專利名稱：大腸桿菌o157h7的免疫pcr基因檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種大腸桿菌0157:H7 (Escherichia coli 0157:H7)免疫PCR基因檢測試劑盒，屬于食源性致病菌檢測領域，專門針對食源性致病菌大腸桿菌0157:H7 (Escherichia coli 0157:H7)的檢測。本試劑盒適用于各種食品中大腸桿菌0157:H7的快速檢測。
背景技術：
食源性致病菌是全球性最嚴重的食品安全問題，2003 2004年的統計結果顯示，我國食物中毒致病因素依次為微生物性、化學性、有毒動植物性病原。微生物性病原是導致食物中毒的主要因素，中毒人數最多。食源性致病菌快速檢測一直是研究關注的焦點。腸出血性大腸埃希菌(EHEC)0157:H7 (Escherichia coli 0157:H7)引起的腸道感染性疾病已成為一個嚴重的全球性公共衛生問題，該病可引起腹瀉、出血性腸炎、繼發溶血性尿毒綜合癥(HUS)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)等。HUS和TTP的病情兇險，其中3% 5%的HUS病人死亡，約有12%的HUS病人有嚴重的后遺癥，危害十分嚴重。自1982年美國首次發現該病以來，在世界上許多國家相繼發生了暴發和流行，尤其1996年5 8月間日本發生了由大腸桿菌0157:H7引起的人類歷史上規模最大的一次暴發流行，累積患者近萬人，并有數人死亡，引起了世界的普遍關注。我國在1987年就發現由此菌引起的散在感染，近幾年已陸續有十多個省份在食品、家禽、家畜、昆蟲和腹瀉病患者中檢出該致病菌，存在著疫情暴發、流行的潛在威脅。目前檢測大腸桿菌0157:H7的傳統方法主要有生化反應和血清分型等。生化方法煩瑣、費時，并受諸多因素影響，容易漏檢自然變異株，以及不能檢測活的非可培養狀態的細菌。血清學方法·發展較快，靈敏度也較高，但只能做追溯性診斷或提供間接的診斷依據，不能進行快速鑒·定。因此，建立快速準確的診斷方法已成為臨床的迫切需求。免疫PCR(immuno polymerase chain reaction, IM-PCR)是一種檢測微量抗原的高靈敏度技術。該技術把抗原抗體反應的高特異性和聚合酶鏈反應的高敏感性有機結合起來，其本質是一種以PCR擴增一段DNA報告分子代替酶反應來放大抗原抗體結合率的一種改良型ELISA。免疫PCR是迄今最敏感的一種抗原檢測方法，理論上可以檢測單個抗原分子，但實踐中它的敏感性受許多因素的影響，如連接分子、顯示系統的選擇、DNA報告分子的濃度、PCR循環次數等。目前，國內外報道的免疫PCR的敏感性一般比現行的ELI SA法高IO2 IO8倍。本實用新型是一種大腸桿菌0157:H7免疫捕獲PCR檢測試劑盒，以此來快速檢測大腸桿菌0157:H7。

實用新型內容針對現有技術的不足，本實用新型的目的在于建立一種快速，準確的可進行快捷檢測食源性致病菌大腸桿菌0157:H7的檢測試劑盒。將致病菌免疫富集方法和基因水平檢測方法有效結合。先用特異性抗體將樣品中的病原菌特異性免疫富集，然后PCR擴增，不僅很大程度提高了檢測靈敏度，而且免疫結合然后PCR擴增，提高了檢測的特異性，大大提高了病原菌檢測的效率。本實用新型采取的技術方案是這樣的大腸桿菌0157:H7免疫捕捉PCR檢測試劑盒包括盒蓋(I)、盒體(2)、塑料底板(3)、第一試劑單元、第二試劑單元、自封袋(12);第一試劑單元是分子生物學試劑，EP管內分別裝的為10XPCR Buffer (4)、dNTP(5)、TaqDNA聚合酶(6)、ddH20雙蒸水(7)、正向引物(8)、反向引物(9);第二試劑單元試劑瓶內分別裝有的是陽性對照溶液(10)、陰性對照溶液(11);自封袋內裝有的是包被了大腸桿菌0157:H7單克隆抗體的檢測免疫PCR管；盒蓋和盒體相連接，第一試劑單元和第二試劑單元依次鑲嵌于塑料底板上，自封袋放置于塑料底板上，塑料底板放置于盒體內。。進一步，所述的分子生物學試劑中，10XPCR Buffer裝量為300 yL ;dNTP裝量為150 μ L ;TaqDNA聚合酶裝量為60 μ L ;正向引物裝量為150 μ L ;反向引物為裝量為150 μ L。進一步，所述的陽性對照溶液為滅活的大腸桿菌0157:Η7菌液，陰性對照溶液為滅菌的改良Ε.C新生霉素增菌肉湯。本實用新型的有益效果:大腸桿菌0157:Η7免疫捕獲PCR檢測試劑盒，是一種食源性致病菌檢測 試劑盒，屬于食源性致病菌檢測領域，適用于各種食品中大腸桿菌0157:Η7的快速檢測。該試劑盒集病原菌濃縮，特異性抗體識別，PCR擴增為一體，具有檢測結果準確性高、高靈敏度、檢測快速、使用方便等優點。適用于菌株快速鑒定、食品中毒源檢測等領域，尤其適用于樣品中微量病原的快速檢測。適用于質監部門，進出口檢疫部門等對食樣進行大腸桿菌0157:Η7菌的鑒定。大腸桿菌0157:Η7免疫捕獲PCR檢測試劑盒檢測準確性高，樣品中的大腸桿菌0157:Η7經過特異性抗體的識別，之后進行PCR擴增，致病菌經過免疫學、分子生物學兩種檢測技術的雙重檢測，確保了檢測的準確性，避免PCR檢測中的假陽性。具有高靈敏度，PCR管壁上的單克隆抗體捕捉并富集了樣品中的大腸桿菌0157:Η7，間接提高了模板量，大大提高了檢測靈敏度，經測試，該試劑盒對大腸桿菌0157:Η7的檢測靈敏度可以達到IO2Cfu/mL，因此特別適合樣品污染不嚴重，病菌較少的樣品。可一次鑒定到具體種，在單克隆抗體捕捉的病原后，通過PCR準確的將同屬不同種的大腸桿菌0157:H7—次檢測到種。避免雜菌干擾，管壁上的單克隆抗體只識別樣品中的大腸桿菌0157:H7，其它非目標菌抗體捕捉后的洗滌中被去除，因此大大降低了雜菌的干擾。無需提取DNA，目標菌損失小，全部實驗在同一 PCR管中完成，降低了常規PCR檢測中核酸提取過程中的病原損失。檢測快速，全部檢測可在4個小時完成。因此是一種快速、簡便、準確、高靈敏度的檢測大腸桿菌0157:H7的試劑盒。試劑盒檢測特異性驗證研究:該試劑盒對大腸桿菌0157:H7特異性進行檢測。特異性抗體識別，特異性引物rfbF和優化的PCR條件對目標菌進行了擴增，同時采用10類非目標菌檢測，結果顯示只有大腸桿菌0157:H7有目標條帶499bp的PCR產物，其它的10類非目標菌都無目標條帶出現，顯示了試劑盒的特異性。試劑盒檢測靈敏度驗證研究:本試劑盒對大腸桿菌0157:H7靈敏度進行檢測。大腸桿菌0157:H7純菌液直接PCR檢測最低檢出限為1.04X 105cfu/mL，而免疫捕獲PCR的最低檢出限為1.04X 102cfu/mL，對于純菌液，免疫捕獲PCR靈敏度是直接PCR靈敏度的1000倍，是ELISA檢測靈敏度的1000倍。本試劑盒在食樣檢測中靈敏度達到1.04X 103cfu/mL。[0014]依賴PCR的大腸桿菌0157:H7免疫捕獲檢測試劑盒，涉及了一種檢測高危險性食源性致病菌的分子技術，克服了現有檢測食源性致病菌檢測技術費時耗力，靈敏度低等的缺點。本實用新型的試劑盒能快速、準確、靈敏的從食品中直接檢測到病原菌。大大簡化了檢測程序，適用于質監部門，進出口檢疫部門等對食樣進行大腸桿菌0157:H7菌的鑒定。

圖1是本實用新型的結構示意圖圖2是大腸桿菌0157:H7免疫捕獲檢測試劑盒使用流程和原理具體實施方式
下面結合實施例和附圖對本實用新型做進一步詳細、完整地說明，所舉實例只用于解釋本實用新型，并非用于限定本實用新型的范圍。實施例1 一種大腸桿菌0157:H7免疫捕獲檢測試劑盒包括盒蓋(I)、盒體(2)、塑料底板(3)、第一試劑單元、第二試劑單元、自封袋
(12)。第一試劑單元是分子生物學試劑，EP管內分別裝的為10XPCR Buffer (4)、dNTP(5)、TaqDNA聚合酶(6)、ddH20雙蒸水(7)、正向引物(8)、反向引物(9);第二試劑單元試劑瓶內分別裝有的是陽性對照溶液(10)、陰性對照溶液(11);自封袋內裝有的是包被了大腸桿菌0157:H7單克隆抗體的檢測免疫PCR管。盒蓋和盒體相連接，第一試劑單元和第二試劑單元依次鑲嵌于塑料底板上，自封袋放置于塑料底板上，塑料底板放置于盒體內。所述的大腸桿菌0157:H7單克隆抗體的檢測免疫PCR管的具體包被方法為:①、用包被液稀 大腸桿菌0157:H7單克隆抗體至1: 300倍，抗體濃度為10 μ g/mL，將稀釋好的單克隆抗體每管50 μ L加入PCR管中，4°C過夜包被；②、包被緩沖液(Carbonate Coating buffer (I X))的配方為:無水碳酸鈉Na2CO3L 59g，碳酸氫鈉NaHC032.93g，疊氮化鈉NaN30.2g，溶于IOOOml蒸餾水中，調pH至9.6，4°C保存。實施例2梯度稀釋大腸桿菌0157:H7純菌液直接PCR研究實驗大腸桿菌0157:H7標準菌株培養18h后，然后用無菌生理鹽水依次10倍遞減稀釋，依次標記為10' 10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7，用10_5、10_6、10_7梯度的菌液進行平板菌落計數。菌落計數原始菌液濃度為1.04X 109cfu/mL,依次稀釋原菌液，菌液濃度梯度為:1.04X IO8 1.04X 10cfu/mL。取各個梯度的菌液各5 μ L加入PCR管中，然后加入本實用新型試劑盒內的4號試劑5 μ L，5號試劑2 μ L，8號試劑2 μ L，9號試劑2 μ L，6號試劑I μ L，7號試劑補足體積至50 μ Lo PCR的擴增條件為95°C 5min ；35個循環(95°C 15s ；55°C 30s ；72 °C lmin)，72°C 5min，4°C保存。取IOyL的PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳來檢測目標條帶并且凝膠成像分析。凝膠成像結果中，M泳道為IOOObp DNA ladder #泳道為陰性對照；1_8號泳道對應的細菌濃度為:1.04Χ108、1.04Χ107、1.04Χ106、1.04Χ105、1.04Χ104、1.04Χ103、1.04X ΙΟ2、1.04X10cfu/mL。泳道1_4號有特異性目標條帶出現，片段大小為499bp，亮度依次減弱。5-8泳道和陰性對照未有特異性條帶。結果顯示，大腸桿菌0157:H7純菌液直接PCR檢測的靈敏度為1.04X 105cfu/mL。[0026]實施例3梯度稀釋大腸桿菌0157:H7純菌液本試劑盒檢測IC-PCR研究實驗取梯度稀釋的大腸桿菌0157:H7菌液(1.04X108 1.04X 10cfu/mL)各200 μ L置于本試劑盒內的檢測PCR管中，放置于37°C孵育2h，然后用移液器小心吸去菌液，用PBST洗三次，在無菌濾紙上扣干殘液，然后在PCR管內加入本實用新型試劑盒內的4號試齊[J 5 μ L，5號試劑2 μ L，8號試劑2 μ L，9號試劑2 μ L，6號試劑I μ L，7號試劑補足體積至50 μ L15PCR 的擴增條件為 95°C 5min ;35 個循環(95°C 15s ；55°C 30s ；72°C lmin)，72°C 5min,4°C保存。取IOyL的PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳來檢測目標條帶并且凝膠成像分析。凝膠成像結果中，M泳道為IOOObp DNA ladder #泳道為陰性對照；1_8號泳道對應的細菌濃度為:1.04Χ108、1.04Χ107、1.04Χ106、1.04Χ105、1.04Χ104、1.04Χ103、1.04X ΙΟ2、1.04X10cfu/mL。泳道1_7號有特異性目標條帶出現，片段大小為499bp，亮度依次減弱。8泳道和陰性對照未有特異性條帶。結果顯示，大腸桿菌0157:H7免疫PCR檢測試劑盒檢測大腸桿菌0157:H7純菌液檢測限的靈敏度為1.04X 102cfu/mL。實施例4本試劑盒對大腸桿菌0157:H7和非大腸桿菌0157:H7特異性研究實驗，供試菌株有:大腸桿菌0157:H7ATCC82346,金黃色葡萄球菌ATCC27660，鼠氏傷寒沙門氏菌ATCC22956，腸炎沙門氏菌ATCC13076，單增李斯特菌ATCC43251，小腸結腸炎耶爾森氏菌ATCC23715，福氏志賀氏菌ATCC12022，宋內氏志賀氏菌ATCC25931，痢疾志賀氏菌ATCC51329，乙型溶血性鏈球菌ATCC10373，阪崎腸桿菌ATCC29004。各取供試菌株200 μ L加入本試劑盒的檢測PCR管中，放置于37°C孵育2h，然后用移液器小心吸去菌液，用PBST洗三次，在無菌濾紙上扣干殘液，然后在PCR管內加入本實用新型試劑盒內的4號試劑5 μ L，5號試劑2 μ L，8號試劑2 μ L，9號試劑2 μ L，6號試劑I μ L，7號試劑補足體積至50 μ L0 PCR的擴增條件為 95 0C 5min ；35 個循環(95 °C 15s ；55°C 30s ；72°C lmin), 72 °C 5min，4°C 保存。取IOyL的PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳來檢測目標條帶并且凝膠成像分析。 實施結果只有大腸0157菌的泳道出現目的條帶(499bp)，其他10株對照菌株均沒有目的條帶出現，說明該試劑盒有很好的特異性。實施例5梯度稀釋模擬帶菌大腸桿菌0157:H7直接PCR研究實驗按照國標GB/T4789.36-2008《食品衛生微生物學檢驗大腸埃希氏菌0157:H7/NM檢驗》，取食樣25g(mL)加入到225mL改良E.C新生霉素增菌肉湯m(EC) η中，在拍擊式均質器上均質2 3min，作為食品勻漿，然后對勻漿液人工污染不同濃度梯度的大腸桿菌0157:H7純菌液，人工污染的食品勻漿液中大腸桿菌0157:H7菌液濃度依次為:1.04X IO8 1.04X 102cfu/mL。取不同梯度的人工污染的食品勻漿液各5 μ L加入PCR管中，然后加入本實用新型試劑盒內的4號試劑5 μ L, 5號試劑2 μ L, 8號試劑2 μ L, 9號試劑2 μ L, 6號試劑I μ L，7號試劑補足體積至50 μ L0 PCR的擴增條件為95°C 5min ；35個循環(95°C 15s ；55°C 30s ；72°C lmin)，72°C 5min，4°C保存。取10 μ L的PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳來檢測目標條帶并且凝膠成像分析。研究結果得到食品樣本模擬帶菌大腸桿菌0157:Η7直接PCR的靈敏度可達到1.04X IO5 1.04Χ 106cfu/mL。實施例6梯度稀釋模擬帶菌大腸桿菌0157:H7本檢測試劑盒IC-PCR研究實驗按照國 標GB/T4789.36-2008《食品衛生微生物學檢驗大腸埃希氏菌0157:H7/NM檢驗》，取食樣25g(mL)加入到225mL生理鹽水中，在拍擊式均質器上均質2 3min,作為食品勻漿，然后對勻漿液人工污染不同濃度梯度的大腸桿菌0157:H7純菌液，人工污染的食品勻漿液中大腸桿菌0157:H7菌液濃度依次為:1.04X IO8 1.04X 102cfu/mL。取不同梯度的人工污染的食品勻漿液各200 μ L加入PCR管中，放置于37°C孵育2h，然后用移液器小心吸去菌液，用PBST洗三次，在無菌濾紙上扣干殘液，然后在PCR管內加入本實用新型試劑盒內的4號試劑5 μ L，5號試劑2 μ L，8號試劑2 μ L，9號試劑2 μ L，6號試劑I μ L，7號試劑補足體積至50 μ L0 PCR的擴增條件為950C 5min ；35個循環(95°C 15s ；55°C 30s ；72 °C lmin)，72°C 5min，4°C保存。取IOyL的PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳來檢測目標條帶并且凝膠成像分析。研究結果得到大腸桿菌0157:H7免疫捕捉PCR檢測試劑盒研究食品樣本模擬帶菌的靈敏度可達到1.04X IO3 1.04X 104cfu/mL。大腸桿菌0157:H7免疫捕獲PCR檢測試劑盒操作簡便，檢測快速，高靈敏度和高特異性，不需提取DNA。在實驗中人工污染食品樣本無需增菌直接進行檢測，檢測限可達到104cfu/mL，有的樣品達到103cfu/mL，靈敏度是直接PCR的10 100倍。本試劑盒能直接對樣品進行檢測，具有較大的推廣應用基礎。以上所敘述僅為本實用新型的較佳實施例，并不用以限制本實用新型，凡在本實用新型的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內 。
權利要求1.一種大腸桿菌0157:H7的免疫PCR基因檢測試劑盒，其特征在于包括盒蓋(I)、盒體(2)、塑料底板(3)、第一試劑單元、第二試劑單元、自封袋(12);第一試劑單元是分子生物學試劑，EP管內分別裝的為10XPCR Buffer (4)、dNTP (5)、TaqDNA聚合酶(6)、ddH20雙蒸水(7)、正向引物(8)、反向引物(9);第二試劑單元試劑瓶內分別裝有的是陽性對照溶液(10)、陰性對照溶液(11);自封袋內裝有的是包被了大腸桿菌0157:H7單克隆抗體的檢測免疫PCR管；盒蓋和盒體相連接，第一試劑單元和第二試劑單元依次鑲嵌于塑料底板上，自封袋放置于塑料底板上，塑料底板放置于盒體內。
2.根據權利要求1所述的大腸桿菌0157:H7的免疫PCR基因檢測試劑盒，其特征在于:所述的分子生物學試劑中，10XPCR Buffer裝量為300 μ L ；dNTP的裝量為150 μ L ；TaqDNA聚合酶裝量為60 μ L ;正向引物裝量為150 μ L ;反向引物裝量為150 μ L。
3.根據權利要求1所述的大腸桿菌0157:Η7的免疫PCR基因檢測試劑盒，其特征在于:所述的陽性對照溶液為滅活的大腸桿菌0157:Η7菌液，陰性對照溶液為滅菌的改良Ε.C新生霉素增菌肉 湯。
專利摘要本實用新型涉及一種大腸桿菌O157H7(Escherichia coli O157H7)的免疫PCR基因檢測試劑盒，屬于食源性致病菌檢測領域，適用于各種食品中大腸桿菌O157H7的快速檢測。檢測試劑盒包括盒蓋(1)、盒體(2)、塑料底板(3)、第一試劑單元、第二試劑單元、自封袋(12)。第一試劑單元是分子生物學試劑，EP管內分別裝的為10×PCR Buffer(4)、dNTP(5)、TaqDNA聚合酶(6)、ddH2O雙蒸水(7)、正向引物(8)、反向引物(9)；第二試劑單元試劑瓶內分別裝有的是陽性對照溶液(10)、陰性對照溶液(11)；自封袋內裝有的是包被了大腸桿菌O157H7單克隆抗體的檢測免疫PCR管。盒蓋和盒體相連接，第一試劑單元和第二試劑單元依次鑲嵌于塑料底板上，自封袋放置于塑料底板上，塑料底板放置于盒體內。本實用新型大腸桿菌O157H7免疫捕捉PCR檢測試劑盒結合了免疫和分子技術原理能快速、準確、靈敏的從食品中直接檢測到病原菌。
文檔編號C12Q1/68GK203144418SQ201220684769

公開日2013年8月21日 申請日期2012年12月11日 優先權日2012年12月11日
發明者劉箐, 陳艷 申請人:上海慧耘生物科技有限公司