一種普洱茶發酵優勢真菌dgge標準條帶制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種普洱茶發酵優勢真菌DGGE標準條帶制作方法，在普洱茶發酵過程中檢測優勢真菌時，利用DGGE真菌標準條帶，快速鑒定發酵過程的優勢真菌，該方法通過監控普洱茶發酵過程中的優勢真菌條帶，控制產品的質量。
【專利說明】一種普洱茶發酵優勢真菌DGGE標準條帶制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種普洱茶發酵優勢真菌DGGE標準條帶制作方法，在普洱茶發酵過程中檢測優勢真菌時，利用DGGE真菌標準條帶，快速鑒定發酵過程的優勢真菌，該方法通過監控普洱茶發酵過程中的優勢真菌條帶，控制產品的質量。【背景技術】
[0002]普洱茶是以云南省一定區域內特有的大葉茶制成的曬青毛茶為原料，經過后發酵工藝生產而成的散茶和緊壓茶。普洱茶色澤呈棕紅褐色，湯色紅濃明亮，具獨特陳香，滋味醇厚回甘，耐沖泡。經現代臨床醫學驗證，普洱茶對人體具有多種保健作用，例如降血脂、降血壓、減肥、預防心血管疾病、抗癌等功效。
[0003]在普洱茶加工過程中，渥堆發酵是普洱茶品質形成的最為關鍵的一道工序，渥堆過程中茶葉品質隨著發酵的進行，其湯色、香氣、滋味、葉底都發生了深刻的變化，其中微生物在發酵過程中起著決定性的作用。在普洱茶的渥堆過程中微生物對茶葉中許多化學物質進行了轉化，最終形成了普洱茶獨特的風味以及多種功效。
[0004]優勢微生物指在一定的環境下，具有最適生活度、繁殖最快、數量最多的微生物種群。普洱茶發酵過程中的優勢微生物菌群，是決定普洱茶品質的關鍵。因此，若想控制普洱茶產品的質量，就要掌握普洱茶發酵過程中的優勢微生物菌群的變化。
[0005]變性梯度凝膠電泳(DenaturingGradient Gel Electrophoresis, DGGE)最早是由Fisher和Lerman于1979年首先發明用于檢測DNA突變的技術，1993年Muzyer等首次將DGGE技術應用于微生物生態學研究，并證實了這種技術在研究自然界微生物群落的遺傳多樣性和種群差異 方面具有明顯的優越性。
[0006]與傳統的微生物研究方法相比，PCR-DGGE技術以基因組DNA為研究對象，能夠快速、準確地鑒定在自然環境及人工環境中的微生物種群，無需對所研究的微生物進行培養，這一特性克服了傳統培養方法研究微生物群落時造成的微生物信息大量丟失的缺點，可以更為真實、客觀、有效的反映樣品中微生物群落尤其是復雜微生物群落的組成、結構和功能。另外PCR-DGGE可快速同時對多個樣品進行分析，因此非常適合研究微生物群落的時空變化。
[0007]作為一種成熟的分子生物學方法，DGGE也存在著明顯的缺憾，目前，商業化的DGGE標準條帶(DGGE Marker)很少，根據不同規格DGGE每塊膠上可以同時進行15-20個樣品的電泳，樣品較多時，不同樣品之間的比較受到很大的限制，而不同時間的電泳產品由于電壓、電流、緩沖溶液濃度、電泳時間等不同，造成樣品之間比較缺乏標志物，即DGGEMarker。
[0008]本發明利用PCR-DGGE技術監測普洱茶發酵過程中優勢微生物菌群的變化，其方法是，先制作一種優勢真菌標準條帶(即DGGE marker)，然后從生產過程中的普洱茶提取優勢真菌DGGE條帶，和上述標準條帶進行比較，如果吻合說明可以保證普洱茶質量，如果不吻合，通過調整微生物的量或調整工藝方法，使達到吻合，從而保證生產出的普洱茶質量均一，有利于普洱茶質量的穩定。此方法克服了傳統的開放式發酵中完全依靠經驗，無法嚴格保證微生物的重復性,也無法抑制有害微生物的弊端。
【發明內容】

[0009]本發明提供一種普洱茶發酵優勢真菌DGGE標準條帶制作方法。
[0010]所述方法包括以下步驟:
[0011]步驟1，從合格的普洱茶樣品中獲得標準優勢真菌DGGE條帶；
[0012]步驟2,由標準優勢真菌DGGE條帶獲得優勢真菌標準條帶。
[0013]其中步驟I的方法如下:
[0014]I)取普洱茶發酵的合格樣品；
[0015]2)提取微生物總DNA ；
[0016]3)以微生物總DNA為模板，在專用引物的引導下進行真菌18S rDNA的PCR擴增；
[0017]4)對擴增后的產物進行變性梯度凝膠電泳，sybrgreen I染色后得到DGGE標準圖譜；
[0018]5)將圖譜中優勢條帶進行切膠回收，得到標準優勢真菌DGGE條帶。
[0019]其中步驟2的方法如下:
[0020]I)取標準優勢真菌DGGE條帶；
[0021]2)以標準優勢真菌DGGE條帶為模板，在專用引物的引導下進行PCR擴增；
[0022]3)將擴增產物按照一定比例混合；
[0023]4)對其進行變性梯度凝膠電泳,經sybrgreen I染色,即得DGGE優勢真菌標準條帶。
[0024]以上步驟I中，
[0025]其中I)所述發酵合格樣品為經多次機械柜發酵后挑選出來的品評打分和理化指標檢測復合普洱茶標準的茶葉樣品。
[0026]其中2)所述提取微生物總DNA，包括提取待測樣品中真菌18S rDNA，采用原位的提取方法提取其中的總DNA。
[0027]其中3)所述在專用引物引導下進行真菌18S rDNA的PCR擴增，所述的專用引物如下:
[0028]第一步擴增引物為GeoA2:5’ -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3’ 和 Geoll:5’ -ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3’。
[0029]第二步擴增采用的引物為:NS31-GC:5’ -CGCCCGGGGCGCGCCCCGG
[0030]GCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC -3，和 Glol:5，-GCCTGCTTTAAACACTCTA -3’。
[0031]PCR擴增條件為巢式PCR擴增:先加入第一步擴增引物GeoA2、Geoll和反應體系進行第一步擴增；PCR反應條件為:94°C預變性4 min，然后在94°C變性45s，50°C _55°C引物復性45s，72°C引物延伸1.5min，循環30次，72°C終延伸10 min ;取其產物進行100倍稀釋后作為模板，以第二步擴增引物進行擴增，PCR反應條件為:94°C預變性4min，然后在94°C變性45s，50-55°C引物復性45s，72°C引物延伸lmin，循環30-35次，72°C終延伸10min。
[0032]其中4)所述變性梯度凝膠電泳，方法是:采用10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，變性劑濃度30-60%，電泳緩沖液采用IXTAE的緩沖液，電壓100V，時間10h。[0033]步驟2中，
[0034]其中2)所述專用引物及PCR擴增條件與步驟I中所述專用引物及PCR擴增條件相同。
[0035]其中3)所述一定比例是各條帶按照等比例混合。
[0036] 其中4)所述變性梯度凝膠電泳，方法與步驟I中變性梯度凝膠電泳方法相同。
[0037]本發明得到的DGGE優勢真菌標準條帶，是對合格的普洱茶樣品進行測定得到的真菌DGGE條帶，通過比較生產過程樣品的真菌DGGE條帶和本發明所得的標準條帶，可以快速準確的確定每批產品的優勢細菌是否一致，同時可以據此確定產品是否合格。
[0038]本發明的優點在于:
[0039]1、通過真菌DGGE標準條帶可以快速鑒定發酵過程的優勢真菌，減少切膠、擴增、測序鑒定等步驟，節省時間和成本。
[0040]2、該方法通過監控普洱茶發酵過程中的優勢真菌條帶，控制產品的質量。
【具體實施方式】
[0041]以下通過實施例進一步說明本發明，但不作為對本發明的限制。
[0042]實施例1
[0043]取合格的普洱茶發酵樣品，首先提取該樣品中微生物的總DNA，提取方法是:稱取Ig樣品，加入200mg玻璃珠,使用Omega soil DNA提取試劑盒對處理好的茶葉樣品進行提取，加入600ul SLX溶液，高速振蕩IOmin混合均勻，70°C水浴IOmin，期間混合樣品數次，加入200ul SP2溶液，混合均勻，冰浴5min, 13000g離心5min。上清轉移到一個新的離心管中，加入0.7倍異丙醇，顛倒混勻，13000g離心10min，棄去上清，倒置于吸水紙上干燥，加入200ul elution buffer到離心管中，混勻，65°C水浴20min溶解DNA。加入50ul HTR溶液,混合均勻，室溫放置2min，13000g離心2min，將上清轉移到一個新的離心管中，如果上清依舊帶有深色物質重復加入HTR溶液處理。加入等體積的XP2溶液，充分混合均勻，之后將所有溶液轉移到HiBind DNA柱子中，1000Og離心lmin，棄去流出液重新使用收集管。加入300ul XP2溶液，1000Og離心lmin，棄去流出液和收集管，把柱子放入一個新的收集管中，加入700ul經無水乙醇稀釋過的SPW wash溶液，1000Og離心lmin,棄去流出液重新使用收集管，再用700ul SPff rash溶液洗一次，棄去液體，把柱子插入空的收集管中，13000g離心2min,將柱子放入50°C烘箱30min。把柱子放到一個新的離心管中，加入50ul elutionbuffer到柱子中心，65°C水浴lOmin, 13000g離心lmin。將離心洗脫液重新加入柱子中，65°C水浴lOmin，13000g離心2min，所得洗脫液即為提取好的微生物總DNA。
[0044]對于真菌18S rDNA的PCR擴增，第一步擴增引物為GeoA2:5’ -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3’ 和 Geoll:5’ -ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3’。
[0045]第二步擴增采用的引物為:NS31-GC:5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGC GGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC -3’和 Glol:5’- GCCTGCTTTAAACACTCTA -3’。PCR 擴增條件為巢式PCR擴增:先加入第一步擴增引物GeoA2、Geoll和反應體系進行第一步擴增，PCR反應條件為:94°C預變性4 min，然后在94°C變性45s，50°C _55°C引物復性45s，72°C引物延伸1.5min，循環30次，72°C終延伸10 min，取其產物進行100倍稀釋后作為模板，以第二步擴增引物NS31-GC、Glol進行擴增，PCR反應條件為:94°C預變性4min，然后在94°C變性45s，50-55°C引物復性45s，72°C引物延伸lmin，循環30-35次，72°C終延伸10 min。目的產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳緩沖液為IXTAE緩沖液。
[0046]真菌變性梯度凝膠電泳(DGGE)及凝膠成像掃描與分析:
[0047]采用DC0DE?系統(BIO-RAD)構建DGGE指紋圖譜，具體方法為:將獲得的樣品的18S擴增產物(約230bp)混合，取200ng用10%變性聚丙烯酞胺凝膠電泳進行分離(丙烯酞胺濃度30-60%，電泳緩沖液1 X TAE，80V, 10h)，然后切下目的泳道區域，用sybrgreen I對變性聚丙烯酞胺凝膠染色，用quantity one凝膠成像掃描系統對銀染條帶進行照像,得到真菌的PCR-DGGE譜圖。
[0048]將譜圖中的優勢條帶進行切膠回收，以回收條帶為模板進行第二次PCR擴增，擴增的體系和條件同第一次擴增。將優勢條帶按照1:1的體積比進行混合，以真菌變性梯度凝膠電泳(DGGE)進行凝膠成像掃描與分析，sybrgreen I染色后進行檢驗，即得DGGE優勢真菌標準條帶。
【權利要求】
1.一種普洱茶發酵優勢真菌DGGE標準條帶制作方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 步驟1，從合格的普洱茶樣品中獲得標準優勢真菌DGGE條帶； 步驟2,由標準優勢真菌DGGE條帶獲得優勢真菌標準條帶。
2.根據權利要求1的制作方法，其特征在于，其中步驟I的方法如下: 1)取普洱茶發酵的合格樣品； 2)提取微生物總DNA； 3)以微生物總DNA為模板，在專用引物的引導下進行真菌18SrDNA的PCR擴增； 4)對擴增后的產物進行變性梯度凝膠電泳，sybrgreen I染色后得到DGGE標準圖譜； 5)將圖譜中優勢條帶進行切膠回收，得到標準優勢真菌DGGE條帶。
3.根據權利要求1的制作方法，其特征在于，其中步驟2的方法如下: 1)取標準優勢真菌DGGE條帶； 2)以標準優勢真菌DGGE條帶為模板，在專用引物的引導下進行PCR擴增； 3)將擴增產物按照一定比例混合； 4)對其進行變性梯度凝膠電泳，經sybrgreenI染色,即得DGGE優勢真菌標準條帶。
4.根據權利要求2的制作方法，其特征在于，其中I)所述合格樣品，為經多次機械柜發酵后挑選出來的品評打分和理化指標檢測復合普洱茶標準的茶葉樣品。
5.根據權利要求2的制作方法，其特征在于，其中2)所述提取的微生物總DNA，包括提取待測樣品中真菌18S rDNA。
6.根據權利要求2或3任何一項制作方法，其特征在于，其中所述專用引物如下:第一步擴增引物為 GeoA2:5，-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3’ 和 Geoll:5，-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3’ ；第二步擴增采用的引物為:NS31-GC:5’ -CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC -3，和 Glol:5，-GCCTGCTTTAAACACTCTA -3’。
7.根據權利要求2或3任何一項的制作方法，其中， PCR擴增條件為巢式PCR擴增:先加入第一步擴增引物GeoA2、Geoll和反應體系進行第一步擴增；PCR反應條件為:94°C預變性4 min，然后在94°C變性45s，50°C _55°C引物復性45s，72°C引物延伸1.5min，循環30次，72°C終延伸10 min ;取其產物進行100倍稀釋后作為模板，以第二步擴增引物進行擴增，PCR反應條件為:94°C預變性4min，然后在94°C變性45s，50-55°C引物復性45s，72°C引物延伸lmin，循環30-35次，72°C終延伸10 min。
8.根據權利要求2或3任何一項制作方法，其特征在于，其中所述變性梯度凝膠電泳，方法是:采用10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，變性劑濃度30-60%，電泳緩沖液采用IXTAE的緩沖液，電壓100V，時間10h。
9.根據權利要求3的制作方法，其特征在于，其中3)所述一定比例是將各條帶按照等比例進行混合。
10.根據權利要求1的制作方法制作的DGGE優勢真菌標準條帶。
【文檔編號】C12Q1/04GK103898202SQ201210584426
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月28日 優先權日:2012年12月28日
【發明者】李長文, 李巍, 梁慧珍, 山其木格, 張長霞, 陳麗君, 劉冰 申請人:云南天士力帝泊洱生物茶集團有限公司