本發明涉及核酸檢測領域，具體涉及微量樣品中核酸的檢測方法。

背景技術：

自PCR技術在上世紀八十年代問世以來，其在分子生物學相關領域的應用越來越廣泛。尤其是近年來，隨著人們對臨床診斷精度靈敏度要求的提高，以及個體化醫療概念的提出和推廣，PCR技術憑借其在臨床診斷中快速、敏感、特異等優點，已經迅速廣泛的應用到了臨床診療，通過檢測患者樣本中的基因，從而幫助醫生確定用藥和治療方案。

而樣本核酸提取是PCR技術運用的前提，人類外周血在人體內免疫反應及代謝中發揮著重要作用，可用于血液系統及其他眾多系統疾病的分子監測，由于其在臨床上取樣簡單易得，在臨床診斷或研究中應用最為廣泛。

目前全血核酸提取方法主要有苯酚-氯仿法、離心柱法、磁珠法。其中苯酚-氯仿法操作復雜且含有大毒性的有機溶劑已少有使用；離心柱法仍然是目前使用最廣泛的全血核酸提取方法，但其需要特殊的硅膠膜層析柱，且需要反復的離心清洗后才能洗脫獲得核酸；磁珠法采用磁珠吸附、清洗洗脫獲得核酸；這些方法操作過程中需要多次離心、換管、磁棒分離過程，操作復雜，提取時間較長，對操作要求較高，不利于臨床診療或研究應用。

專利CN201410010668.4公開了一種進行全血基因組快速擴增的方法，所述全血基因組快速擴增的方法是通過核酸釋放劑及與之相匹配的PCR反應液來實現的，主要步驟為，取5μl核酸釋放劑加入到PCR反應管中，然后取5μl血液與之混合，室溫靜止5-10分鐘，然后取40μl配置好的PCR反應液直接加入上述混合液中，最后上機擴增。該發明在核酸釋放劑的作用下，核酸能夠直接，快速的從血液中白細胞或細小細胞等有核細胞中釋放出來，同時，核酸釋放試劑又能夠導致血紅素和其他雜質蛋白變性，減少這些干擾物質對于后續PCR擴增的干擾,從而實現血液基因組快速PCR擴增檢測。

但該方法直接將全血中的核酸從細胞核中釋放出來，會引入血液中的病毒、細菌的核酸，并且不能完全清除血紅素和其他蛋白質，這些物質的存在會對后續PCR擴增產生干擾，影響PCR擴增的特異性。

技術實現要素：

本發明的一個目的是，解決現有技術中生物成分分離和檢測過程操作復雜，特異性不高的問題。

本發明的另一個目的是，實現分離和檢測過程自動化，高通量處理。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

根據本發明涉及的一方面，分離和檢測樣品中細胞或病毒內可能存在的生物成分的方法，包括：a.獲得復合捕獲體，所述復合捕獲體包含磁性核心和包被于所述磁性核心外的外殼，所述外殼與抗體偶聯，所述抗體對所述樣品中細胞或病毒上的特定表位具有特異性親和力；b.將所述樣品置于一容器中以及將所述樣品與所述復合捕獲體接觸；c.向所述容器施加磁場，使所述捕獲復合體吸附到所述容器內壁上，去除廢液；d.加入漂洗液對所述捕獲復合體進行洗滌，若所述生物成分存在，得到捕獲復合體-細胞結合物或捕獲復合體-病毒結合物，去除廢液；e.執行核酸擴增過程，對所述捕獲復合體-細胞結合物或捕獲復合體-病毒結合物中的核酸進行擴增或檢測，所述捕獲復合體對所述核酸擴增或檢測過程不產生抑制作用；.進行檢測結果判定。

進一步的，所述核酸擴增的方法選自聚合酶鏈式反應(PCR)、逆轉錄PCR、巢式PCR、多重PCR、半定量PCR、實時熒光定量PCR、原位PCR、連接酶鏈反應、隨機擴增多態性DNA、等溫擴增技術、重組PCR、錨定PCR、不對稱PCR、反向PCR或免疫PCR中的一種或多種。

進一步的，所述核酸等溫擴增技術選自鏈替代擴增技術、滾環擴增技術、依賴解旋酶核酸擴增、依賴核酸序列擴增、環介導等溫擴增、單引物等溫擴增技術、快速等溫檢測放大技術和Qβ復制技術中的一種或多種。。

根據本發明涉及的另一方面，將所述樣品置于所述容器中前將所述樣品與所述復合捕獲體接觸或將所述樣品置于所述容器中后將所述樣品與所述復合捕獲體接觸。

根據本發明涉及的另一方面，還包括在將所述樣品與所述復合捕獲體接觸前向所述樣品中加入緩沖液的步驟。

根據本發明涉及的另一方面，所述樣品選自淋巴液、淚液、汗液、尿液、唾液、全血、腦脊液、肺腔液、腹膜液、關節的液體、羊水、組織間隙液、組織培養液或細胞培養液中的一種或多種。

根據本發明涉及的另一方面，所述細胞選自人體細胞、動物細胞、植物細胞、細菌、真菌細胞或重組細胞中的一種或多種。

優選的，所述人體細胞選自腸道脫落細胞、上皮脫落細胞、吞噬細胞、白細胞、干細胞、神經細胞中的一種或多種。

根據本發明涉及的另一方面，所述抗體選自CD45特異性抗體、E.coli抗體、mAb RE-4D8、anti-M13抗體、甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體中的一種或多種。

根據本發明涉及的另一方面，核酸檢測方法包括：a.利用所述分離和檢測樣品中細胞或病毒內可能存在的生物成分的方法獲得結合在所述捕獲復合體上的細胞或病毒，所述細胞或病毒內含有核酸；b.執行PCR擴增及等溫擴增等其他擴增或者檢測方式，獲得所述細胞或病毒核酸擴增產物或檢測結果，所述捕獲復合體對PCR擴增、等溫擴增或者其他檢測方式不產生抑制作用；c.檢測或分析所述核酸擴增產物、等溫擴增產物等。

根據本發明涉及的另一方面，所述檢測結果判定的方法選自凝膠電泳、核酸測序、核酸分子雜交中的一種或多種，所述捕獲復合體對擴增和檢測無抑制作用。

根據本發明涉及的另一方面，分離樣品中細胞或病毒的裝置，包括：a.復合捕獲體，所述復合捕獲體包含磁性核心和包被于所述磁性核心外與抗體偶聯的外殼，所述抗體對所述樣品中細胞或病毒上的特定表位具有特異性親和力；b.使所述樣品與所述復合捕獲體接觸的裝置；c.磁場產生裝置。

根據本發明涉及的另一方面，分離和檢測樣品中細胞或病毒內核酸的裝置，包括：a.復合捕獲體，所述復合捕獲體包含磁性核心和包被于所述磁性核心外與抗體偶聯的外殼，所述抗體對所述樣品中細胞或病毒上的特定表位具有特異性親和力；b.使所述樣品與所述復合捕獲體接觸的裝置；c.磁場產生裝置；d.擴增所述樣品中細胞或病毒內的核酸的裝置；e.檢測所述樣品中細胞或病毒內的核酸的裝置及試劑。

根據本發明涉及的另一方面，所述分離和檢測樣品中細胞或病毒內核酸的裝置在核酸檢測中的應用。

相對于現有技術，本發明的有益效果在于：

所述復合捕獲體可以特異性結合靶細胞或病毒，而去除了樣品中的其他各種成分，最終所獲得的生物成分是唯一來源于靶細胞或病毒的所述生物成分；此外，在核酸檢測過程中，可以有效避免樣品中其他雜質對PCR擴增及核酸檢測的干擾。

進一步的，可以在不同規模的樣品中使用本發明涉及的方法和裝置，特別是少量和微量樣品，并且本發明涉及的方法和裝置易于自動化和微型化，可實現高通量基因檢測。

此外，只需要采集微量(1-5微升)的樣品即可進行核酸檢測，比如采集人全血樣品可以是成年人指尖血、嬰兒足跟血等，同時尤其適合于稀缺樣品的檢測，降低了核酸檢測對樣本采集的要求，減少了取樣的困難。

具體實施方式

為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

一方面，本發明涉及分離和檢測樣品中細胞或病毒內可能存在的生物成分的方法，包括：a.獲得復合捕獲體，所述復合捕獲體包含磁性核心和包被于所述磁性核心外與抗體偶聯的外殼，所述抗體對所述樣品中細胞或病毒上的特定表位具有特異性親和力；b.將所述樣品置于一容器中以及將所述樣品與所述復合捕獲體接觸；c.向所述容器施加磁場，使所述捕獲復合體吸附到所述容器內壁上，去除廢液；d.加入漂洗液對所述捕獲復合體進行洗滌，若所述生物成分存在，得到捕獲復合體-細胞結合物或捕獲復合體-病毒結合物，去除廢液；e.檢測可能結合在所述捕獲復合體上的細胞或病毒內的生物成分。其中，在b步驟中可以將所述樣品置于所述容器中前將所述樣品與所述復合捕獲體接觸，也可以將所述樣品置于所述容器中后將所述樣品與所述復合捕獲體接觸。其中，通過搖勻等方式使所述樣品與所述復合捕獲體充分接觸，使所述樣品與所述復合捕獲體更多的特異性結合。其中，在將所述樣品與所述復合捕獲體接觸前還包括向所述樣品中加入緩沖液的步驟。其中，以上步驟均在合適的溫度條件下進行，例如，在分離和檢測動物細胞特別是人類細胞時，保持溫度在30-40攝氏度。

另一方面，本發明實施例涉及微量樣品中核酸的檢測方法，包括：a.獲得復合捕獲體，所述復合捕獲體包含磁性核心和包被于所述磁性核心外與抗體偶聯的外殼，所述抗體對所述樣品中細胞或病毒上的特定表位具有特異性親和力；b.將所述樣品置于一容器中以及將所述樣品與所述復合捕獲體接觸；c.向所述容器施加磁場，使所述捕獲復合體吸附到所述容器內壁上，去除廢液；d.加入漂洗液對所述捕獲復合體進行洗滌，得到捕獲復合體-核酸結合物或捕獲復合體-病毒結合物，去除廢液；e.執行PCR擴增過程，對所述捕獲復合體-細胞結合物或捕獲復合體-病毒結合物中的核酸進行擴增或檢測，所述捕獲復合體對所述核酸擴增或檢測過程不產生抑制作用；f.進行檢測結果判定。

另一方面，本發明實施例涉及分離樣品中細胞或病毒的裝置，包括：a.復合捕獲體，所述復合捕獲體包含磁性核心和包被于所述磁性核心外與抗體偶聯的外殼，所述抗體對所述樣品中細胞或病毒上的特定表位具有特異性親和力；b.使所述樣品與所述復合捕獲體接觸的裝置，所述復合捕獲體與所述細胞或病毒結合為述復合捕獲體-細胞組合物或復合捕獲體-病毒組合物；c.磁場產生裝置，在所述樣品與所述復合捕獲體接觸的裝置中產生磁場力使所述復合捕獲體與其它不需要的組分分離。

進一步的，本發明實施例涉及分離和檢測樣品中細胞或病毒內核酸的裝置，包括：a.復合捕獲體，所述復合捕獲體包含磁性核心和包被于所述磁性核心外與抗體偶聯的外殼，所述抗體對所述樣品中細胞或病毒上的特定表位具有特異性親和力；b.使所述樣品與所述復合捕獲體接觸的裝置；c.磁場產生裝置；d.擴增所述樣品中細胞或病毒內的核酸的裝置；e.檢測所述樣品中細胞或病毒內的核酸的裝置。

本發明實施例涉及的方法和裝置可以用于動物細胞、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞或重組細胞，例如動物細胞中的肌肉細胞、神經細胞、上皮細胞、免疫細胞、白細胞等。本發明實施例的方法和裝置可以用于植物病毒、動物病毒、噬菌體。

本發明實施例涉及的方法和裝置檢測的樣品可以來源于植物、動物、培養液等，特別是液體樣品，例如來源于動物的樣品可以為動物的體液，如人的體液，包括血清、血漿、全血、痰、腦脊液、羊水、尿液、胃腸道內容物、骨髓液、唾液及汗液等，或組織培養液、細胞培養液、植物體液、細菌培養液、病毒培養液等。

本發明實施例涉及的方法和裝置可以用于檢測的細胞或病毒內的生物成分包括氨基酸、肽、蛋白質、脂質、單糖、寡糖、碳水化合物、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、核酸、維生素及其復合物。

本發明實施例涉及的復合捕獲體的磁性核心1包括選自順磁物質、鐵磁化物質和亞鐵磁化物質的可磁化物質，如四氧化三鐵；本發明實施例的方法和裝置涉及的捕獲復合體的外殼可以是合適的各種包被材料，抗體2結合在外殼3上，抗體2針對所要分離或檢測的細胞或病毒種類進行選擇，抗體2對所述樣品中細胞或病毒上的特定表位具有特異性親和力，優選能特異性識別細胞或病毒表面表達豐富的特異性抗原的抗體，例如針對人類白細胞選擇CD45特異性抗體。

所述漂洗液為現有技術中適宜的漂洗液，例如等滲的生理鹽水、PBS緩沖液等。

可以在不同規模的樣品中使用本發明實施例涉及的方法和裝置，特別是少量和微量樣品，并且本發明實施例涉及的方法和裝置易于自動化和微型化。

本發明實施例涉及的核酸檢測方法中，將PCR所需試劑(包含緩沖液、Taq聚合酶、dNTPs、引物、水等)加入捕獲復合體-核酸結合物或捕獲復合體-病毒結合物中，無需分離捕獲復合體和細胞或病毒，直接進入PCR程序，在低滲溶液及高溫作用下，細胞或病毒將裂解并釋放出核酸作為PCR的模板，捕獲復合體對PCR擴增不產生抑制作用。

本發明實施例涉及的核酸擴增和檢測步驟中，可以在PCR擴增后使用合適的方法直接對核酸進行檢測和分析，如凝膠電泳、核酸測序、核酸分子雜交等，也可以利用熒光定量PCR方法對所述細胞或病毒核酸進行擴增和檢測，所述捕獲復合體對所述擴增和檢測均無抑制作用。

實施例1.從人全血中分離白細胞以及檢測核酸

(1)將CD45特異性抗體偶聯到捕獲復合體外殼上；

(2)取3微升人指尖血樣置于容器中，37攝氏度下，加入100微升HEPES緩沖液(pH7.4)，加入捕獲復合體，搖晃，捕獲復合體特異性結合白細胞形成捕獲復合體-白細胞結合物，使用磁鐵在容器外壁吸附捕獲復合體到容器內壁上，去除廢液，加入漂洗液對捕獲復合體-白細胞結合物進行洗滌，去除廢液；

(3)將PCR所需試劑(包含緩沖液、Taq聚合酶、dNTPs、引物、水等)加入捕獲復合體-白細胞結合物中，直接進入熒光定量PCR程序，在低滲溶液及高溫作用下，白細胞將裂解并釋放出核酸作為PCR的模板，利用熒光定量PCR、ARMS-PCR,LAMP等方法對白細胞核酸進行擴增和檢測；

實施例2.從胸腺組織培養液中分離小鼠胸腺上皮細胞以及檢測核酸

(1)將mAb RE-4D8抗體偶聯到捕獲復合體外殼上；

(2)取3微升胸腺組織培養液樣品與捕獲復合體混合，置于容器中，加入100微升Tris-EDTA緩沖液(pH7.6)，將混合物用渦旋混合器輕輕攪拌15秒，在37攝氏度下靜置3分鐘，捕獲復合體特異性結合小鼠胸腺上皮細胞形成捕獲復合體-上皮細胞結合物，使用磁鐵在容器外壁吸附捕獲復合體到容器內壁上，去除廢液，加入PBS緩沖液(pH7.4)對捕獲復合體-上皮細胞結合物進行洗滌，去除廢液；

(3)將PCR所需試劑(包含緩沖液、Taq聚合酶、dNTPs、引物、水等)加入捕獲復合體-上皮細胞結合物中，直接進入PCR程序，在低滲溶液及高溫作用下，小鼠胸腺上皮細胞將裂解并釋放出核酸作為PCR的模板，得到小鼠胸腺上皮細胞核酸擴增產物；

(4)PCR結束之后，使用凝膠電泳對核酸擴增產物進行檢測和分析。

實施例3.從細菌培養液中分離M13噬菌體以及檢測核酸

(1)將anti-M13抗體偶聯到捕獲復合體外殼上；

(2)取100微升細菌培養液樣品置于容器中，用Hanks液將抗原稀釋至10μg/ml，加入捕獲復合體混合，將混合物用渦旋混合器輕輕攪拌15秒，在37攝氏度條件下孵育3分鐘，捕獲復合體特異性結合M13噬菌體形成捕獲復合體-噬菌體結合物，使用磁鐵在容器外壁吸附捕獲復合體到容器內壁上，去除廢液，加入PBS緩沖液(pH7.4)對捕獲復合體-噬菌體結合物進行洗滌，去除廢液；

(3)將PCR所需試劑(包含緩沖液、Taq聚合酶、dNTPs、引物、水等)加入捕獲復合體-噬菌體結合物中，直接進入PCR程序，在低滲溶液及高溫作用下，M13噬菌體將裂解并釋放出核酸作為PCR的模板，得到M13噬菌體核酸擴增產物；

(4)PCR結束之后，使用凝膠電泳對核酸擴增產物進行檢測和分析。

實施例4.檢測血漿中是否存在H5N1甲型流感病毒

(1)將純化后的甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體偶聯到捕獲復合體外殼上；

(2)取3微升血漿樣品置于容器中，加入100微升PBS緩沖液(pH6.8)，加入捕獲復合體混合，將混合物用渦旋混合器輕輕攪拌15秒，在37攝氏度條件下孵育30分鐘，若血漿中存在H5N1甲型流感病毒，則捕獲復合體特異性結合H5N1甲型流感病毒形成捕獲復合體-病毒結合物，使用磁鐵在容器外壁吸附捕獲復合體到容器內壁上，去除廢液，加入PBS緩沖液(pH6.8)對捕獲復合體-病毒結合物進行洗滌，去除廢液；

(3)將PCR所需試劑(包含緩沖液、Taq聚合酶、dNTPs、引物、水等)加入捕獲復合體-病毒結合物中，直接進入PCR程序，在低滲溶液及高溫作用下，若血漿中存在H5N1甲型流感病毒，則H5N1甲型流感病毒將裂解并釋放出核酸作為PCR的模板，得到H5N1甲型流感病毒核酸擴增產物；

(4)PCR結束之后，使用核酸分子雜交方法對核酸擴增產物進行檢測和分析。

上面對本發明的各種實施方式的描述以描述的目的提供給本領域技術人員。其不旨在是窮舉的、或者不旨在將本發明限制于單個公開的實施方式。如上所述，本發明的各種替代和變化對于上述技術所屬領域技術人員而言將是顯而易見的。因此，雖然已經具體討論了一些另選的實施方式，但是其它實施方式將是顯而易見的，或者本領域技術人員相對容易得出。本發明旨在包括在此已經討論過的本發明的所有替代、修改、和變化，以及落在上述申請的精神和范圍內的其它實施方式。

雖然通過實施方式描繪了本發明，本領域普通技術人員知道，本發明有許多變形和變化而不脫離本發明的精神，希望所附的權利要求包括這些變形和變化而不脫離本發明的精神。