專利名稱：一種真空酶解法制備蘇丹草原生質體的技術的制作方法
技術領域：
一種真空酶解法制備蘇丹草原生質體的技術屬于生物技術領域，更具體的說是一種利用細胞壁裂解酶在真空環境下裂解蘇丹草幼葉和莖的細胞壁從而制備大量原生質體的技術。
背景技術：
原生質體是指除去細胞壁的細胞或一個被質膜包圍的裸露細胞。大量制備原生質體是細胞組織培養和植物基因功能研究的重要基礎。蘇 丹草原生質體的制備方法目前尚無報道，蘇丹草原生質體的制備方法的建立有利于蘇丹草相關研究的進一步開展。
發明內容
本發明的目的是采用一種真空酶解的方法大量制備蘇丹草的原生質體，制備的原生質體可以用于蘇丹草的轉基因和基因功能等方面的研究。本發明是這樣實現的1. 一種真空酶解法制備蘇丹草原生質體的技術的特征在于，以蘇丹草嫩葉和莖為對象，利用細胞壁消化酶在真空環境下消化細胞壁釋放原生質體，它包括①蘇丹草幼苗準備，
②幼葉和莖的處理，③抽真空酶解，④原生質體解離，⑤過濾殘渣和⑥原生質體懸浮6個步驟。2.上述的6個步驟是這樣進行的
①蘇丹草幼苗準備選取飽滿的蘇丹草種子，種入營養缽，25°C培養8天。②幼葉和莖的處理剪取蘇丹草的幼葉和莖Ig左右，將幼葉和莖切成約1_長。③抽真空酶解將切好的幼葉和莖放入已加入IOmL酶解液的三角瓶中，真空環境(-0.1MPa )1小時，取出后用錫箔紙蓋好三角瓶口放入28°C搖床，轉速40rpm，酶解3小時。④原生質體解離倒掉酶解液，加入解離液10ml，28°C搖床，轉速為80rpm，解離I小時。⑤過濾殘渣用200目尼龍布過濾解離后的蘇丹草葉片殘渣，濾液轉入50mL離心管，90 G離心3分鐘。⑥原生質體懸浮倒掉上清液,加入300 μ L懸浮液，輕輕搖動離心管懸浮原生質體，即可得大量的原生質體細胞。
本發明的有益效果利用真空酶解法制備蘇丹草原生質體的技術可以快捷、大量地制備出蘇丹草的原生質體，而且本方法制備的原生質體細胞完整性好，細胞死亡少，方法簡便。
具體實施例方式 下面結合具體實例對真空酶解法制備蘇丹草原生質體的技術進行進一步的描述。
實施例1 :蘇丹草S722原生質體的制備1.蘇丹草幼苗準備選取飽滿的蘇丹草S722的種子，種入營養缽，25°C培養8天。2.幼葉和莖的處理剪取蘇丹草S722的幼葉和莖lg，用刀片將葉片切成約Imm長。3.抽真空酶解將切好的莖、葉放入已加入IOmL酶解液的三角瓶中，真空環境(-0.1MPa )1小時，取出后用錫箔紙蓋好三角瓶口放入28°C搖床，轉速40rpm，酶解3小時。(酶解液配方0. 645M甘露醇，IOmM氯化鉀，ImM氯化鈣，8mM 2-嗎啉乙磺酸，PH5. 5，1. 5%纖維素酶和O. 3%的離析酶R-1O)。4.原生質體解離倒掉酶解液，加入解離液10ml，28°C搖床，轉速為80rpm，解離I小時(解離液配方154mM氯化鈉，125mM氯化鈣，5mM氯化鉀，2mM 2-嗎啉乙磺酸，PH 5.7
)O O5.過濾殘渣用200目尼龍布過濾解離后的蘇丹草葉片殘渣，濾液轉入50mL離心 管，90 G離心3分鐘。6.原生質體懸浮倒掉上清液,加入300 μ L懸浮液，輕輕搖動離心管懸浮原生質體，即可得大量的原生質體細胞(懸浮液配方0. 6Μ甘露醇，15mM氯化I丐，4mM 2-嗎啉乙磺酸，PH5.7)。經檢測，通過以上步驟在得到的原生質體數量達到IO7個以上，且細胞完整性好，完全滿足實驗需求。
權利要求
1.一種真空酶解法制備蘇丹草原生質體的技術的特征在于，以蘇丹草嫩葉和莖為對象，利用細胞壁消化酶在真空環境下消化細胞壁釋放原生質體，它包括①蘇丹草幼苗準備，②幼葉和莖的處理，③抽真空酶解，④原生質體解離，⑤過濾殘渣和⑥原生質體懸浮6個步驟。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蘇丹草幼苗準備的做法是選取飽滿的蘇丹草種子，種入營養缽，25°C培養8天。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的幼葉和莖的處理的做法是剪取蘇丹草的幼葉和莖Ig左右，將葉片切成Imm長。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抽真空酶解的做法是將切好的莖、葉放入已加入IOmL酶解液的三角瓶中，置于-O.1MPa真空環境I小時，取出后用錫箔紙蓋好三角瓶口放入28°C搖床，轉速40rpm，酶解3小時。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的原生質體解離的做法是倒掉酶解液，加入解離液10ml, 28°C搖床,轉速為80rpm,解離I小時。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的過濾殘渣的做法是用200目尼龍布過濾解離后的蘇丹草葉片殘渣，濾液轉入50mL離心管，90 G離心3分鐘。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的原生質體懸浮的做法是倒掉上清液，加入300 μ L懸浮液，輕輕搖動離心管懸浮原生質體，即可得大量的原生質體細胞。
全文摘要
本發明公開了一種真空酶解法制備蘇丹草原生質體的技術，屬于生物技術領域。蘇丹草種子出苗后，將蘇丹草幼葉和莖切成一定大小，利用抽真空酶解的方法對幼葉和莖的細胞壁進行酶解，從而分離出大量蘇丹草原生制體的方法。利用本方法可以便捷、快速地制備出大量細胞完好的蘇丹草原生質體。
文檔編號C12N5/04GK103013905SQ20131001903
公開日2013年4月3日 申請日期2013年1月19日 優先權日2013年1月19日
發明者李杰勤, 王麗華, 詹秋文, 周青, 萬海波, 王茂輝 申請人:安徽科技學院