專利名稱：一種脂肪細(xì)胞中自噬的監(jiān)測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種脂肪細(xì)胞中自噬的監(jiān)測方法。
背景技術(shù)：
1962年，Ashford和Porten發(fā)現(xiàn)自噬現(xiàn)象。通過定向敲除自噬必需的基因，發(fā)現(xiàn)自噬作用在多方面發(fā)揮重要作用，如腫瘤抑制，神經(jīng)保護，紅細(xì)胞分化，另有報道，自噬涉及到生長發(fā)育、衰老、組織穩(wěn)態(tài)的控制。神經(jīng)變性、腫瘤、Huntington病、Parkinson病、肌病和心肌病等都涉及到自噬調(diào)節(jié)紊亂，自噬還誘導(dǎo)2型程序性死亡。隨著近十年來自噬領(lǐng)域研究的“爆炸式”的發(fā)展，吸引著不同專業(yè)背景的科學(xué)家從各個角度進入這一領(lǐng)域。最近研究發(fā)現(xiàn)，自噬在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和脂肪細(xì)胞的分化方面發(fā)揮重要作用。自噬在脂肪細(xì)胞功能中的作用研究雖然剛剛起步，目前代表性的文獻只有2-3篇，但已經(jīng)顯示出巨大的研究前景。同時，對成熟的脂肪細(xì)胞上自噬的調(diào)控機制的研究目前幾乎空白。因此，在脂肪細(xì)胞中建立一套成熟的監(jiān)測自噬的技術(shù)方法就具有重要意義。成熟脂肪細(xì)胞由于其特殊的結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)充滿大量脂滴，使細(xì)胞器和核向周邊移位，電鏡下難以看到典型的自噬體。但我們經(jīng)過多次實驗，不斷改進實驗條件，終于成功的在成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)觀察到處于各個自噬階段的自噬結(jié)構(gòu)。此外，由于成熟脂肪脂肪具有不易轉(zhuǎn)染的特點，普通的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染很難達到預(yù)期的效果。因此，我們利用GFP-LC3慢病毒方法感染3T3-L1脂肪細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察感染效率達到80%以上。在營養(yǎng)饑餓情況下，我們成功觀察到GFP-LC3點狀聚集現(xiàn)象。成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)自噬監(jiān)測方法的建立為我們以后研究自噬與脂代謝的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于在脂肪細(xì)胞中建立一套監(jiān)測自噬的技術(shù)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種脂肪細(xì)胞中自噬的監(jiān)測方法，包括以下步驟(I)培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化3T3-L1前脂肪細(xì)胞獲得成熟的脂肪細(xì)胞，用O. 2%BSA_DMEM孵育12h，裂解所獲得的脂肪細(xì)胞，抽提其蛋白質(zhì)；(2)采用BCA法對蛋白質(zhì)進行定量，計算所獲得的蛋白質(zhì)樣品的濃度，然后進行蛋白免疫印跡分析；(3)以小鼠的肝臟cDNA為模板，根據(jù)Genebank的小鼠LC3b基因編碼區(qū)設(shè)計引物，根據(jù)載體質(zhì)粒上的多克隆位點選擇LC3編碼區(qū)不含有的酶切位點加入到引物的上下游，上游引物的序列為CCGCTCGAGATGCCGTCCGAGAAGACC，酶切位點為Xho I ;下游引物的序列為CGCGGATCCCCCTGTCGTTACCGACACATT，酶切位點為 BamH I ;PCR 產(chǎn)物割膠回收，擴增出 LC3bDNA片段，取雙酶切后的的LC3片段和的p LVX-1RES-ZsGreenl進行T4DNA連接酶連接，培養(yǎng)產(chǎn)物，提取質(zhì)粒，取酶切驗證后的質(zhì)粒進行測序分析；
(4)用 PlVX-LC3-1RES-ZsGreenl 質(zhì)粒，delta8. 9 質(zhì)粒和 VSVG 轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，收集病毒上清，進行慢病毒滴度的測定；(5)病毒轉(zhuǎn)染成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞，共聚焦顯微鏡觀察及電鏡觀察自噬體。成熟脂肪細(xì)胞由于其特殊的結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)充滿大量脂滴，使細(xì)胞器和核向周邊移位，電鏡下難以看到典型的自噬體。但本發(fā)明經(jīng)過多次實驗，不斷改進實驗條件，終于成功的在成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)觀察到處于各個自噬階段的自噬結(jié)構(gòu)。此外，由于成熟脂肪具有不易轉(zhuǎn)染的特點，普通的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染很難達到預(yù)期的效果。因此，本發(fā)明利用GFP-LC3慢病毒方法感染3T3-L1脂肪細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察感染效率達到80%以上。在營養(yǎng)饑餓情況下，本發(fā)明成功觀察到GFP-LC3點狀聚集現(xiàn)象。成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)自噬監(jiān)測方法的建立為我們以后研究自噬與脂代謝的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
具體實施例方式實施例3T3-L1前脂肪細(xì)胞株的培養(yǎng)與傳代3T3-L1成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于正常高糖DMEM溶液中，置于37°C，5%C02孵箱，待顯微鏡下觀察細(xì)胞已貼壁，呈梭形、透亮，更換培養(yǎng)液至細(xì)胞至90%融合時進行傳代。將培養(yǎng)液從培養(yǎng)瓶中吸出，加入O. 25%胰酶4ml進行消化，顯微鏡下可見細(xì)胞由不規(guī)則的多角形或梭形收縮成圓形，該過程約需2min。加入正常培養(yǎng)液終止胰酶的反應(yīng)，用移液管反復(fù)吹打瓶壁上殘留的細(xì)胞，使細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶壁，吸入已裝有培養(yǎng)液的離心管中，IOOOrpm離心3min，沉淀細(xì)胞。離心后，棄去上清，再加入正常培養(yǎng)液，用移液管吹打，使細(xì)胞分散開。根據(jù)接種密度取部分含細(xì)胞的培養(yǎng)液接種于12孔板 或6孔板中，5%C02的培于養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)。3T3-L1前脂肪細(xì)胞株的誘導(dǎo)分化在細(xì)胞傳代后的隔天換正常培養(yǎng)液(體積分?jǐn)?shù)80%DMEM+20%胎牛血清)，繼續(xù)培養(yǎng)48h。待細(xì)胞融合后，加入誘導(dǎo)液A (正常高糖DMEM含O. 5mM IBMX, I μ M DEX,1. 7 μ M INS)開始誘導(dǎo)(第0天)，培養(yǎng)48h。第2天，撤去誘導(dǎo)液A，換以含1. 7 μ M胰島素的培養(yǎng)液(誘導(dǎo)液B)再培養(yǎng)48h。第4天，撤去誘導(dǎo)液B，以后均換以正常髙糖DMEM培養(yǎng)液，此時可見少數(shù)細(xì)胞形態(tài)呈圓形，并有少量脂滴出現(xiàn)。以后隔天換一次培養(yǎng)液。第8天可見90%以上細(xì)胞呈圓形并出現(xiàn)大量脂滴，即表示3T3-L1前脂肪細(xì)胞已誘導(dǎo)成功，成為成熟的脂肪細(xì)胞。將誘導(dǎo)好的脂肪細(xì)胞用O. 2%BSA-DMEM孵育12h，即可進行后續(xù)實驗。移去培養(yǎng)液，以冰冷的PBS洗3次，加入細(xì)胞裂解液，每ml裂解液加10 μ I磷酸酶抑制劑(4°c保存)，5μ I蛋白酶抑制劑(sigma產(chǎn)品，和-20°c保存)和PMSF (10yg/ml),冰上放置30min ;用細(xì)胞刮勺刮下細(xì)胞，移至離心管；視情況進行超聲裂解，頻率為5Hz，每次3s，間隔5s，勻漿3 6次；4°C，12000rpm離心15min，轉(zhuǎn)移至另一離心管，吸取上清液，上清液為細(xì)胞裂解液，即為所抽提的蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)定量配制濃度為0,0. 25mg/ml,O. 5mg/ml, lmg/ml,1. 5mg/ml, 2mg/ml 標(biāo)準(zhǔn)品 BSA ;配制測定試劑A和B的混合液，體積比A :B為50 :1 ;取96孔酶標(biāo)儀專用測定板，在待加測定樣品的孔中加去離子水22. 5μ 1，之后在每孔加入待測樣品2. 5μ I ;在設(shè)定待加標(biāo)準(zhǔn)品的孔中，分別加入25 μ I標(biāo)準(zhǔn)品；每孔加入，配好的A和B混合液160 μ I ;用錫箔紙封好酶標(biāo)板，在酶標(biāo)儀上用中等強度震蕩20秒；37°C水浴30分鐘；將酶標(biāo)板取出，冷卻至室溫，分光光度計540nm檢測吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品濃度；蛋白免疫印跡分析測定好濃度的各處理組蛋白樣本，用裂解液調(diào)至同濃度后，加入蛋白樣本上樣緩沖液4X loading buffer,混合均勻,99°C變性IOmin后,立即放入0°C的冰水浴中冷卻，即可上樣電泳或放入_20°C冰箱冷藏。SDS-聚丙烯酰胺凝膠的制備及灌膠分離膠分離膠按下表成分配好后，迅速攪拌勻，倒入裝置好的玻璃槽中約4/5高，上面輕輕地覆以無水乙醇隔離膠體與空氣，并使表面平整。待膠體凝結(jié)后，倒掉乙醇，并以超純水沖洗干凈。以無塵紙吸干表面水分。積層膠取配制好積層膠，迅速攪拌均勻后，倒入玻璃槽內(nèi)，插入樣品梳，注意不要產(chǎn)生氣泡。待膠體凝結(jié)，上樣前取出樣品梳。
ddH20 30%Acry-Bis Tris.HCl 10%SDS 10%APSTEMED~
12% 15ml 4,9ml(ml3.8ml (PH 150μΙ150μ1 μ
(分離膠)8.8)
(1.5mol/l) 10% 15ml^53M5^13.8ml (PH 150μ110^
C分離膠)8.8)`_(1.5mol/l)_
4%9ml 5.42ml 1.2ml2.25ml (PH 90μ145μ 9μ1
(積層·膠)6.8)
_(0.5mol/l)_分離范圍12%分離膠12-60KD ；10%分離膠20_80KDSDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDS-PAGE):把凝膠固定于電泳裝置上，上、下槽各加入IX電泳緩沖液；樣品離心，室溫冷卻，依次將樣品加到樣品孔底部；5μ I蛋白Marker直接上樣；積層膠電泳電壓用80V，待溴酚藍指示到分離膠和積層膠交界處時，分離膠改用100V，直至溴酚藍指示電泳至凝膠底部或稍長時間，一般電泳時間為1. 5-2小時；將凝膠放入去離子水中漂洗數(shù)秒；剪4張Whatman3mm濾紙和I張NC膜，其大小與凝膠大小完全吻合，將3_濾紙浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中5分鐘；塑料網(wǎng)孔支架置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，小心取下凝膠(可用膠片)將凝膠放入去離子水中漂洗數(shù)秒，在電極支架上放上浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中的海綿墊，其上放2張3mm濾紙,疊放整齊,趕凈氣泡，將凝膠放在3mm濾紙上,注意凝膠與濾紙之間不要有氣泡，再將NC膜準(zhǔn)確放在凝膠上，最后將2張3mm濾紙放在NC膜上面并確保各層精確對齊和沒有氣泡；將有膜的一面朝陽極安裝轉(zhuǎn)移裝置，接通電源，100V轉(zhuǎn)移約2小時；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取下膜，可以通過預(yù)染的彩色中分子量Marker判斷轉(zhuǎn)移效率標(biāo)記正反面；麗春紅染色將NC膜置麗春紅S中染色后，可見多條粉紅色蛋白條帶；用鉛筆標(biāo)記蛋白Marker的位置，然后用蒸餾水洗至膜發(fā)白(可在脫色搖床洗脫);將膜按需要剪下所需部分，放入含有5%脫脂奶粉的TBS封閉液中室溫平緩搖動2h，或4°C封閉過夜。(5%脫脂奶粉lg脫脂奶粉+lXTBS20ml)。免疫印跡
封閉后用PBS洗膜幾次，將封閉液洗掉；一抗按1:1000的比例配置，取5ml抗體稀釋液，加入5μ I —抗，將抗體倒入雜交瓶內(nèi)，將膜蛋白放入瓶中，蛋白面朝里，室溫雜交2h，或4°C雜交過夜；雜交瓶中取出膜蛋白，用PBST洗膜，加入洗膜液后，放在搖床上洗膜，每5min換一次液，共洗四次；按加一抗的方法，加入雜交瓶中二抗(GAPDG按1:20000配置)，室溫雜交Ih ;取出膜，在搖床上洗膜，5min換一次液，前三次用PBST，最后一次用PBS ;熒光檢測:取ECL Plus發(fā)光檢測試劑Solution A與Solution B按40:1比例混合,將經(jīng)過充分洗滌的膜有蛋白質(zhì)的一面向上，將檢測試劑加在有蛋白質(zhì)的一面，置入暗盒中，然后放置X光片。曝光時間根據(jù)目的條帶的強度與背景信號強弱而定，一般30秒；褪膜(stripping)如果待檢測的兩個蛋白質(zhì)的分子量相同或相近，需要stripping，將NC膜上的一抗和二抗等褪去，然后再與另外的抗體雜交；用TBST洗膜15分鐘2次；將膜浸泡于洗脫液(strippingbuffer)中50°C lOmin，洗去雜交條帶；用TBST洗膜15分鐘2次；室溫封閉I小時，其余與上同，Stripping 一次蛋白會損失20-50%,所以盡量減少stripping次數(shù)；GFP-LC3慢病毒的構(gòu)建以小鼠的肝臟cDNA為模板，根據(jù)Genebank的小鼠LC3b基因(NM_025735. 2)編碼區(qū)設(shè)計引物。根據(jù)載體質(zhì)粒上的多克隆位點(multiplecloningsite，MCS)選擇LC3編碼區(qū)不含有的酶切位點加入到引物的上下游。上游引物的序列為CCGCTCGAGATGCCGTCCGAGAAGACC,酶切位點為Xho I ;下游引物的序列為CGCGGATCCCCCTGTCGTTACCGACACATT，酶切位點為BamH I。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像儀觀察條帶大小，保存圖像，然后PCR產(chǎn)物割膠回收。以小鼠cDNA為模板經(jīng)PCR反應(yīng)擴增出LC3b DNA片段，后者和載體pLVX-1RES-ZsGreenl經(jīng)Xho I和BamH I限制酶37°C酶切4h后，分別取雙酶切后的6ul的LC3片段和2ul的pLVX-1RES-ZsGreenl進行T4DNA連接酶4°C連接過夜(或16°C，3h)。將連接產(chǎn)物IOul轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a，冰上放置30min后，42°C水浴90s，后加入900ul LB培養(yǎng)基，150r/min, 37°C搖床搖菌。將菌液12000r/min離心，Imin后均勻涂到Amp抗性的瓊脂培養(yǎng)基上，待液體吸 收后倒置培養(yǎng)皿，370C，過夜。挑單一菌落搖菌14-16小時，小量抽提質(zhì)粒。經(jīng)Xho I和BamH I雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，取酶切驗證后的質(zhì)粒進行測序分析。將293T細(xì)胞鋪板于IOcm培養(yǎng)皿，24h內(nèi)轉(zhuǎn)染病毒的三種質(zhì)粒，細(xì)胞密度在80%左右。15ug PlVX-LC3-1RES-ZsGreenl 質(zhì)粒，delta8. 9 質(zhì)粒和 6ug VSVG 將 9ug 質(zhì)粒加入到1.5ml Opt1-MEM 減血清培養(yǎng)基；同時將 18ul Lipofectamine2000 加入到1. 5ml Opt1-MEM減血清培養(yǎng)基，然后將兩者混合靜置20min后滴入細(xì)胞培養(yǎng)皿。分別在轉(zhuǎn)染后的24h、48h收集病毒上清，1000r/min,離心3min去除死細(xì)胞，后經(jīng)0. 45um濾器過濾。將病毒上清置于超速離心管內(nèi)，4°C，25000Xg超速離心120min。10%FBS重懸病毒沉淀，4°C冰箱保存。同時，轉(zhuǎn)染空載pLVX-1RES-ZsGreenl，VSVG和delta8. 9至293T細(xì)胞，收集病毒濃縮后做陰性對照。慢病毒滴度的測定，按照上海市吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司的操作手冊進行滴度測定前一天，293T細(xì)胞接種96孔板，每孔5 X 103個細(xì)胞；準(zhǔn)備8個無菌的EP管，每管內(nèi)加入90ul新鮮完全培養(yǎng)液(11995DMEM+10%FBS);將待測的病毒液Ilul加入到第一個EP管,混勻，吸取Ilul加到第二個EP管內(nèi)。依次操作,加到最后一管為止；吸取各管稀釋后的病毒液90ul,加到96孔板,第一管病毒液為9. 9ul,記為101第二管記為100,依次類推，第8管為10-6 ；96孔板37°C，5%C02培養(yǎng)48小時，然后加入新鮮培養(yǎng)液IOOul繼續(xù)培養(yǎng)24小時，再更換正常培養(yǎng)液150ul ;96小時后觀察各孔熒光。隨病毒稀釋倍數(shù)增加，熒光細(xì)胞數(shù)減少。計數(shù)最后兩個孔的熒光細(xì)胞數(shù)。用得到的細(xì)胞數(shù)除以相應(yīng)的病毒稀釋倍數(shù)即為病毒原液的滴度值。將293T細(xì)胞鋪板于IOcm培養(yǎng)皿，24h內(nèi)轉(zhuǎn)染病毒的三種質(zhì)粒，細(xì)胞密度在80%左右。15ug PlVX-LC3-1RES-ZsGreenl 質(zhì)粒，delta8. 9 質(zhì)粒和 6ug VSVG 將 9ug 質(zhì)粒加入到1.5ml Opt1-MEM 減血清培養(yǎng)基；同時將 18ul Lipofectamine2000 加入到1. 5ml Opt1-MEM減血清培養(yǎng)基，然后將兩者混合靜置20min后滴入細(xì)胞培養(yǎng)皿。分別在轉(zhuǎn)染后的24h、48h收集病毒上清，1000r/min,離心3min去除死細(xì)胞，后經(jīng)O. 45um濾器過濾。將病毒上清置于超速離心管內(nèi)，4°C，25000Xg超速離心120min。10%FBS重懸病毒沉淀，4°C冰箱保存。同時，轉(zhuǎn)染空載pLVX-1RES-ZsGreenl，VSVG和delta8. 9至293T細(xì)胞，收集病毒濃縮后做陰性對照。病毒轉(zhuǎn)染及共聚焦顯微鏡觀察將病毒濃縮液加入誘導(dǎo)分化第五天的成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞，M0I=50,同時加入Polybrene(終濃度為8mg/L)。病毒作用48h后，換正常培養(yǎng)液，加藥處理前用O. 2%BSA_DMEM孵育12h。從病毒加入細(xì)胞開始，到共聚焦顯微鏡下觀察前共作用96h。如果共聚焦顯微鏡下觀察，病毒感染效率不高，其間可再加一次病毒濃縮液。

電鏡觀察自噬體將細(xì)胞接種到75mm細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，誘導(dǎo)分化，到誘導(dǎo)分化第5天，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)小的脂滴，開始進行各種處理。藥物作用所需時間后，用37°C溫PBS輕輕洗細(xì)胞3次，然后加入2%戊二醛固定液固定，送電鏡室觀察。自噬的一個特點是它的動態(tài)調(diào)節(jié)，基礎(chǔ)狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)自噬處于低水平，但在各種激動劑刺激下其活性可明顯增加。在培養(yǎng)的細(xì)胞或活組織內(nèi)，最常見的誘導(dǎo)自噬的方法是營養(yǎng)剝奪。此外，其他的刺激也會引起自噬，如應(yīng)激、激素刺激、藥物刺激(雷帕霉素等)等。自噬在某些疾病中也可以被抑制，如腫瘤、神經(jīng)變性疾病、感染性疾病等。既然自噬與多種病例生理過程密切相關(guān)，建立一套科學(xué)的監(jiān)測自噬的方法就顯得尤為重要。自噬現(xiàn)象首先是通過電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)的。自噬是一個動態(tài)和連續(xù)的過程，先形成自噬小體，后與溶酶體融合，逐漸降解胞內(nèi)成分。在超微結(jié)構(gòu)，自噬小體被定義為；含有未被消化的細(xì)胞質(zhì)成分的雙膜結(jié)構(gòu)，且未與溶酶體結(jié)合。雙膜結(jié)構(gòu)包裹的細(xì)胞質(zhì)成分包括線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片等，由于這一階段自噬體的結(jié)構(gòu)特點明顯，很容易通過電鏡觀察鑒定自噬體的存在。與自噬小體相比，自噬溶酶體的觀察相對難一些。自噬溶酶體是由自噬小體和溶酶體形成的混合細(xì)胞器，它由不完整的雙膜結(jié)構(gòu)，其內(nèi)包裹著處于不同降解階段的細(xì)胞質(zhì)成分。早期可以觀察到細(xì)胞器成分，但在降解晚期就很難辨別自噬溶酶體內(nèi)的成分了。因此，降解晚期很難區(qū)分自噬溶酶體和內(nèi)吞作用形成的小囊泡或其他來源的液泡。即使這樣，在大多數(shù)病理和生理情況下，我們?nèi)匀豢梢酝ㄟ^檢測早期和晚期自噬體結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生來反應(yīng)整個細(xì)胞所處的自噬狀態(tài)。成熟脂肪細(xì)胞由于其特殊的結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)充滿大量脂滴，使細(xì)胞器和核向周邊移位，電鏡下難以看到典型的自噬體。但我們經(jīng)過多次實驗，不斷改進實驗條件，終于成功的在成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)觀察到處于各個自噬階段的自噬結(jié)構(gòu)，為以后的研究提供了監(jiān)測自噬的 方法。
權(quán)利要求
1.一種脂肪細(xì)胞中自噬的監(jiān)測方法，其特征在于，包括以下步驟 (O培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化3T3-L1前脂肪細(xì)胞獲得成熟的脂肪細(xì)胞，用O. 2%BSA-DMEM孵育12h，裂解所獲得的脂肪細(xì)胞，抽提其蛋白質(zhì)； (2)采用BCA法對蛋白質(zhì)進行定量，計算所獲得的蛋白質(zhì)樣品的濃度，然后進行蛋白免疫印跡分析； (3)以小鼠的肝臟cDNA為模板，根據(jù)Genebank的小鼠LC3b基因編碼區(qū)設(shè)計引物，根據(jù)載體質(zhì)粒上的多克隆位點選擇LC3編碼區(qū)不含有的酶切位點加入到引物的上下游，上游引物的序列為CCGCTCGAGATGCCGTCCGAGAAGACC，酶切位點為Xho I ;下游引物的序列為CGCGGATCCCCCTGTCGTTACCGACACATT，酶切位點為 BamH I ; PCR 產(chǎn)物割膠回收，擴增出 LC3bDNA片段，取雙酶切后的的LC3片段和的pLVX-1RES-ZsGreenl進行T4DNA連接酶連接，培養(yǎng)產(chǎn)物，提取質(zhì)粒，取酶切驗證后的質(zhì)粒進行測序分析； (4)用PlVX-LC3-1RES-ZsGreenl 質(zhì)粒，delta8. 9 質(zhì)粒和 VSVG 轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，收集病毒上清，進行慢病毒滴度的測定； (5)病毒轉(zhuǎn)染成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞，共聚焦顯微鏡觀察及電鏡觀察自噬體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種脂肪細(xì)胞中自噬的監(jiān)測方法，成熟脂肪細(xì)胞由于其特殊的結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)充滿大量脂滴，使細(xì)胞器和核向周邊移位，電鏡下難以看到典型的自噬體。但本發(fā)明經(jīng)過多次實驗，不斷改進實驗條件，終于成功的在成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)觀察到處于各個自噬階段的自噬結(jié)構(gòu)。此外，由于成熟脂肪具有不易轉(zhuǎn)染的特點，普通的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染很難達到預(yù)期的效果。因此，本發(fā)明利用GFP-LC3慢病毒方法感染3T3-L1脂肪細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察感染效率達到80%以上。在營養(yǎng)饑餓情況下，本發(fā)明成功觀察到GFP-LC3點狀聚集現(xiàn)象。成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)自噬監(jiān)測方法的建立為我們以后研究自噬與脂代謝的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/02GK103060421SQ20131002376
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月22日
發(fā)明者寧光, 鄧玉杰, 楊穎 , 張志國 申請人:上海市內(nèi)分泌代謝病研究所