶在發酵過程中優勢菌群檢測中的應用。該方法通過對大曲發酵過程中的細菌16S rDNA V3可變區DGGE指紋圖譜進行分析，制備出優勢細菌DGGE標準條帶，從而使DGGE圖譜分析方便快捷，避免重復測序帶來的時間和經費的浪費。
[0006]具體的，本發明提供一種大曲細菌DGGE標準條帶的制備方法，所述方法包括以下步驟:
[0007]步驟I，獲得大曲發酵過程中的細菌DGGE圖譜，確定大曲發酵過程中優勢細菌；
[0008]步驟2，根據大曲中優勢細菌，制備大曲細菌DGGE標準條帶。
[0009]其中步驟I的方法如下:
[0010]I)選取大曲不同發酵階段的合格樣品；
[0011]2)提取微生物總DNA ；
[0012]3)以微生物總DNA為模板，在專用引物的引導下進行細菌16S rDNA V3可變區的PCR擴增；
[0013]4)對擴增后的產物進行變性梯度凝膠電泳，經SYBR Green I染色后得到DGGE圖譜；
[0014]5)將圖譜中的優勢條帶進行切膠回收，在專用引物的引導下進行PCR擴增，產物測序供微生物種群分析，確定優勢細菌。
[0015]其中步驟2的方法如下:
[0016]I)取優勢細菌所對應的DGGE條帶，在專用引物的引導下進行PCR擴增；
[0017]2)將擴增產物等量混合，對其進行變性梯度凝膠電泳，經SYBR Green I染色，確定每種菌所代表的條帶的相對位置，即得DGGE優勢細菌標準條帶。
[0018]步驟I中，
[0019]其中I)所述不同發酵階段的合格樣品，是指選取母曲、生曲、第一次翻倉大曲、第二次翻倉大曲、出倉曲共5種合格樣品。
[0020]其中2)所述提取的微生物總DNA，是指分別提取母曲、生曲、第一次翻倉大曲、第二次翻倉大曲、出倉曲5種樣品的微生物總DNA。
[0021]其中3)所述細菌16S rDNA V3可變區的PCR擴增使用巢式PCR擴增，以待測樣品的微生物總DNA為模板，先加入第一步擴增引物和反應體系進行擴增，第一步擴增采用的引物為 16S1: 5，- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’ 和 16S2:5，- TACGGYTACCTTGTTACG ACTT-3’ ；取其產物作為模板，加入第二步擴增引物進行擴增，第二步擴增采用的引物為:R518:5，-ATTACCGCGGCTGCTGG-3，和 338F-GC:5，-CGCCCGCCG CGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，。
[0022]其中4)所述得到的DGGE圖譜，是指一次發酵生產過程，共得到5種樣品的DGGE圖譜。所述變性梯度凝膠電泳，方法是:采用10%變性聚丙烯酞胺凝膠電泳進行分離，變性劑濃度30-60%，電泳緩沖液采用1XTAE，電壓100V，時間10h。
[0023]其中5 )所述的專用引物如下:338F: 5 ’ -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3 ’ 和 R518:5’ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3’，擴增產物進行測序，所得序列在NCBI上與已登陸序列進行比對，從而確定微生物種群。
[0024]步驟2中，
[0025]其中I)所述優勢細菌所對應的DGGE條帶，是指母曲、生曲、第一次翻倉大曲、第二次翻倉大曲、出倉曲5種樣品DGGE圖譜中的優勢細菌所對應的條帶，所述專用引物如下:R518:5，-ATT ACCGCGGCTGCTGG-3’ 和 338F-GC:5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTA CGGGAGGCAGCAG-3，。
[0026]其中2)所得DGGE優勢細菌標準條帶包含16個條帶，指示13種細菌。見圖1。
[0027]本發明還提供一種按照上述方法制備的大曲細菌DGGE標準條帶，及其在發酵過程中優勢菌群檢測中的應用。
[0028]該應用步驟如下:
[0029]I)取發酵階段合格待測樣品，按照上述步驟I的方法制備待測樣品16S rDNA V3可變區PCR產物，并與大曲細菌DGGE標準條帶點樣于同一塊DGGE膠上；
[0030]2)根據DGGE圖譜樣品條帶與DGGE標準條帶的對比，進行細菌種群鑒定；
[0031]3)切膠回收與DGGE標準條帶中條帶具有相同遷移距離的條帶，通過測序，驗證其適用性。
[0032]測序結果表明，具有相同遷移距離的條帶間序列相似度達100%，表明該DGGE標準條帶具有重復性和實用性。
[0033]經過數批實驗證明，該DGGE標準條帶的應用方便快捷，并且具有相當好的重復性。DGGE標準條帶的使用不僅可以快速方便地指示出常見菌群的存在與否，直觀地看出菌群動態變化，而且也可避免重復測序帶來的時間和經費的浪費。
[0034]本發明的優點在于:
[0035]1、細菌DGGE標準條帶的應用可直觀地指示所測大曲樣品中優勢細菌的存在與否及其動態變化。
[0036]2、將細菌DGGE標準條帶應用于發酵過程中細菌種群的鑒定，可以避免重復測序帶來的時間和經費的浪費。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1 DGGE標準條帶中包含的16個條帶圖及其分別代表的菌種
[0038]圖2 DGGE標準條帶的應用圖(泳道1、2:母曲；泳道3、4:生曲；泳道5、6:第一次翻倉大曲；泳道M=DGGE標準條帶；泳道7、8、9:第二次翻倉大曲；泳道10、11:出倉曲)
【具體實施方式】
[0039] 通過以下具體實施例對本發明做進一步說明，但不作為對本發明的限制。
[0040]實施例1大曲DGGE標準條帶的制備
[0041]一、獲得大曲發酵過程中的細菌DGGE圖譜，確定大曲發酵過程中優勢細菌。
[0042]1)選取大曲不同發酵階段的合格樣品。
[0043]在大曲發酵過程中分別選取母曲、生曲、第一次翻倉大曲、第二次翻倉大曲及出倉曲作為研究樣品。
[0044]2)提取微生物總DNA。
[0045]提取方法是:分別稱取0.4g母曲、生曲、第一次翻倉大曲、第二次翻倉大曲及出倉曲樣品，分別加入200mg左右的玻璃珠，使用OMEGA soil DNA提取試劑盒對5種樣品進行總DNA的提取。加入1000ul SLX溶液，高速蝸旋5min混合均勻，加入100ul DS溶液，蝸旋混合。70°C水浴IOmin,期間快速混合樣品一次,5000rpm室溫離心3min,上清移至新的離心管，加入270ul SP2溶液，混合均勻，冰浴5min，13000g 4°C離心5min。上清轉移至新的離心管中，加入0.7倍異丙醇，顛倒混勻，-20°C靜止一個小時。13000g離心10min，棄去上清，倒置于吸水紙上干燥，加入200ul Elution Buffer到離心管中，混勻，65°C水浴20min溶解DNA。加入80ul HTR溶液，混合均勻，室溫放置2min，13000g離心2min，將上清轉移至新的離心管中。如果上清依舊帶有深色物質，則重復加入HTR溶液處理。加入等體積的XP2溶液，充分混合均勻之后將所有溶液轉移到HiBind DNA柱子中，1000Og離心lmin，棄去流出液重新使用收集管。加入300ul XP2溶液，1000Og離心lmin，棄去流出液和收集管，把柱子放入一個新的收集管中，加入700ul經無水乙醇稀釋過的SPW wash溶液，1000Og離心lmin,棄去流出液重新使用收集管，再用700ul SPff wash溶液洗一次，棄去液體，把柱子插入空的收集管中，13000g離心2min，將柱子取出敞開蓋放置，使乙醇揮發，避免其影響下一步操作。將柱子放到新的離心管中，在柱子中心加入50ul Elution Buffer, 65°C水浴lOmin, 13000g離心lmin。將離心洗脫液重新加入柱子中心，65°C水浴lOmin, 13000g離心lmin,所得洗脫液即為提取好的微生物總DNA。
[0046]3)以微生物總DNA為模板，在專用引物的引導下進行PCR擴增。
[0047]在得到待測樣品的總DNA后，根據現有技術進行PCR擴增。細菌16S rDNAV3可變區的PCR擴增使用巢式PCR擴增方法，先加入第一步擴增引物和反應體系進行擴增，第一步擴增采用的引物為16S1:5’ - AGAGTTTGATCCTGGCTC AG -3’和16S2:5’- TACGGYTACCTTGTTACGACTT -3’ ；PCR 反應條件為:94 °C 預變性 4 min，然后 94°C 變性45s，50~55°C引物復性45s，72°C引物延伸lmin30s，循環30次，72 °C終延伸10 min。取其產物作為模板，加入第二步擴增引物進行擴增，第二步擴增采用的引物為:R518:5，-ATTACCGCGGCTGCTGG-3，和 338F-GC:5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGA CTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’ ;PCR 反應條件為:94°C 預變性 4min，然后 94°C 變性 45s，50^55 °C引物復性45s，72°C引物延伸lmin30s，循環30次，72°C終延伸10 min。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為IXTAE緩沖液。
[0048]4)對PCR產物進行變性梯度凝膠電泳，SYBR Green I染色得到DGGE圖譜。
[0049]采用DC0DE?系統(BIO-RAD)構建DGGE指紋圖譜，具體方法為:獲得的5種樣品16S rDNA V3可變區擴增產物(約200bp)，分別取適量(200ng)用10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離(變性劑濃度30~60%，電泳緩沖液I X TAE, 100V, IOh),然后用SYBR Green I對變性聚丙烯酰胺凝膠染色，用Quantity One凝膠成像掃描系統對DGGE膠進行照像，得到5種樣品的細菌DGGE圖譜。
[0050]5) DGGE切膠回收優勢條帶，在專用引物的引導下進行PCR擴增，產物測序供微生物種群分析。
[0051]切下的DGGE條帶放入無菌的離心管中搗碎，加入4(T50ul IXTE緩沖液，貯存于-20°C，作為接下來的PCR反應的模板。在專用引物的引導下進行PCR擴增，產物測序供微生物種群分析。專 用引物如下:R518:5’ -ATTACCGCGGCTG CTGG-3，和338F:5’ -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’。PCR 反應條件為:94°C預變性 4 min，然后 94°C變性 45s，50~55°C引物復性45s，72°C引物延伸lmin30s，循環30次，72°C終延伸IOmin ;PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為IXTAE緩沖液。其中所述的將獲得的PCR產物送測序，序列在NCBI (www.ncb1.nlm.nih.gov)上與已登陸序列進行比對,從而確定微生物種群。[0052]二、根據大曲中優勢細菌，制備大曲細菌DGGE標準條帶。
[0053]I)選取常見的優勢細菌所對應的DGGE條帶，在專用引物的引導下進行PCR擴+?
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[0054]專用引物如下:R518:5’ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3’ 和 338F-GC:5’ -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’。PCR 反應條件為:94°C 預變性 4min，然后94°C變性45s，50~55°C引物復性45s，72°C引物延伸lmin30s，循環30次，72°C終延伸10 min ;PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為IXTAE緩沖液。
[0055]2)將擴增出的PCR產物等量混合，制備DGGE標準條帶，通過再次變性梯度凝膠電泳確定每個條帶在標準條帶中的相對位置。
[0056]該DGGE標準條帶中包含的16個條帶，指示13種細菌。見圖1。
[0057]實施例2大曲DGGE標準條帶在大曲發酵過程中微生物種群的鑒定
[0058]I)在發酵階段微生物種群的定性檢測中，分別取母曲、生曲、第一次翻倉大曲、第二次翻倉大曲及出倉曲5種樣品作為待測樣品，待測樣品16S rDNA V3可變區的PCR擴增使用巢式PCR擴增，具體方法同前。DGGE標準條帶的擴增PCR反應條件為:以挑選的常見優勢細菌所對應的DGGE條帶為模板，94°C預變性4 min，然后94°C變性45s，5(T55°C引物復性45s，72°C引物延伸lmin30s，循環30次，72°C終延伸IOmin ;PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為IXTAE緩沖液。專用引物如下:R518:5’ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3， 和 338 F- GC:5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’。將制備好的樣品16S rDNA V3可變區PCR產物與大曲細菌DGGE標準條帶點樣于同一塊DGGE膠上。電泳結果見圖2。
[0059]2)根據DGGE圖譜樣品條帶與DGGE標準條帶的對比，進行細菌種群鑒定。
[0060]根據DGGE膠上條帶的電泳終點位置進行細菌種群鑒定。由于DGGE技術主要根據DNA序列因GC含量的不同，而在變性梯度凝膠中形成不同程度的解鏈，停滯在相應的變性梯度位置，經染色后可以在凝膠上呈現為分散的條帶。理論上DGGE技術可以分辨只有一個堿基差異的基因序列。因此在一塊DGGE膠板上，與DGGE標準條帶中某一個條帶具有相同遷移距離的條帶即可大致認為屬于同一序列。經過數批實驗，證實該DGGE標準條帶的應用方便快捷，并且具有相當好的重復性。DGGE標準條帶的使用不僅可以快速方便地指示出常見菌群的存在與否，直觀地看出菌群動態變化，而且也可避免重復測序帶來的時間和經費的浪費。
[0061 ] 3 )驗證DGGE標準條帶。
[0062] 切下與DGGE標準條帶中條帶具有相同遷移距離的條帶，通過測序，驗證其適用性。測序結果表明，具有相同遷移距離的條帶間序列相似度達100%，表明該DGGE標準條帶具有重復性和實用性。
【權利要求】
1.一種大曲細菌DGGE標準條帶制作方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 步驟I，獲得大曲發酵過程中的細菌DGGE圖譜，確定大曲發酵過程中優勢細菌； 步驟2，根據大曲中優勢細菌，制備大曲細菌DGGE標準條帶。
2.根據權利要求1的制作方法，其特征在于，其中步驟I的方法如下: 1)選取大曲不同發酵階段的合格樣品； 2)提取微生物總DNA； 3)以微生物總DNA為模板，在專用引物的引導下進行細菌16SrDNA V3可變區的PCR擴增； 4)對擴增后的產物進行變性梯度凝膠電泳，經SYBRGreen I染色后得到DGGE圖譜； 5)將圖譜中的優勢條帶進行切膠回收，在專用引物的引導下進行PCR擴增，產物測序供微生物種群分析，確定優勢細菌。
3.根據權利要求1的制作方法，其特征在于，其中步驟2的方法如下: 1)取優勢細菌所對應的DGGE條帶，在專用引物的引導下進行PCR擴增； 2)將擴增產物等量混合，對其進行變性梯度凝膠電泳，經SYBRGreen I染色，確定每種菌所代表的條帶的相對位置，即得DGGE優勢細菌標準條帶。
4.根據權利要求2的制作方法，其特征在于，其中I)所述不同發酵階段的合格樣品，是指選取母曲、生曲、第一次翻倉大曲、第二次翻倉大曲、出倉曲共5種合格樣品；其中2)所述提取的微生物總DNA，是指分別提取母曲、生曲、第一次翻倉大曲、第二次翻倉大曲、出倉曲5種樣品的微生物總DNA。
5.根據權利要求2的制作方法，其特征在于，其中3)所述細菌16SrDNA V3可變區的PCR擴增使用巢式PCR擴增，以待測樣品的微生物總DNA為模板，先加入第一步擴增引物和反應體系進行擴增，第一步擴增采用的引物為16S1:5’ - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和16S2:5’- TACGGYTACCTTGTTACGAC TT -3’ ;取其產物作為模板，加入第二步擴增引物進行擴增，第二步擴增采用的引物為:R518:5’ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3’和338F-GC:5，-CGCCCGCCG CGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，。
6.根據權利要求2的制作方法，其特征在于，其中4)所述變性梯度凝膠電泳，方法是:采用10%變性聚丙烯酞胺凝膠電泳進行分離，變性劑濃度30-60%，電泳緩沖液采用1XTAE，電壓 100V，時間 IOh0
7.根據權利要求2的制作方法，其中，5)所述的專用引物如下:338F:5’ -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’ 和 R518:5’ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3’，擴增產物進行測序，所得序列在NCBI上與已登陸序列進行比對，從而確定微生物種群。
8.根據權利要求3的制作方法，其特征在于，其中I)所述優勢細菌所對應的DGGE條帶，是指母曲、生曲、第一次翻倉大曲、第二次翻倉大曲、出倉曲5種樣品DGGE圖譜中的優勢細菌所對應的條帶，所述專用引物如下:R518:5’ -ATT ACCGCGGCTGCTGG-3’和338F-GC:5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCG GGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，。
9.根據權利要求3的制作方法，其特征在于，制得的DGGE優勢細菌標準條帶中共包含16個條帶,指示13種細菌。
10.根據權利要求1的制作方法制作的大曲DGGE優勢細菌標準條帶。
11.根據權利要求1的方法制作的大曲DGGE優勢細菌標準條帶，其在發酵過程中優勢菌群檢測中的應用，所述應用步驟如下: 1)取發酵階段合格 待測樣品，按照步驟I的方法制備待測樣品16SrDNA V3可變區PCR產物，并與大曲DGGE優勢細菌標準條帶點樣于同一塊DGGE膠上； 2)根據DGGE圖譜樣品條帶與大曲DGGE優勢細菌標準條帶的對比，進行細菌種群鑒定; 3)切膠回收與大曲DGGE優勢細菌標準條帶中具有相同遷移距離的條帶，通過測序，驗證其適用性。
【文檔編號】C12Q1/68GK103898201SQ201210584368
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月28日 優先權日:2012年12月28日
【發明者】李長文, 山其木格, 梁慧珍, 張長霞, 陳麗君, 李巍, 劉冰 申請人:貴州國臺酒業有限公司