含有檢測標簽IgG的表達載體、構建方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了含有檢測標簽IgG的表達載體、構建方法及其在目的蛋白的表達檢測中的應用。該檢測標簽IgG為至少一個種屬的IgG的恒定區基因；通過至少一個種屬的IgG的恒定區基因與至少一個種屬的二抗的直接反應實現目的蛋白的表達檢測。含有檢測標簽IgG的表達載體的構建包括：設計至少一個種屬的IgG的恒定區基因的上游引物和下游引物；以至少一個種屬的cDNA為模板，采用上游引物和下游引物進行PCR擴增，得到至少一個種屬的IgG的恒定區基因；將至少一個種屬的IgG的恒定區基因與表達載體連接，構建成含有檢測標簽IgG的表達載體。本發明應用于目的蛋白的檢測時可降低假陰性檢測結果出現的概率，提高檢測的準確度和靈敏度。
【專利說明】含有檢測標簽IgG的表達載體、構建方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學實驗技術方法領域，涉及一種分子生物學實驗技術。更具體地，本發明涉及含有檢測標簽IgG的表達載體、構建方法及其應用。
【背景技術】
[0002]分子生物學實驗中，基因工程方法表達外源蛋白是常用的技術手段，同時該過程必需檢測目的蛋白的表達。目前，通常檢測目標蛋白的方法是通過蛋白對應的抗體來進行抗原抗體反應，再通過二抗顯色來間接確定目的蛋白。這樣會產生兩個問題:(1)目的蛋白與抗體結合能力不能得到有效保證，抗原與抗體不結合而造成二抗不能有效顯色，結果導致假陰性的實驗結果，造成實驗失敗；(2) —些新的蛋白沒有相應的抗體來檢測，實驗無法完成；(3)檢測過程涉及到目的蛋白與抗體結合、抗體與二抗結合兩步操作，影響檢測速度和準確度。

【發明內容】

[0003]本發明要解決的技術問題在于，針對現有技術中檢測目的蛋白時可能存在假陰性實驗結果、由于缺少抗體無法完成目的蛋白檢測以及檢測過程繁瑣的問題，提供一種含有檢測標簽IgG的表達載體，從而提供操作簡便、結果準確、使用范圍廣的目的蛋白的檢測方法。本發明同時也提供上述表達載體的構建方法及其在目的蛋白的表達及檢測中的應用。 [0004]本發明要解決的技術問題通過以下技術方案得以實現:提供一種含有檢測標簽IgG的表達載體,所述檢測標簽IgG為至少一個種屬的IgG的恒定區基因；在表達載體中插入至少一個種屬的IgG的恒定區基因得到所述含有檢測標簽IgG的表達載體。
[0005]在上述含有檢測標簽IgG的表達載體中，所述至少一個種屬的IgG的恒定區基因包括人IgG的恒定區基因、兔IgG的恒定區基因、鼠IgG的恒定區基因、羊IgG的恒定區基因、馬IgG的恒定區基因、牛IgG的恒定區基因、豬IgG的恒定區基因、猴IgG的恒定區基因、雞IgG的恒定區基因、鴨IgG的恒定區基因、狗IgG的恒定區基因、熊貓IgG的恒定區基因和狼IgG的恒定區基因。
[0006]根據本發明的另一方面，提供含有檢測標簽IgG的表達載體的構建方法，所述檢測標簽IgG為至少一個種屬的IgG的恒定區基因；所述方法包括以下步驟:
[0007]S1、設計所述至少一個種屬的IgG的恒定區基因的上游引物和下游引物；
[0008]S2、以至少一個種屬的cDNA為模板，采用所述上游引物和下游引物進行PCR擴增，得到至少一個種屬的IgG的恒定區基因；
[0009]S3、將所述至少一個種屬的IgG的恒定區基因與表達載體連接，構建成含有檢測標簽IgG的表達載體。
[0010]在上述含有檢測標簽IgG的表達載體的構建方法中，在所述步驟S3中，所述表達載體包括PET系列表達載體、GST系列表達載體、pTrxA系列表達載體、ρ⑶NA3.1/His C系列表達載體、PCDNA5/FRT/T0系列表達載體、pEGFP-Nl系列表達載體和pBudce4.1系列表達載體。
[0011]根據本發明的另一方面，提供含有檢測標簽IgG的表達載體在目的蛋白的表達檢測中的應用，所述檢測標簽IgG為至少一個種屬的IgG的恒定區基因；通過所述至少一個種屬的IgG的恒定區基因與所述至少一個種屬的二抗的直接反應實現所述目的蛋白的表達檢測。
[0012]上述含有檢測標簽IgG的表達載體的應用包括以下步驟:
[0013]獲取至少一個種屬的IgG的恒定區基因；構建含有至少一個種屬的IgG的恒定區基因的表達載體；獲取目的蛋白基因，并將所述目的蛋白基因連接于含有至少一個種屬的IgG的恒定區基因的表達載體；將連接有目的蛋白基因、且含有至少一個種屬的IgG的恒定區基因的表達載體轉染于表達菌株中進行誘導培養，收集表達產物；以及采用所述至少一個種屬的二抗進行ECL顯色，以檢測所述目的蛋白的表達。
[0014]上述含有檢測標簽IgG的表達載體的應用中于，獲取至少一個種屬的IgG的恒定區基因包括:設計所述至少一個種屬的IgG的恒定區基因的上游引物和下游引物；以至少一個種屬的cDNA為模板，采用所述上游引物和下游引物進行PCR擴增，獲取至少一個種屬的IgG的恒定區基因。
[0015]上述含有檢測標簽IgG的表達載體的應用中，構建含有至少一個種屬的IgG的恒定區基因的表達載體包括:同時雙酶切表達載體和至少一個種屬的IgG的恒定區基因；利用DNA電泳同時回收雙酶切產生的基因片段和載體片段；以及將所述載體片段和所述基因片段用連接酶進行連接反應，以構建含有至少一個種屬的IgG的恒定區基因的表達載體。
[0016]實施本 發明可以獲得以下有益效果:本發明中采用至少一個種屬的IgG的恒定區基因作為檢測標簽，將包含其的表達載體應用于目的蛋白的表達檢測時，由于IgG的恒定區基因的表達產物可與對應種屬的二抗直接進行免疫反應，因此可以檢測目的蛋白的表達狀況。上述檢測操作實現簡單、使用方便且選擇面廣。另外，本發明選用可與實驗室常用的二抗特異性結合的IgG檢測標簽，兩者結合度高，可降低假陰性檢測結果出現的概率，提高檢測的準確度和靈敏度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]以下將結合附圖和具體實施例對本發明做進一步詳細說明。附圖中:
[0018]圖1是實施例1中pET28a_鼠IgG的酶切鑒定圖；
[0019]圖2是基于檢測標簽IgG檢測實施例1中制得的目的蛋白的檢測結果；
[0020]圖3是基于檢測標簽IgG檢測實施例2中制得的目的蛋白的檢測結果；
[0021]圖4是基于檢測標簽IgG檢測實施例3中制得的目的蛋白的檢測結果；
[0022]圖5是基于檢測標簽IgG檢測實施例4中制得的目的蛋白的檢測結果。
【具體實施方式】
[0023]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0024]本發明提供了一種含有檢測標簽IgG的表達載體在目的蛋白的表達檢測中的應用，這里所描述的檢測標簽IgG指的是至少一個種屬的IgG的恒定區基因，并優選為二抗已知的實驗室中常用的種屬類別，例如兔、鼠等種屬。具體應用過程中，首先構建本發明的含有檢測標簽IgG的表達載體，隨后將目的蛋白連接到含有檢測標簽IgG的表達載體中，在表達菌株中完成表達后采用對應種屬的二抗進行顯色反應檢測。由于檢測標簽IgG的高度保守性，其與相應二抗的結合能力和針對性強，可同時提高檢測的精確度和靈敏度。
[0025]可在美國國立生物信息中心(NCBI)、歐洲生物信息中心(EBI)、法國免疫球蛋白基因序列數據庫(MGT)等數據庫查詢不同種屬的IgG的恒定區基因，并根據查詢到的基因序列設計相應的PCR擴增引物(具體為設計上游引物和下游引物)。隨后分別取不同種屬動物的血樣，各自提取總RNA并分別反轉錄成cDNA。以獲得的cDNA為模板，采用構建的擴增引物進行PCR擴增，得到不同種屬的基因片段。優選地，將基因片段的長度控制在900bp左右。
[0026]本發明所采用的表達載體為現有技術中通用的真核表達載體和原核表達載體。具體例如，采用的表達載體包括但不限于PET系列表達載體(pET28a)、GST系列表達載體(PGEX-4T-1)、pTrxA系列表達載體、pCDNA3.1/His C系列表達載體、pCDNA5/FRT/T0系列表達載體、pEGFP-Nl系列表達載體和pBudce4.1系列表達載體。
[0027]可使用不同酶切位點將至少一個種屬的IgG的恒定區基因克隆到表達載體中時(即實現二者的連接時)。結合以下將詳細說明的擴增引物設計可知，本發明可使用的酶切位點包含但不限于上游的Xho I酶切位點、Hind III酶切位點，下游的Xba I酶切位點、XhoI酶切位點等。
[0028]在其中一個【具體實施方式】中，在本發明涉及的不同種屬的所有上游引物中引入Xho I酶切位點，在下游引物中引入Xba I酶切位點。對獲取的相應種屬的IgG的恒定區基因和采用的表達載體進行同樣的酶切后，將相應種屬的IgG的恒定區基因連接/克隆到真核表達載體P⑶NA3.1/His C中，構建出含有不同種屬的檢測標簽IgG的真核表達載體。該實施方式中設計的多個引物序列如下。
[0029]1-1、人IgG的恒定區基因的引物設計
[0030]上游引物的引物序列1:5’ -CCG CTC GAG GTC TCC TCA GCC TCC ACC-3，，
[0031]下游引物的引物序列2:5’ -GAG TCT AGA TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA-3，；
[0032]1-2、鼠IgG的恒定區基因的引物設計
[0033]上游引物的引物序列3:5’ -CCG CTC GAG GCC CCA TCT GTC TAT CCC-3，，
[0034]下游引物的引物序列4:5’ -GAG TCT AGA TCA TTT ACC AGG GGA GCG AGA-3，；
[0035]1-3、兔IgG的恒定區基因的引物設計
[0036]上游引物的引物序列5:5’ -CCG CTC GAG CAA CCT AAG GCT CCG TCA-3，，
[0037]下游引物的引物序列6:5’ -GAG TCT AGA TCA TTT ACC CGG AGA GCG GGA-3，；
[0038]1-4、羊IgG的恒定區基因的引物設計
[0039]上游引物的引物序列7:5’ -CCG CTC GAG GTG GTG GTG GAC GTG GGC CAG-3’，
[0040]下游引物的引物序列8:5，-GAG TCT AGA TCA TTT ACC CGG AGG CTT AGA GAT-3，;
[0041]1-5、馬IgG的恒定區基因的引物設計
[0042]上游引物的引 物序列9:5’ -CCG CTC GAG GCC TCC ACC ACC GCC CCG-3，，
[0043]下游引物的引物序列10:5’ -GAG TCT AGA TCA TTT ACC CGG GTT CTT GGA-3，；[0044]1-6、牛IgG的恒定區基因的引物設計
[0045]上游引物的引物序列11:5，-CCG CTC GAG GCC TCC ACC ACA GCC CCG-3，，
[0046]下游引物的引物序列12:5，-GAG TCT AGA TCA TTT ACC CGC AGA CTT AGA-3，；
[0047]1-7、猴IgG的恒定區基因的引物設計[0048]上游引物的引物序列13:5’ -CCG CTC GAG CCT CCA CCA AGG GCC CAT-3，，
[0049]下游引物的引物序列14:5，-GAG TCT AGA TCA TCT GCG TGT AGT GGT TGT-3，；
[0050]1-8、雞IgG的恒定區基因的引物設計
[0051]上游引物的引物序列15:5，-CCG CTC GAG GCG AGC CCC ACA TCG CCC-3，，
[0052]下游引物的引物序列16:5’ -GAG TCT AGA TCA TTT ACC AGC CTG TTT CTG-3，；
[0053]1-9、狗IgG的恒定區基因的引物設計
[0054]上游引物的引物序列17:5，-CCG CTC GAG CAC TGG CCC CCA GCT GCG GGT-3，，
[0055]下游引物的引物序列18:5’ -GAG TCT AGA TCA TTT ACC CGG AGA ATG GGA-3’ ；
[0056]1-10、豬IgG的恒定區基因的引物設計
[0057]上游引物的引物序列19:5’ -CCG CTC GAG GCC CCA TCT GTC TAT CCC-3，，
[0058]下游引物的引物序列20:5，-GAG TCT AGA TCA TTT ACC CGG AGA AAT GGA-3，；
[0059]1-11、熊貓IgG的恒定區基因的引物設計
[0060]上游引物的引物序列21:5，-CCG CTC GAG CCT CCA CCA CGG GCC CCA TCG-3，，
[0061]下游引物的引物序列22:5’ -GAG TCT AGA TCA TTT ACC CGG AGACTG GGA-3，。
[0062]以上涉及的動物種屬多為實驗室中使用的常見種屬，例如兔、鼠、羊、馬等等。可以根據所擁有的二抗的種屬選擇含有不同檢測標簽IgG的表達載體，進一步提高構建此類表達載體的便利度。除以上列舉的動物種屬外，還可采用狼、猩猩等動物的IgG的恒定區基因。
[0063]在另一【具體實施方式】中，在本發明涉及的不同種屬的所有上游引物中引入HindIII酶切位點，在下游引物中引入Xh0 I酶切位點。對獲取的相應種屬的IgG的恒定區基因和采用的表達載體進行同樣的酶切后，將相應種屬的IgG的恒定區基因連接/克隆到原核表達載體pET28a中，構建出含有不同種屬的檢測標簽IgG的原核表達載體。該實施方式中設計的多個引物序列如下。
[0064]2-1、人IgG的恒定區基因的引物設計
[0065]上游引物的引物序列23:5’ -CCG AAG CTT GTC TCC TCA GCC TCC ACC-3，，
[0066]下游引物的引物序列24:5，-GAG CTC GAG TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA-3，；
[0067]2-2、鼠IgG的恒定區基因的引物設計
[0068]上游引物的引物序列25:5’ -CCG AAG CTT GCC CCA TCT GTC TAT CCC-3’，
[0069]下游引物的引物序列26:5，-GAG CTC GAG TCA TTT ACC AGG GGA GCG AGA-3，；
[0070]2-3、兔IgG的恒定區基因的引物設計
[0071]上游引物的引物序列27:5，-CCG AAG CTT CAA CCT AAG GCT CCG TCA-3，，
[0072]下游引物的引物序列28:5，-GAG CTC GAG TCA TTT ACC CGG AGA GCG GGA-3，；
[0073]2-4、羊IgG的恒定區基因的引物設計
[0074]上游引物的引物序列29:5’ -CCG AAG CTT GTG GTG GTG GAC GTG GGC CAG-3’，
[0075]下游引物的引物序列30:5’ -GAG CTC GAG TCA TTT ACC CGG AGG CTT AGAGAT-3，；
[0076]2-5、馬IgG的恒定區基因的引物設計
[0077]上游引物的引物序列31:5，-CCG AAG CTT GCC TCC ACC ACC GCC CCG-3，，
[0078]下游引物的引物序列32:5’ -GAG CTC GAG TCA TTT ACC CGG GTT CTT GGA-3，；
[0079]2-6、牛IgG的恒定區基因的引物設計
[0080]上游引物的引物序列33:5’ -CCG AAG CTT GCC TCC ACC ACA GCC CCG-3，，
[0081]下游引物的引物序列34:5’ -GAG CTC GAG TCA TTT ACC CGC AGA CTT AGA-3’ ；
[0082]2-7、猴IgG的恒定區基因的引物設計
[0083]上游引物的引物序列35:5’ -CCG AAG CTT CCT CCA CCA AGG GCC CAT-3，，
[0084]下游引物的引物序列36:5，-GAG CTC GAG TCA TCT GCG TGT AGT GGT TGT-3’ ；
[0085]2-8、雞IgG的恒定區基因的引物設計
[0086]上游引物的引物序列37:5’ -CCG AAG CTT GCG AGC CCC ACA TCG CCC-3，，
[0087]下游引物的引物序列38:5，-GAG CTC GAG TCA TTT ACC AGC CTG TTT CTG-3，；
[0088]2-9、狗IgG的恒定區基因的引物設計
[0089]上游引物的引物序列39:5，-CCG AAG CTT CAC TGG CCC CCA GCT GCG GGT-3，，
[0090]下游引物的引物序列40:5，-GAG CTC GAG TCA TTT ACC CGG AGA ATG GGA-3’ ；
[0091]2-10、豬IgG的恒定區基因的引物設計
[0092]上游引物的引物序列41:5’ -CCG AAG CTT GCC CCA TCT GTC TAT CCC-3，，
[0093]下游引物的引物序列42:5，-GAG CTC GAG TCA TTT ACC CGG AGA AAT GGA-3，；
[0094]2-11、熊貓IgG的恒定區基因的引物設計
[0095]上游引物的引物序列43:5’ -CCG AAG CTT CCT CCA CCA CGG GCC CCA TCG-3，，
[0096]下游引物的引物序列44:5’ -GAG CTC GAG TCA TTT ACC CGG AGA CTG GGA-3，。
[0097]應該注意的是，雖然以上列示了兩種實施方式中使用的上游引物和下游引物，但可應用于本發明的上游引物和下游引物并不受限于此。在上述數據庫中查詢到所需的IgG的恒定區基因序列后，本領域技術人員可根據后續將采用的表達載體，結合IgG的恒定區基因設計相應的擴增引物。此處不再對此做過多解釋和說明。
[0098]以下通過具體實施例詳細說明如何構建本發明中含有檢測標簽IgG的表達載體，并進一步詳細說明如何將該含有檢測標簽IgG的表達載體應用于目的蛋白的表達檢測。實施例1-2為采用鼠IgG的恒定區基因的具體示例，實施例3-4為采用兔IgG的恒定區基因的具體示例。
[0099]實施例1:
[0100]本實施例采用pET28a原核表達載體。提取鼠的血樣，提取總RNA后將其反轉錄為cDNA。設計2-2所示的上游引物和下游引物，以鼠的cDNA為模板，采用上述擴增引物進行PCR擴增，得到所需的鼠IgG的恒定區基因。以Hind III和Xho I雙酶切鼠IgG的恒定區基因，同時以Hind III和Xho I雙酶切pET28a表達載體，利用DNA電泳同時回收兩種酶切片段，以1:4的摩爾比將載體片段和基因片段用T4DNA連接酶進行連接反應，于16°C反應2小時，取10微升連接產物加入100微升大腸桿菌DH5 α感受態細胞中，靜置于冰水混合物中30分鐘后于42°C中熱激90秒，再于冰水混合物上靜置1分鐘，加入100微升37°C的SOC培養基，于37°C搖床中溫育1小時涂于含有卡那霉素的平板上，放入37°C培養箱中培養過夜，構建得到含鼠檢測標簽IgG的原核表達載體(pET28a-鼠IgG原核表達載體)。挑取單菌落于含有卡那霉素的LB培養基于37°C培養，采用2-2所示的上游引物和下游引物進行PCR鑒定，將陽性結果的菌液提取質粒，將質粒pET28a-鼠IgG用HindIII和Xho I雙酶切進行酶切鑒定(如圖1所示)，并最終進行序列分析確定鼠檢測標簽IgG成功克隆于表達載體中，終止S碼子在IgG標簽末端。
[0101] 本實施例中采用CAP蛋白作為目的蛋白。設計如下所示的擴增引物，并在上游引物和下游引物中分別引入BamH I和EcoR I酶切位點。
[0102]上游引物45 為:5’ -ATT GGATCC GGA GTA TTG TGG GAT GTC-3’ ；
[0103]下游引物46 為:5’ -ATT GAATTC GAT TGG AGA TCC TGA GGT-3’ ；
[0104]以CAP基因為模板，采用以上兩個擴增引物擴增含有BamH I和EcoR I酶切位點的CAP基因片段。隨后以BamH I和EcoR I雙本酶切CAP基因及pET28a-鼠IgG載體，利用DNA電泳同時回收兩種酶切片段，以1:4的摩爾比將載體片段和基因片段用T4DNA連接酶進行連接反應，于16°C反應2小時，取10微升連接產物加入100微升大腸桿菌DH5 α感受態細胞中，靜置于冰水混合物中30分鐘后于42°C中熱激90秒，再于冰水混合物上靜置I分鐘，加入100微升37°C的SOC培養基，于37°C搖床中溫育I小時涂于含有卡那霉素的平板上，放入37°C培養箱中培養過夜，構建得到含鼠檢測標簽IgG的原核表達質粒(pET28a-CAP-鼠IgG原核表達質粒)。挑取單菌落于含有卡那霉素的LB培養基于37°C培養，采用引物45，46所示的上游引物和下游引物進行PCR鑒定，將陽性結果的菌液提取質粒，將質粒pET28a-CAP-鼠IgG用BamHI和EcoR I雙酶切進行酶切鑒定，并最終進行序列分析質粒pET28a-CAP-鼠IgG，最終構建完成的pET28a_CAP_鼠IgG質粒轉化于大腸桿菌表達菌株Rosetta中，挑取單克隆菌落于含有卡那霉素的LB培養基中于37°C培養，至菌體OD值達到0.6時用IPTG誘導表達3小時，收集細胞，用TBST (含有I %的Triton)裂解細胞。取20 μ I蛋白上樣loading buffer于95°C溫度上變性5分鐘后，進行SDS-PAGE電泳，轉膜后進行Western Blot檢測，用鼠二抗反應I小時后，ECL顯色，可以清楚檢測到目的蛋白的表達。圖2是用鼠二抗進行Western Blot的實驗圖，在該圖中可以看到有大小為55KD的蛋白表達帶，與本實驗中目的蛋白與鼠的IgG融合蛋白理論大小一致，說明目的蛋白已表達成功。其檢測原理是通過檢測鼠IgG蛋白的表達來間接檢測融合蛋白的表達，表達帶的大小與理論大小一致說明，目的蛋白與鼠IgG蛋白成功表達產生融合蛋白，也間接證明目的蛋白表達成功。
[0105]實施例2 ；
[0106]本實施例采用P⑶NA3.1/His C真核表達載體。提取鼠的血樣，提取總RNA后將其反轉錄為cDNA。設計1-2所示的上游引物和下游引物，以鼠的cDNA為模板，采用上述擴增引物進行PCR擴增，得到所需的鼠IgG的恒定區基因。以Xho I和Xba I酶切位點雙酶切的鼠IgG基因、同時以Xho I和Xba I雙酶切P⑶NA3.1/His C載體，利用DNA電泳同時回收兩種酶切片段，以1:4的摩爾比將載體片段和基因片段用T4DNA連接酶進行連接反應，于16°C反應2小時，取10微升連接產物加入100微升大腸桿菌DH5a感受態細胞中，靜置于冰水混合物中30分鐘后于42°C中熱激90秒，再于冰水混合物上靜置I分鐘，加入100微升37°C的SOC培養基，于37°C搖床中溫育I小時涂于含有卡那霉素的平板上，放入37°C培養箱中培養過夜，構建得到含鼠檢測標簽IgG的原核表達質粒(P⑶NA3.1/His C-鼠IgG真核表達質粒)。挑取單菌落于含有氨芐青霉素的LB培養基于37°C培養，采用引物1-2所示的上游引物和下游引物進行PCR鑒定，將陽性結果的菌液提取質粒，將質粒pCDNA3.1/HisC-鼠IgG用Xho I和Xba I雙酶切進行酶切鑒定，并最終進行序列分析質粒ρ⑶NA3.1/HisC-鼠IgG將鼠IgG的恒定區基因克隆至pCDNA3.1/His C中，構建得到pCDNA3.1/His C-鼠IgG真核表達載體，并最終進行序列分析，終止密碼子在IgG標簽末端。
[0107]本實施例中同樣采用CAP蛋白作為目的蛋白。在上游引物和下游引物中分別引ABamH I和EcoR I酶切位點。以CAP基因為模板，擴增含有BamH I和EcoR I酶切位點的CAP基因片段。隨后以BamH I和EcoR I雙酶切CAP基因及pCDNA3.1/His C-鼠IgG表達載體，并連接轉化到大腸桿菌DH5 α中，提取質粒，酶切鑒定，測序，將最終構建完成的PCDNA3.1/His C-CAP-鼠IgG質粒轉染于293細胞中，48小時后收集細胞，用TBST (含有I %的Triton)裂解細胞，取20 μ I蛋白上樣loading buffer于95°C溫度上變性5分鐘后，進行SDS-PAGE電泳，轉膜后進行Western Blot檢測，用鼠二抗反應I小時后，ECL顯色，可以清楚檢測到目的蛋白的表達。圖3是直接使用鼠二抗進行的Western Blot實驗圖，在該圖中可以看到有大小為55KD的蛋白表達帶，與本實驗中目的蛋白大小一致。
[0108]實施例3:[0109]本實施例采用pET28a原核表達載體。提取兔的血樣，提取總RNA后將其反轉錄為cDNA。設計2-3所示的上游引物和下游引物，以兔的cDNA為模板，采用上述擴增引物進行PCR擴增，得到所需的兔IgG的恒定區基因。以Hind III和Xho I雙酶切的兔IgG的恒定區基因、同時以Hind III和Xho I雙酶切pET28a載體，利用DNA電泳同時回收兩種酶切片段，以1:4的摩爾比將載體片段和基因片段用T4DNA連接酶進行連接反應，于16°C反應2小時，取10微升連接產物加入100微升大腸桿菌DH5 α感受態細胞中，靜置于冰水混合物中30分鐘后于42°C中熱激90秒，再于冰水混合物上靜置I分鐘，加入100微升37°C的SOC培養基，于37°C搖床中溫育I小時涂于含有卡那霉素的平板上，放入37°C培養箱中培養過夜，構建得到pET28a-兔IgG表達載體。挑取單菌落于含有卡那霉素的LB培養基于37°C培養，采用3-2所示的上游引物和下游引物進行PCR鑒定，將陽性結果的菌液提取質粒，將質粒pET28a-兔IgG用Hind III和Xho I雙酶切進行酶切鑒定，并最終進行序列分析確定兔檢測標簽IgG成功克隆于表達載體中，終止、碼子在IgG標簽末端。
[0110]本實施例中同樣采用CAP蛋白作為目的蛋白。在上游引物和下游引物中分別引入BamH I和EcoR I酶切位點。以CAP基因為模板，擴增含有BamH I和EcoR I酶切位點的CAP基因片段，以BamH I和EcoR I雙酶切CAP基因及pET28a_兔IgG表達載體，利用DNA電泳同時回收兩種酶切片段，以1:4的摩爾比將載體片段和基因片段用T4DNA連接酶進行連接反應，于16°C反應2小時，取10微升連接產物加入100微升大腸桿菌DH5 α感受態細胞中，靜置于冰水混合物中30分鐘后于42°C中熱激90秒，再于冰水混合物上靜置I分鐘，加入100微升37°C的SOC培養基，于37°C搖床中溫育I小時涂于含有卡那霉素的平板上，放入37°C培養箱中培養過夜，構建得到含兔檢測標簽IgG的原核表達質粒(pET28a-CAP-兔IgG原核表達質粒)。挑取單菌落于含有卡那霉素的LB培養基于37 °C培養，采用引物45，46所示的上游引物和下游引物進行PCR鑒定，將陽性結果的菌液提取質粒，將質粒pET28a-CAP-兔IgG用BamH I和EcoR I雙酶切進行酶切鑒定，并最終進行序列分析質粒pET28a_CAP_兔IgG，最終構建完成的pET28a-CAP_兔IgG質粒轉化于大腸桿菌表達菌株Rosetta中，挑取單克隆菌落于含有卡那霉素的LB培養基中于37 °C培養，至菌體OD值達到0.6時用IPTG誘導表達3小時，收集細胞，用TBST (含有1 %的Triton)裂解細胞，取20 μ l蛋白上樣loadingbuffer于95°C溫度上變性5分鐘后，進行SDS-PAGE電泳，轉膜后進行Western Blot檢測，用兔二抗反應1小時后，ECL顯色，可以清楚檢測到目的蛋白的表達。圖4是直接使用兔二抗進行Western Blot的實驗圖，在該圖中可以看到有大小為55KD的蛋白表達帶,與本實驗中目的蛋白大小一致。
[0111]實施例4;
[0112]本實施例采用P⑶NA3.1/His C真核表達載體。提取兔的血樣，提取總RNA后將其反轉錄為cDNA。設計1-3所示的上游引物和下游引物，以兔的cDNA為模板，采用上述擴增引物進行PCR擴增，得到所需的兔IgG的恒定區基因。以Xho I和Xba I酶切位點雙酶切兔IgG的恒定區基因、同時以Xho I和Xba I雙酶切P⑶NA3.1/His C載體，利用DNA電泳同時回收兩種酶切片段，以1:4的摩爾比將載體片段和基因片段用T4DNA連接酶進行連接反應，于16°C反應2小時，取10微升連接產物加入100微升大腸桿菌DH5 α感受態細胞中，靜置于冰水混合物中30分鐘后于42°C中熱激90秒，再于冰水混合物上靜置I分鐘,加入100微升37°C的SOC培養基，于37°C搖床中溫育I小時涂于含有卡那霉素的平板上，放入37°C培養箱中培養過夜，構建得到P⑶NA3.1/His C-兔IgG真核表達載體。挑取單菌落于含有氨芐青霉素的LB培養基于37°C培養，采用引物1-3所示的上游引物和下游引物進行PCR鑒定，將陽性結果的菌液提取質粒，將質粒P⑶NA3.1/His C-兔IgG用Xho I和Xba I雙酶切進行酶切鑒定，并最終進行序列分析質粒PCDNA3.1/His C-兔IgG將兔IgG的恒定區基因克隆至pCDNA3.1/His C中，構建得到pCDNA3.1/His C-兔IgG真核表達載體，并最終進行序列分析，終止密碼子在IgG標簽末端。
[0113]本實施例中同樣采用CAP蛋白作為目的蛋白。在上游引物和下游引物中分別引入BamH I和EcoR I酶切位點。以CAP基因為模板，擴增含有BamH I和EcoR I酶切位點的CAP基因片段，以BamH I和EcoR I雙本酶切CAP基因及pCDNA3.1/His C-兔IgG載體，并連接轉化到大腸桿菌DH5a中，提取質粒，酶切鑒定，測序，將最終構建完成的pCDNA3.1/HisC-CAP-兔IgG質粒轉染于293細胞中，48小時后收集細胞，用TBST (含有I %的Triton)裂解細胞，取20 μ l蛋白上樣loading buffer于95°C溫度上變性5分鐘后，進行SDS-PAGE電泳，轉膜后進行Western Blot檢測，用兔二抗反應1小時后，ECL顯色，可以清楚檢測到目的蛋白的表達。如圖5所示的采用兔二抗進行的Western Blot實驗圖中，可以看到有大小為55KD的蛋白表達帶，與本實驗中目的蛋白大小一致。
[0114]綜上所述，本發明提供了一種將含有檢測標簽IgG的表達載體應用于目的蛋白的表達檢測方法，該檢測過程基于IgG的恒定區基因與相應二抗的特異性結合來實現，不僅操作簡單而且具有較高的檢測靈敏度和檢測準確性。
【權利要求】
1.一種含有檢測標簽IgG的表達載體，其特征在于，所述檢測標簽IgG為至少一個種屬的IgG的恒定區基因；在表達載體中插入至少一個種屬的IgG的恒定區基因得到所述含有檢測標簽IgG的表達載體。
2.根據權利要求1所述的含有檢測標簽IgG的表達載體，其特征在于，所述至少一個種屬的IgG的恒定區基因包括人IgG的恒定區基因、兔IgG的恒定區基因、鼠IgG的恒定區基因、羊IgG的恒定區基因、馬IgG的恒定區基因、牛IgG的恒定區基因、豬IgG的恒定區基因、猴IgG的恒定區基因、雞IgG的恒定區基因、鴨IgG的恒定區基因、狗IgG的恒定區基因和熊貓IgG的恒定區基因。
3.含有檢測標簽IgG的表達載體的構建方法，其特征在于，所述檢測標簽IgG為至少一個種屬的IgG的恒定區基因；所述方法包括以下步驟: 51、設計所述至少一個種屬的IgG的恒定區基因的上游引物和下游引物； 52、以至少一個種屬的cDNA為模板，采用所述上游引物和下游引物進行PCR擴增，得到至少一個種屬的IgG的恒定區基因； 53、將所述至少一個種屬的IgG的恒定區基因與表達載體連接，構建成含有檢測標簽IgG的表達載體。
4.根據權利要求3所述的含有檢測標簽IgG的表達載體的構建方法，其特征在于，在所述步驟S3中，所述表達載體包括pET系列表達載體、GST系列表達載體、pTrxA系列表達載體、pCDNA3.1/His C系列表達載體、pCDNA5/FRT/T0系列表達載體、pEGFP-Nl系列表達載體和pBudce4.1系列表達載體。
5.含有檢測標簽IgG的表達載體在目的蛋白的表達檢測中的應用，其特征在于，所述檢測標簽IgG為至少一個種屬的IgG的恒定區基因；通過所述至少一個種屬的IgG的恒定區基因與所述至少一個種屬的二抗的直接反應實現所述目的蛋白的表達檢測。
6.根據權利要求5所述的含有檢測標簽IgG的表達載體的應用，其特征在于，包括以下步驟: 獲取至少一個種屬的IgG的恒定區基因； 構建含有至少一個種屬的IgG的恒定區基因的表達載體； 獲取目的蛋白基因，并將所述目的蛋白基因連接于含有至少一個種屬的IgG的恒定區基因的表達載體； 將連接有目的蛋白基因、且含有至少一個種屬的IgG的恒定區基因的表達載體轉染于表達菌株中進行誘導培養，收集表達產物；以及 采用所述至少一個種屬的二抗進行ECL顯色，以檢測所述目的蛋白的表達。
7.根據權利要求6所述的含有檢測標簽IgG的表達載體的應用，其特征在于，獲取至少一個種屬的IgG的恒定區基因包括: 設計所述至少一個種屬的IgG的恒定區基因的上游引物和下游引物； 以至少一個種屬的cDNA為模板，采用所述上游引物和下游引物進行PCR擴增，獲取至少一個種屬的IgG的恒定區基因。
8.根據權利要求6所 述的含有檢測標簽IgG的表達載體的應用，其特征在于，構建含有至少一個種屬的IgG的恒定區基因的表達載體包括: 同時雙酶切表達載體和至少一個種屬的IgG的恒定區基因；利用DNA電泳同時回收雙酶切產生的基因片段和載體片段；以及將所述載體片段和所述基因片段用連接酶進行連接反應，以構建含有至少一個種屬的IgG的恒定區基因的表達載體。
【文檔編號】C12N15/63GK103898136SQ201210587233
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月28日 優先權日:2012年12月28日
【發明者】易俊波, 蘇慶寧, 買制剛, 盧海蓉, 周兆平, 林楓 申請人:深圳大學