含Fc融合蛋白的真核表達載體及其構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種含Fc融合蛋白的真核表達載體及其構建方法，步驟如下：制備Fc基因片段；將所得的Fc基因片段連接到pMD18-T載體中，得連接產物pMD18T-Fc；構建表達載體：將所得的連接產物pMD18T-Fc和表達載體pCDNA3.1經EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切，并利用T4DNA連接酶連接，得含Fc融合蛋白的真核表達載體pCDNA3.1-Fc。本發明制得含Fc端融合蛋白的真核表達載體，可直接將具生物活性的蛋白基因構建到該表達載體中，快速、高效的表達含Fc端的融合蛋白。
【專利說明】含Fe融合蛋白的真核表達載體及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種真核表達載體及其構建方法，特別涉及一種含Fe融合蛋白的真核表達載體及其構建方法。
【背景技術】
[0002]抗體的Fe端負責抗體的效應功能，如激活補體、結合Fe受體、穿越胎盤等。Fe融合蛋白主要是將生物活性蛋白與IgG的絞鏈區及CH2、CH3區結合。Fe融合蛋白具有如下特征:(I)通過與抗IgG或蛋白A結合用于檢測或純化；(2)通過該蛋白分子與其配體的相互作用將Fe段的生物學效應引到特定目標，如ADCC、固定補體及免疫調節作用等；(3)增加該蛋白在血液中的半裳期，利于重組蛋白作為治療藥物在臨床中的實際應用；(4) IgG、IgM和IgA的Fe結構域可形成多聚合分子，使重組蛋白具有更強的抗原結合力。
[0003]目前常用的表達載體中未含有Fe端融合蛋白的基因，在表達該類蛋白時需要自己構建，而現有技術方案是將生物活性蛋白的基因與Fe段基因通過重疊PCR連接好后，再構建到表達載體中，比較費時，費力。
【發明內容】
[0004]基于此，針對現有技術表達載體中未含有Fe端融合蛋白的基因,構建含有Fe的表達載體時，費時費力的問題，本發明提供含Fe融合蛋白的真核表達載體及其構建方法。
[0005]解決上述技術問題 的具體技術方案如下:
[0006]一種含Fe融合蛋白的真核表達載體的構建方法，包括如下步驟:
[0007](I)制備Fe基因片段，所述Fe基因片段堿基組成如SEQ ID N0.3所示；
[0008](2)將步驟(1)所得的Fe基因片段連接到pMD18-T載體中，得連接產物pMD18T-Fc ；
[0009](3)構建表達載體:將步驟(2)所得的連接產物pMD18T_Fc和表達載體p⑶NA3.1經EcoR I , Not I雙酶切，并利用T4DNA連接酶連接，得含Fe融合蛋白的真核表達載體pCDNA3.1-Fc。
[0010]在其中一些實施例中，步驟(1)所述的Fe基因片段的制備方法為:以人IgGl的重鏈恒定區為模板，用引物擴增，得Fe基因片段。
[0011]在其中一些實施例中，所述的引物為:
[0012]上游引物:GAATTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT，
[0013]下游引物:GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC。
[0014]在其中一些實施例中，步驟(2)所述的連接為:于21_23°C連接0.9-1.lh。
[0015]根據上述構建方法制得一種含Fe融合蛋白的真核表達載體。
[0016]本發明一種含Fe融合蛋白的真核表達載體及其構建方法具有以下優點和有益效果:
[0017]本發明的構建方法，可快速、高效的表達含Fe端的融合蛋白，利用該方法得到的含Fe端融合蛋白的真核表達載體，可直接將具生物活性的蛋白基因構建到該表達載體中，顯著改善的非Ig蛋白藥物動力學特性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為人IgG1Fc基因的PCR擴增結果示意圖；
[0019]圖2為所制備的載體P⑶NA3.1-Fc構建示意圖；
[0020]圖3為P⑶NA3.1-Fc瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施例
[0021]本發明通過將1gG1的絞鏈區及CH2、CH3區即Fe段，構建到真核表達p⑶NA3.1中，獲得一種含Fe融合蛋白的真核表達載體及其構建方法，該構建方法可快速、高效的表達含Fe端的融合蛋白。
[0022]為了能夠更清楚地理解本發明的技術內容，特舉以下實施例結合附圖詳細說明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人,分子克隆:實驗室手冊(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學試劑或者試劑盒，均為市售產品。
[0023]其中，質粒H:暨南大學鄧寧教授惠贈PMD18T-PLCH ；
[0024]所用培養基的配方如下:
[0025]LB培養基:蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，NaCllg，溶于IOOmL去離子水中，高壓蒸氣滅菌。
[0026]含Amp的LB瓊脂平板培養基:蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，NaCllg, 1.5g瓊脂條溶于IOOmL去離子水中，高壓蒸氣滅菌，滅菌完成后待溫度降為50°C是加入Amp，使終濃度為 50 μ g/mL0
[0027]含Zeocin的LB固體平板培養基:蛋白胨lg，酵母提取物0.5g,NaCllg, 1.5g瓊脂條溶于IOOmL去離子水中，高壓蒸氣滅菌，滅菌完成后待溫度降為50°C是加入Zeocin，使終濃度為25 μ g/mL。
[0028]以下將結合具體實施例進一步闡述本發明。
[0029]實施例1
[0030]1.制備Fe基因片段:
[0031]以人IgG1的重鏈恒定區為模板，用引物人擴增，得Fe基因片段；
[0032]其中，所述的引物為:
[0033]SEQ ID N0.1
[0034]上游引物:GAATTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT，
[0035]SEQ ID N0.2
[0036]下游引物:GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC。
[0037](PCR擴增結果參見圖1，其中M為DNA Marker; I為Fe基因片段)
[0038]其中，Fe基因片段的堿基組成為:
[0039]SEQ ID N0.3[0040]GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA。
[0041]具體擴增體系如下(所用dNTP Mixture、Taq均購自日本寶生物工程株式會社TaKaRa Bio Inc):
[0042]PCR反應體系
[0043]PCR reaction system
【權利要求】
1.一種含Fe融合蛋白的真核表達載體的構建方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)制備Fe基因片段，所述Fe基因片段的堿基組成如SEQID N0.3所示； (2)將步驟(1)所得的Fe基因片段連接到pMD18-T載體中，得連接產物pMD18T_Fc； (3)構建表達載體:將步驟(2)所得的連接產物pMD18T-Fc和表達載體p⑶NA3.1經EcoR I , Not I雙酶切，并利用T4DNA連接酶連接，得含Fe融合蛋白的真核表達載體pCDNA3.1-Fc。
2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟(1)所述的制備Fe基因片段的制備方法為=WAIgG1的重鏈恒定區為模板，用引物擴增，得Fe基因片段。
3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，所述引物為:
上游引 物:GAATTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT， 下游引物:GCGGCCGCTCAITTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC。
4.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟(2)所述的連接為:于21-23°C連接 0.9-1.1h0
5.根據權利要求1-4任一項所述的構建方法制得一種含Fe融合蛋白的真核表達載體。
【文檔編號】C12N15/66GK103898151SQ201210587375
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月28日 優先權日:2012年12月28日
【發明者】萬曉春, 呂衛東, 于廣, 鄧寧 申請人:深圳先進技術研究院