一種重組腸激酶的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明一種重組腸激酶的制備方法屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明提供了包含腸激酶基因的表達(dá)載體和工程菌，還提供了腸激酶的制備方法，包括培養(yǎng)工程菌、收獲工程菌菌體、破碎得包涵體、洗滌和溶解包涵體、復(fù)性、酶原活化及純化腸激酶的步驟。本發(fā)明的方法是重組腸激酶制備工藝成熟、質(zhì)量穩(wěn)定、純度高、成本低，適合藥用蛋白生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】一種重組腸激酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種重組腸激酶的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腸激酶(Enterokinase, EK)是存在于哺乳動(dòng)物十二指腸內(nèi)的一種異源二聚體絲氨酸蛋白酶(EC3.4.21.9)。天然腸激酶分子量為150kDa，由I條115kDa重鏈和I條35kD輕鏈組成，重鏈負(fù)責(zé)在消化道細(xì)胞膜上的錨定以及與腸激酶融合蛋白的結(jié)合，輕鏈具有催化活性，可以特異性識(shí)別Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并在其羧基端切割,將腸激酶融合蛋白活化為腸激酶，從而啟動(dòng)消化道內(nèi)各種酶原活化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
[0003]由于腸激酶識(shí)別位點(diǎn)的特異性和切割后在目標(biāo)蛋白N末端不留任何氨基酸殘基，而且可以在pH 4.5~9.5、溫度4~45°C范圍內(nèi)特異性水解蛋白底物，因此它已經(jīng)成為基因工程制藥領(lǐng)域融合蛋白切割的的首選工具酶，廣泛應(yīng)用于各種重組蛋白、多肽藥物的加工成熟。天然的腸激酶來(lái)源有限，需從動(dòng)物組織分離提取，因?yàn)閺膭?dòng)物組織提取的腸激酶易殘留其他的蛋白酶，對(duì)融合蛋白的產(chǎn)生降解；另外，來(lái)源于動(dòng)物組織的腸激酶可能帶有未知病毒等動(dòng)物源性污染，為藥物蛋白生產(chǎn)增加了額外的風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)基因工程的方法生產(chǎn)的腸激酶輕鏈，具有天然腸激酶的全酶活性和特異性，在融合蛋白切割中被廣泛應(yīng)用。已有報(bào)道的重組腸激酶輕鏈多為實(shí)驗(yàn)室級(jí)別，存在大量宿主蛋白殘留、鎳離子殘留和其他雜質(zhì)，而且作為原輔料進(jìn)行藥物蛋白生產(chǎn)時(shí)，其殘留不能被有效檢測(cè)和控制，對(duì)藥用蛋白的生產(chǎn)中增加許多風(fēng)險(xiǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種重組腸激酶的制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中重組腸激酶輕鏈多為實(shí)驗(yàn)室規(guī)模制備，存在大量宿主蛋白殘留、鎳離子殘留和其他雜質(zhì)的技術(shù)缺陷。
[0005]本發(fā)明的思路是這樣的:通過(guò)合成N端帶有腸激酶酶切位點(diǎn)的基因，連接到pET-32a(+)質(zhì)粒中硫氧還蛋白后,在大腸桿菌宿主細(xì)胞內(nèi)融合表達(dá),表達(dá)的融合蛋白經(jīng)外加少量腸激酶后，啟動(dòng)自切割，從而生產(chǎn)具有正確結(jié)構(gòu)的重組腸激酶輕鏈，分子量約為35KD，含有活性重組腸激酶(35KD)的溶液經(jīng)陰離子交換層析、陽(yáng)離子交換層析和疏水層析和冷凍干燥后，可得高純度、適合藥用蛋白生產(chǎn)的重組腸激酶產(chǎn)品。
[0006]發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量創(chuàng)造性勞動(dòng)或得了本發(fā)明。
[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是:提供一種包含腸激酶基因的表達(dá)載體。
[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是:提供一種包含腸激酶基因的工程菌。
[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是:提供一種重組腸激酶的制備方法。
[0010]因此，本發(fā)明的技術(shù)方案如下: [0011]1.一種包含腸激酶基因的表達(dá)載體，其特征在于腸激酶基因序列為Seq ID N0.1。
[0012]2.根據(jù)1的表達(dá)載體，其特征在于，腸激酶基因Seq ID N0.1插入質(zhì)粒pET_32a (+)的BglII和XhoI酶切位點(diǎn)之間。[0013]3.一種包含腸激酶基因的工程菌，其包含I或2所述的表達(dá)載體。
[0014]4.一種包含腸激酶基因的工程菌，其特征在于，由將2所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3而獲得。
[0015]5.一種重組腸激酶的制備方法，包括如下步驟:
[0016](I)培養(yǎng)3所述的包含腸激酶基因的工程菌并誘導(dǎo)腸激酶基因表達(dá)；
[0017](2)收集菌體；
[0018](3)破碎菌體；
[0019](4)收集包涵體，洗滌包涵體；
[0020](5)包涵體復(fù)性；
[0021](6)腸激酶原活化；和，
[0022](7)活性腸激酶的純化。
[0023]6.一種重組腸激酶的制備方法，包括如下步驟:
[0024](I)培養(yǎng)4所述的包含腸激酶基因的工程菌并誘導(dǎo)腸激酶基因表達(dá)；
[0025](2)收集菌體；
[0026](3)破碎菌體；
[0027](4)收集包涵體，洗滌包涵體；
[0028](5)包涵體復(fù)性；
[0029](6)腸激酶原活化；和，
[0030](7)活性腸激酶的純化。
[0031]7.根據(jù)5或6任一所述的重組腸激酶的制備方法，其特征在于:步驟(1)培養(yǎng)包含腸激酶基因的工程菌并誘導(dǎo)腸激酶基因表達(dá)，具體為:接種重組工程菌陽(yáng)性克隆到LB培養(yǎng)基中，于25-37°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按1-10%接種量接過(guò)夜菌于LB培養(yǎng)基中，37°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，按1-10%接種量接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速與通氣量以維持溶氧在35%以上，發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下:酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L,十二水合磷酸氫二鈉8g/L,磷酸二氫鉀4g/L,硫酸銨6g/L,七水硫酸鎂1.13g/L, 二水氯化鈣0.073g/L，補(bǔ)料培養(yǎng)基:酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于發(fā)酵過(guò)程中PH調(diào)控，當(dāng)培養(yǎng)基中養(yǎng)分耗盡，溶氧迅速上升時(shí)開(kāi)始補(bǔ)料，調(diào)節(jié)補(bǔ)料速度、轉(zhuǎn)速、通氣控制溶氧在30%以上，補(bǔ)料4h后，降溫至23°C，調(diào)節(jié)pH至7.0,加入終濃度為
0.1-0.5mmol/L的IPTG進(jìn)行有氧誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)6h放罐。
[0032]8.根據(jù)5或6任一所述的重組腸激酶的制備方法，其特征在于:步驟(1)培養(yǎng)包含腸激酶基因的工程菌并誘導(dǎo)腸激酶基因表達(dá)，具體為:接種重組工程菌陽(yáng)性克隆200 μ I到20ml的LB培養(yǎng)基中，于30°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按4%接種量接過(guò)夜菌于500ml的LB培養(yǎng)基中，37°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，接種到裝有6L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，初始參數(shù)為:發(fā)酵溫度37°C，攪拌速度200rpm，通氣量15L/min，pH為6.7，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速與通氣量以維持溶氧始終在35 %以上，發(fā)酵培養(yǎng)基如下:酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氫二鈉8g/L，磷酸二氫鉀4g/L，硫酸銨6g/L，七水硫酸鎂1.13g/L，二水氯化鈣0.073g/L，補(bǔ)料培養(yǎng)基:酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于發(fā)酵過(guò)程中pH調(diào)控；當(dāng)培養(yǎng)基中養(yǎng)分耗盡，溶氧迅速上升時(shí)開(kāi)始補(bǔ)料，通過(guò)控制泵的轉(zhuǎn)速合理控制補(bǔ)料速度，控制溶氧在30%以上，補(bǔ)料4h后，降溫至23°C，調(diào)節(jié)pH至7.0，加入終濃度為0.3mmol/L的IPTG進(jìn)行有氧誘導(dǎo)，控制溶氧不低于20 %，6h后出罐。
[0033]9.根據(jù)5或6任一所述的腸激酶的制備方法，其特征在于，步驟(3)破碎菌體的緩沖液為 25mmol/L Tris-HCl+5mmol/L EDTA, PH7.5。
[0034]10.根據(jù)5或6任一所述的腸激酶的制備方法，其特征在于，步驟⑷中洗滌包涵體的緩沖液為2mol/L尿素+1.5% Triton。
[0035]11.根據(jù)5或6任一所述的腸激酶的制備方法，其特征在于，步驟(5)包涵體復(fù)性的緩沖液為 0.2mol/L 尿素 +1OmmoI/LEDTA+25mmoI/L Tis-HCL, GSH: GSSG = ImmoI/L: 0.3mmol/L, PH10。
[0036]12.根據(jù)5或6任一所述的腸激酶的制備方法，其特征在于，步驟(6)腸激酶原活化的條件是經(jīng)腸激酶在室溫下酶解2-10小時(shí)，腸激酶/腸激酶原重量比為1/200。
[0037]13.根據(jù)5或6任一所述的腸激酶的制備方法，其特征在于，步驟(7)活性腸激酶的純化依次包括陰離子層析純化、陽(yáng)離子層析純化和疏水層析純化步驟。
[0038]所述的“收集菌體”的方法包括但不限于離心包括連續(xù)離心、過(guò)濾等。[0039]所述的“破碎菌體”的方法，包括但不限于高壓勻漿、滲透壓沖擊、凍融、超聲波破碎等。
[0040]所述的“收集包涵體”的方法，包括但不限于離心。
[0041]所述的“洗滌包涵體”的方法，包括但不限于包涵體用純化用書(shū)或者合適的緩沖液重懸、離心、再重懸離心等2~3個(gè)循環(huán)操作。
[0042]包涵體變性和復(fù)性的方法可以按照本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行。
[0043]本發(fā)明所說(shuō)的腸激酶融合蛋白基因是指與牛腸激酶輕鏈基因序列的一致的cDNA序列，通過(guò)檢索genebank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得其序列，Seq ID N0.1,其中1-6位為BglII酶切位點(diǎn)，734-739位為XhoI酶切位點(diǎn)。
[0044]重組腸激酶輕鏈的氨基酸序列，Seq ID N0.2。，經(jīng)腸激酶切除1_5位的DDDDK后，才變?yōu)橛谢钚缘哪c激酶輕鏈。
[0045]本發(fā)明所述的腸激酶原和腸激酶融合蛋白有同樣的含義，其需要進(jìn)一步經(jīng)過(guò)酶切活化后才有腸激酶活性。
[0046]優(yōu)選地,本發(fā)明腸激酶原(腸激酶融合蛋白)為Seq ID N0.2序列和硫氧還蛋白融合蛋白。
[0047]本發(fā)明的重組腸激酶的制備方法可大規(guī)模生產(chǎn)的腸激酶輕鏈，制備的腸激酶具有天然腸激酶的全酶活性和特異性，可被廣泛應(yīng)用融合蛋白切割中。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0048]圖1重組質(zhì)粒構(gòu)建與酶切驗(yàn)證圖。腸激酶(rEK)基因通過(guò)Bglll/Xhol酶切位點(diǎn)插入到質(zhì)粒 pET-32a(+) ；line I 為 pET_32a(+)rEK ;line 2 為 pET_32a(+)rEK 的 BglII 和XhoI酶切片斷；line 3為分子量標(biāo)準(zhǔn)(kb)。
[0049]圖2重組腸激酶工程菌基因測(cè)序圖譜。
[0050]圖3重組腸激酶工程菌生長(zhǎng)曲線圖。
[0051]圖4重組腸激酶工程菌表達(dá)，其中Linel為一級(jí)種子，Line2為二級(jí)種子，Line3為誘導(dǎo)前，Line4為出罐全菌。[0052]圖5重組腸激酶工程菌破碎后電泳圖，其中Linel為出罐全菌，Line2為破碎后上清，Line3為破碎后沉淀。
[0053]圖6腸激酶融合蛋白酶切圖，其中Linel為分子量標(biāo)準(zhǔn)，Line2為腸激酶原，Line3為腸激酶原酶切2Hr，Line4為腸激酶原酶切10Hr。
[0054]圖7腸激酶Q-FF純化洗脫峰。
[0055]圖8腸激酶Q-FF純化洗脫峰SDS-PAGE電泳，其中Linel為陰離子交換柱層析前，Line2為洗脫峰l，Line3為洗脫峰2，Line4為洗脫峰3，Line5為洗脫峰4，Line6為洗脫峰5。
[0056]圖9腸激酶Generic-SP純化洗脫圖。
[0057]圖10腸激酶Generic-SP純化電泳圖,其中其中Linel為陽(yáng)離子交換柱層析前，Line2為洗脫峰l，Line3為洗脫峰2，Line4為洗脫峰3，Line5為洗脫峰4，Line6為洗脫峰5。
[0058]圖11腸激酶Phenyl-FF純化洗脫圖。
[0059]圖12腸激酶Phenyl-FF純化后電泳圖，其中其中Linel為疏水柱層析前，Line2為洗脫峰1，Line3為洗脫峰2，Line4為洗脫峰3。
[0060]圖13重組牛腸激酶酶切反應(yīng)，其中Linel為分子量標(biāo)準(zhǔn)，Line2為底物Thioredoxin-NP-27 融合蛋 白，Line3 為 0.0008 單位 EK 反應(yīng)后，Line4 為 0.0015 單位 EK反應(yīng)后，Line5為0.003單位EK反應(yīng)后，Line6為0.008單位EK反應(yīng)后，Line7為0.015單位EK反應(yīng)后，Line8為0.03單位EK反應(yīng)后。
【具體實(shí)施方式】
[0061]以下結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，這些具體實(shí)施例均為說(shuō)明性的，不以任何方式限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0062]在以下具體實(shí)施例中，除有特別說(shuō)明的之外，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)手冊(cè)的教導(dǎo)或者試劑、設(shè)備提供商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行之。本領(lǐng)域的技術(shù)人員按照這些教導(dǎo)并結(jié)合本發(fā)明的公開(kāi)的內(nèi)容可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
[0063]實(shí)例I工程菌構(gòu)建
[0064]通過(guò)合成得到以上序列cDNA，通過(guò)Bglll/Xhol酶切位點(diǎn)插入到質(zhì)粒pET_32a(+)(購(gòu)自invitrogen)相應(yīng)酶切位點(diǎn)中，構(gòu)建成的重組質(zhì)粒構(gòu)建圖與酶切后電泳圖如圖1所示。插入腸激酶輕鏈基因的重組質(zhì)粒pET-32rEK通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到宿主大腸桿菌BL2KDE3)中，構(gòu)建重組腸激酶工程菌。經(jīng)測(cè)序(圖2)，工程菌中的序列與設(shè)計(jì)一致。
[0065]實(shí)例2:工程菌高密度發(fā)酵
[0066]重組工程菌發(fā)酵，接種重組工程菌陽(yáng)性克隆200 μ I到20ml的LB培養(yǎng)基中，于30°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按4%接種量接過(guò)夜菌于500ml的LB培養(yǎng)基中，37°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，接種到裝有6L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，初始參數(shù)為:發(fā)酵溫度37°C，攪拌速度200rpm,通氣量15L/min，pH為6.7，不斷提高攪拌轉(zhuǎn)速與通氣量(轉(zhuǎn)速最大900rpm，通氣量最大30L/min)以維持溶氧始終在35%以上，培養(yǎng)基配方如下:
[0067]發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氫二鈉8g/L，磷酸二氫鉀4g/L，硫酸銨6g/L，七水硫酸鎂1.13g/L，二水氯化鈣0.073g/L,補(bǔ)料培養(yǎng)基:酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于發(fā)酵過(guò)程中pH調(diào)控。
[0068]發(fā)酵數(shù)小時(shí)后，當(dāng)培養(yǎng)基中養(yǎng)分耗盡，溶氧迅速上升時(shí)開(kāi)始補(bǔ)料，通過(guò)控制泵的轉(zhuǎn)速合理控制補(bǔ)料速度，同時(shí)在補(bǔ)料速度、轉(zhuǎn)速、通氣三者的合理控制下，保證控制溶氧在30%以上。補(bǔ)料4h后，降溫至23°C，調(diào)節(jié)pH至7.0，加入終濃度為0.3mmol/L的IPTG進(jìn)行有氧誘導(dǎo)(即保證溶氧不低于20% )6h后出罐。
[0069] 出罐后離心得菌體濕重160g/L，發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)曲線及相關(guān)取樣點(diǎn)電泳如圖
3、圖4所示。
[0070]實(shí)例3腸激酶純化
[0071] 發(fā)酵結(jié)束離心收集的菌體按重量體積比1: 10加入破碎緩沖液(25mmol/LTris-HCl+5mmol/LEDTA, PH7.5)，高壓均質(zhì)機(jī)800bar破碎后收集沉淀和上清電泳如圖5。
[0072]將沉淀按重量體積比1: 10加入洗滌緩沖液(2mol/L尿素+1.5% Triton)，室溫磁力攪拌I小時(shí)，離心收集的沉淀用洗滌緩沖液洗滌兩次。再用包涵體溶解緩沖液(8mol/L尿素+10mmol/LEDTA+25mmol/L Tis-HCL, PH7.5)按重量體積比1: 10溶解過(guò)夜。溶解后的包涵體經(jīng)離心、超濾去除雜質(zhì)后，稀釋到蛋白濃度0.2mg/ml，在復(fù)性緩沖液(0.2mol/L尿素+10mmol/LEDTA+25mmol/L Tis-HCL, GSH: GSSG= lmmol/L: 0.3mmol/L，PH10)中，4°C復(fù)性過(guò)夜，復(fù)性后的腸激酶融合蛋白經(jīng)腸激酶(I: 200)在室溫下酶解2小時(shí)后即可得到具有活性的粗酶液(如圖4所示)。粗酶液分別經(jīng)陰離子層析(Q-FF)純化、陽(yáng)離子層析(Generic-SP)純化、疏水層析(Phenyl-FF)純化和冷凍干燥后，可獲得高純度重組腸激酶，分別見(jiàn)圖6、圖7、圖8、圖9、圖10、圖11和圖12所示。
[0073]實(shí)例3腸激酶活力測(cè)定方法
[0074]重組腸激酶的活力測(cè)定按每個(gè)反應(yīng)含有15 μ g的Thioredoxin_NP-27和不同活力單位的腸激酶。在25°C經(jīng)過(guò)16小時(shí)的反應(yīng)后用SDS-PAGE膠檢測(cè)酶切效果，如圖13所示。
[0075]活性單位定義:
[0076]在25°C，8小時(shí)內(nèi)將0.5毫克的Thioredoxin-NP-2795%降解為NP-27所需要的酶量定義為I個(gè)活性單位。
【權(quán)利要求】
1.一種包含腸激酶基因的表達(dá)載體，其特征在于腸激酶基因序列為Seq ID N0.1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的表達(dá)載體，其特征在于，腸激酶基因SeqID N0.1插入質(zhì)粒pET-32a(+)的BglII和XhoI酶切位點(diǎn)之間。
3.一種包含腸激酶基因的工程菌，其包含權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)載體。
4.一種包含腸激酶基因的工程菌，其特征在于，由將權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3而獲得。
5.一種重組腸激酶的制備方法，包括如下步驟: (1)培養(yǎng)權(quán)利要求3所述的包含腸激酶基因的工程菌并誘導(dǎo)腸激酶基因表達(dá)； (2)收集菌體； (3)破碎菌體； (4)收集包涵體，洗滌包涵體； (5)包涵體復(fù)性； (6)腸激酶原活化；和， (7)活性腸激酶的純化。
6.一種重組腸激酶的制備方法，包括如下步驟: (1)培養(yǎng)權(quán)利要求4所述的包含腸激酶基因的工程菌并誘導(dǎo)腸激酶基因表達(dá)； (2)收集菌體； (3)破碎菌體； (4)收集包涵體，洗滌包涵體； (5)包涵體復(fù)性； (6)腸激酶原活化；和， (7)活性腸激酶的純化。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6任一所述的重組腸激酶的制備方法，其特征在于:步驟(1)培養(yǎng)包含腸激酶基因的工程菌并誘導(dǎo)腸激酶基因表達(dá)，具體為:接種重組工程菌陽(yáng)性克隆到LB培養(yǎng)基中，于25-37°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按1-10%接種量接過(guò)夜菌于LB培養(yǎng)基中，.37°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，按1-10%接種量接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速與通氣量以維持溶氧在35%以上，發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下:酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氫二鈉8g/L，磷酸二氫鉀4g/L，硫酸銨6g/L，七水硫酸鎂1.13g/L，二水氯化鈣0.073g/L，補(bǔ)料培養(yǎng)基:酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于發(fā)酵過(guò)程中PH調(diào)控，當(dāng)培養(yǎng)基中養(yǎng)分耗盡，溶氧迅速上升時(shí)開(kāi)始補(bǔ)料，調(diào)節(jié)補(bǔ)料速度、轉(zhuǎn)速、通氣控制溶氧在30%以上，補(bǔ)料4h后，降溫至23°C，調(diào)節(jié)pH至7.0，加入終濃度為 .0.1-0.5mmol/L的IPTG進(jìn)行有氧誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)6h放罐。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6任一所述的重組腸激酶的制備方法，其特征在于:步驟(1)培養(yǎng)包含腸激酶基因的工程菌并誘導(dǎo)腸激酶基因表達(dá)，具體為:接種重組工程菌陽(yáng)性克隆 .200 μ I到20ml的LB培養(yǎng)基中，于30°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按4%接種量接過(guò)夜菌于 .500ml的LB培養(yǎng)基中，37°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，接種到裝有6L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，初始參數(shù)為:發(fā)酵溫度37°C，攪拌速度200rpm，通氣量15L/min，pH為6.7，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速與通氣量以維持溶氧始終在35%以上，發(fā)酵培養(yǎng)基如下:酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氫二鈉8g/L，磷酸二氫鉀4g/L，硫酸銨6g/L，七水硫酸鎂1.13g/L，二水氯化鈣0.073g/L，補(bǔ)料培養(yǎng)基:酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于發(fā)酵過(guò)程中PH調(diào)控；當(dāng)培養(yǎng)基中養(yǎng)分耗盡，溶氧迅速上升時(shí)開(kāi)始補(bǔ)料，通過(guò)控制泵的轉(zhuǎn)速合理控制補(bǔ)料速度，控制溶氧在30%以上，補(bǔ)料4h后，降溫至23°C，調(diào)節(jié)pH至7.0，加入終濃度為0.3mmol/L的IPTG進(jìn)行有氧誘導(dǎo)，控制溶氧不低于20%，6h后出罐。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6任一所述的腸激酶的制備方法，其特征在于，步驟(3)破碎菌體的緩沖液為 25mmol/L Tris-HCl+5mmol/L EDTA, PH7.5。
10.根據(jù)權(quán)利要求5或6任一所述的腸激酶的制備方法，其特征在于，步驟(4)中洗滌包涵體的緩沖液為2mol/L尿素+1.5% Triton。
11.根據(jù)權(quán)利要求5或6任一所述的腸激酶的制備方法，其特征在于，步驟(5)包涵體復(fù)性的緩沖液為 0.2mol/L 尿素+10mmol/LEDTA+25mmol/L Tis-HCL, GSH: GSSG=Immol/L: 0.3mmol/L, PH10。
12.根據(jù)權(quán)利要求5或6任一所述的腸激酶的制備方法，其特征在于，步驟(6)腸激酶原活化的條件是經(jīng)腸激酶在室溫下酶解2-10小時(shí)，腸激酶/腸激酶原重量比為1/200。
13.根據(jù)權(quán)利要求5或6任一所述的腸激酶的制備方法，其特征在于，步驟(7)活性腸激酶的純化依次 包括陰離子層析純化、陽(yáng)離子層析純化和疏水層析純化步驟。
【文檔編號(hào)】C12N15/57GK103898145SQ201210585576
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月31日
【發(fā)明者】文良柱, 梅麗, 朱亮 申請(qǐng)人:江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司, 上海復(fù)星醫(yī)藥（集團(tuán)）股份有限公司