專利名稱：一種重組豬干擾素α1及其編碼基因和表達方法
技術領域：
本發明屬于生物工程基因領域，涉及一種重組豬干擾素α I及其編碼基因，以及其表達、純化和包涵體復性方法。
背景技術：
干擾素(Interferon, IFN)是一組具有多種功能的活性蛋白質(主要是糖蛋白)，是一種由單核細胞和淋巴細胞產生的細胞因子。它們在同種細胞上具有廣譜的抗病毒、影響細胞生長，以及分化、調節免疫功能等多種生物活性。根據IFN的來源即動物種類、細胞類型、誘生劑的性質和誘生條件不同，可分為α、β、Y三種。其中IFN-α是免疫細胞通過抗病毒應答反應而產生的一組結構類似、功能接近的低分子糖蛋白。在眾多亞型中，干擾素α I是最常見的一類，它具有顯著的抗病毒、抗腫瘤、抑制造血細胞增殖和免疫調節等功能，適用于病毒感染性疾病(如肝炎)、骨髓增生性疾病、淋巴細胞系腫瘤及其它腫瘤等疾病的治療。我國是養豬大國，豬病毒性傳染病種類多、危害大，雖然目前我國普遍接種豬病疫苗，但仍然不能很好的控制疫病。基因工程重組豬干擾素具有廣泛的抗病毒效應，并且具有無副作用、無藥物殘留等優點，在獸藥領域具有廣泛的應用前景。文獻報道豬干擾素α I在抑制口蹄疫病毒活力方面具有明顯的作用，但是天然的豬干擾素α I在機體內表達甚微，很難直接從體內大量提取供臨床研究及應用。因此本發明通過基因工程手段提供了一種成本低廉且可以大量表達重組豬干擾素α I表達系統和表達方法。原核表達系統是最早被采用進行研究的，也是目前掌握最為成熟的表達系統。其優點在于能夠在較短時間內獲得基因表達產物，而且所需的成本相對比較低廉。但是，原核表達系統還存在許多難以克服的缺點例如無法對表達時間及表達水平進行調控、外源蛋白的表達對宿主細胞毒性作 用、產物純化困難等；除此之外，由于原核表達系統翻譯后加工修飾體系不完善，產物多以生物活性較低包涵體的形式產生。而包涵體的復性是一個非常復雜的過程，不僅與蛋白質復性的過程控制密切相關，還很大程度上取決于目的蛋白的自身性質。如果復性條件不適宜將會出現分子內二硫鍵的錯配，分子間共價結合或疏水結合形成聚合體，降低重組蛋白的比活率，造成產品質量不合格，同時又易產生沉淀析出，影響得率。因此，本發明所要解決的另一個技術問題是使大腸桿菌表達的豬干擾素包涵體復性為具有生物活性的細胞因子。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足之處，通過密碼子優化的方式，提供一種可在大腸桿菌內高效表達重組豬干擾素α I以及其基因和表達、純化、復性方法。本發明提供了一種重組豬干擾素α 1，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發明提供了編碼上述所述重組豬干擾素α I的基因，其堿基序列如SEQ ID NO I所示。該序列是專為大腸桿菌表達系統進行密碼子優化得到的序列，相比之下能顯著提高異源基因在宿主菌中的表達效率。本發明還提供了包含了上述所述編碼重組豬干擾素α I的基因的載體，所述的載體優選為原核表達質粒，最優選為pET21b。本發明還提供了包含有上述所述載體的大腸桿菌菌株，優選地，所述菌株選自大腸桿菌BL21 (DE3)菌株。本發明還提供了重組豬干擾素α I在大腸桿菌表達方法，包括如下步驟該方法的步驟為1.挑取一個含有上述所述重組豬干擾素α I的大腸桿菌菌落，接入LB培養液，培養過夜；2.取過夜培養物接入于LB培養液中，震蕩培養至對數中期(A_=l. O)；3.在培養物中加入O. 5-lmmol/L的IPTG，于37°C，誘導表達l_4h后，離心處理收集含有重組豬干擾素α I的大腸桿菌菌體沉淀。所述LB培養液中均含有氨芐青霉素50-100 μ g/mL。本發明還提供了重組豬干擾素α I的包涵體純化方法，包括如下步驟1.將收集得到的上述含有誘導重組豬干擾素α I大腸桿菌菌體沉淀，用預冷的PBS重懸，并于4°C高速離心處理；重復一次。2.吸去上清，稱菌體沉淀重量，每克(菌體濕重)加入裂解緩沖液BufTerA3-10ml，用磨光玻璃棒攪動，使菌體懸起。

3.每克(菌體濕重)菌體加入3-10 μ L濃度為100mmol/L的PMSF，3-100 μ L濃度為lOOmg/mL的溶菌酶，于冰上攪動。4.破碎菌體，樣品置于冰上，超聲，并于4°C高速離心處理，棄上清。5.沉淀用洗滌緩沖液Buffer B洗滌，并于4°C高速離心處理，沉淀包涵體，重復一次。6.包涵體沉淀用變性緩沖液Buffer C溶解，室溫下攪拌30_60min。7.充分混勻后室溫高速離心處理，棄沉淀，取上清，即得到重組豬干擾素α I變性溶液。該純化方法優選步驟如下1.將收集得到的上述含有誘導重組豬干擾素α I大腸桿菌菌體沉淀，用預冷的PBS重懸,于4°C,以12000rpm/min的轉速離心15min ;重復一次。2.吸去上清，稱菌體沉淀重量，每克(菌體濕重)加入裂解緩沖液BufferA5mL，用磨光玻璃棒攪動，使菌體懸起。3.每克(菌體濕重)菌體加入5 μ L濃度為100mmol/L的PMSF，5 μ L濃度為IOOmg/HiL的溶菌酶，冰上攪動20min。4.用探針型超聲波儀破碎菌體，樣品置于冰上，超聲120次，每次5s間隔5s，循環三次，每次循環至冷卻樣品之間等待2min,等待樣品冷卻。于4°C ,以12000rpm/min的轉速離心15min,棄上清。5.沉淀用洗漆緩沖液Buffer B洗漆,于4°C,以12000rpm/min的轉速離心15min,
沉淀包涵體，重復一次。6.包涵體沉淀用變性緩沖液Buffer C溶解,室溫下攪拌30_60min。
7.充分混勻后室溫下以12000rpm/min的轉速離心15min，棄沉淀，取上清，即得到
重組豬干擾素α I變性溶液。本發明還提供了優化后的重組豬干擾素α I的包涵體復性方法，包括如下步驟取適量用變性緩沖液Buffer C溶解的重組豬干擾素α I變性溶液，用QuickStart Bradford Ix Dye Reagent (美國bio-rad公司)測其濃度，然后用復性緩沖液BufferD將蛋白濃度稀釋到O. 2mg/mL，4°C復性至24h時，將復性后重組蛋白溶液過O. 45 μ m濾膜(Merck Millipore公司)，即得到低濃度的重組豬干擾素α I復性溶液。以截留分子量IOKDa超濾脫鹽、濃縮，于真空冷凍干燥機(北京四環科學儀器廠有限公司)低溫真空干燥，即獲得重組豬干擾素α I粉末。本發明的上述所述表達、純化、復性方法是經過發明人反復多次實驗摸索和驗證得到的用于大腸桿菌表達系統表達重組豬干擾素α I的最為有效的方法，該方法的表達量高，且表達得到包涵體復性后活性更高。尤其是本發明的經優化過的重組豬干擾素α I的基因序列，更適于大腸桿菌表達系統的表達，所表達的重組豬干擾素α I遠高于豬干擾素αI天然基因序列在大腸桿菌表達系統的表達量。本發明還提供了重組豬干擾素α I在制備治療和預防豬繁殖與呼吸綜合征、豬流感以及豬藍耳病疾病的藥物中的用途。在豬仔疾病治療過程中，干擾素α I可以非特異性的發揮廣泛的抗病毒效應，提高機體免疫應答和增強對病毒的防御能力。同時，干擾素α 也可與其他疫苗聯合使用，減輕疫苗的不良反應，增強整體抗病毒、細菌、寄生蟲的效力。


圖1表示重組豬干擾素α I密碼子優化前后核苷酸序列比較

其中，偶數行(即“原始序列”對應的行)為豬干擾素α I天然基因核苷酸序列，即密碼子優化前的序列；奇數行(即“優化序列”對應的行)為本發明的重組豬干擾素α I的基因核苷酸序列，即密碼子優化后的序列。圖2-a、圖2-b為重組豬干擾素α I密碼子優化前后在大腸桿菌表達宿主中CAI指數。其中，圖2-a表示豬干擾素α I天然基因核苷酸序列在大腸桿菌表達宿主中CAI指數經過程序計算為O. 58 ;圖2-b表示優化后的本發明的重組豬干擾素α I密碼子在大腸桿菌表達宿主中CAI指數經過程序計算為O. 86。圖3-a、圖3-b為豬干擾素α I密碼子優化前后在大腸桿菌表達宿主中最優密碼子頻率分布區域圖。其中，圖3_a表示豬干擾素α I天然基因核苷酸序列在大腸桿菌表達宿主中最優密碼子頻率分布區域圖，從圖中可以看出豬干擾素α I天然基因核苷酸序列的低利用率密碼子出現百分比為14% ;圖3-b表示優化后的本發明的重組豬干擾素α I密碼子在大腸桿菌表達宿主中最優密碼子頻率分布區域圖，優化后的本發明的重組豬干擾素α I密碼子序列的低利用率密碼子出現百分比為O。圖4_a、圖4_b為重組豬干擾素α I密碼子優化前后在大腸桿菌表達宿主中平均GC堿基含量分布區域圖。其中，圖4_a表示豬干擾素α I天然基因核苷酸序列在大腸桿菌表達宿主中平均GC堿基含量為58. 57%;圖4-b表示優化后的本發明的重組豬干擾素α I密碼子在大腸桿菌表達宿主中平均GC堿基含量為55. 15%。圖5-a、圖5-b為重組豬干擾素α I密碼子優化前后mRNA的二級結構預測圖。圖5-a豬干擾素α I天然基因mRNA的二級結構預測圖，圖5_b為密碼子優化后的本發明的重組豬干擾素a ImRNA的二級結構預測圖。圖6為重組豬干擾素α I表達質粒構建過程圖。圖7為重組豬干擾素α I基因PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，泳道I為NdeI和XhoI酶切pET21b載體；泳道2為500bp DNA Ladder ;泳道3為兩端含有NdeI和XhoI酶切位點的重組豬干擾素α I基因PCR產物。圖8-a、圖8-b為重組豬干擾素α I的SDS-PAGE凝膠電泳圖及相應的免疫印跡圖。圖8-a為重組豬干擾素α ISDS-PAGE凝膠電泳圖。其中，泳道I為(10-230kDa)寬范圍的預染的蛋白上樣Marker ;泳道2為未加入IPTG誘導的重組豬干擾素α I大腸桿菌裂解液；泳道3為加入IPTG誘導的重組豬干擾素α I大腸桿菌裂解液。圖8_b為重組豬干擾素α I免疫印跡圖。其中，泳道l(10_230KDa)寬范圍的預染的蛋白上樣Marker，泳道2為未加入IPTG誘導的重組豬干擾素α I大腸桿菌裂解液泳道3為加入IPTG誘導的重組豬干擾素α I大腸桿菌裂解液。圖9重組豬干擾素α I高效表達誘導條件優化的SDS-PAGE凝膠電泳圖。其中，泳道I為(10_230kDa)寬范圍的預染的蛋白上樣Marker ;泳道2為O. 5mmol/L IPTG誘導Ih的含重組豬干擾素α I大腸桿菌裂解液；泳道3為O. 5mmol/L IPTG誘導2h的含重組豬干擾素α I大腸桿菌裂解液；泳道4為O. 5mmol/L IPTG誘導3h的含重組豬干擾素α I大腸桿菌裂解液；泳道5為O. 5mmol/L IPTG誘導4h的含重組豬干擾素α I大腸桿菌裂解液；泳道6為lmmol/L IPTG誘導Ih的含重組豬干擾素α I大腸桿菌裂解液；泳道7為lmmol/L IPTG誘導2h的含重組豬干擾素α I大腸桿菌裂解液；泳道8為lmmol/LIPTG誘導3h的含重組豬干擾素α I大腸桿菌裂解液；泳道9為lmmol/L IPTG誘導4h的含重組豬干擾素α I大腸桿菌裂解液；泳道10為1. 5mmol/L IPTG誘導Ih的含重組豬干擾素α I大腸桿菌裂解液；泳道11為1. 5mmol/L IPTG誘導2h的含重組豬干擾素α I大腸桿菌裂解液；泳道12為1. 5mmol/L IPTG誘導3h的含重組豬干擾素α I大腸桿菌裂解液；泳道13為1.5mmol/L IPTG誘導4h的含重組豬干擾素α I大腸桿菌裂解液。圖10為復性后的重組豬干擾素α I包涵體SDS-PAGE電泳圖其中，泳道I為(10_230kDa)寬范圍的預染的蛋白上樣Marker ;泳道2重組豬干擾素α I大腸桿菌裂解液；泳道3為用Buffer B第一次清洗后重組豬干擾素α I包涵體沉淀；泳道4為Buffer B第二次清洗后重組豬干擾素α I包涵體沉淀；泳道5為稀釋復性后的重組豬干擾素α I。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，應理解，引用實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
實施例1重組豬干擾素α I基因優化設計1.密碼子優化遺傳密碼子有64種，但是絕大多數生物傾向于利用這些密碼子中的一部分。那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子(optimal codons)，那些不被經常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子(rare or low-usage codons)。實際上,常用做蛋白表達或生產的每種生物(包括大腸桿菌，酵母，哺乳動物細胞，植物細胞和昆蟲細胞)都表現出某種程度的密碼子利用的差異或偏愛。大腸桿菌、酵母和果蠅中對含最佳密碼子的基因的表達效率明顯高于含低利用率的密碼子的基因的表達效率。因此，在異源表達系統中，密碼子的偏愛性很大程度上影響了重組蛋白的表達。利用偏愛密碼子(preferred codons)并避免利用稀有的密碼子進行基因合成，這種基因的重新設計叫密碼子優化。優化過程充分考慮到蛋白表達不同階段可能遇到的多種復雜因素，如密碼子適應性、mRNA結構以及轉錄和翻譯過程中不同的順式元件。因此，本發明對豬干擾素α I的基因設計不僅包括密碼子優化，還包括mRNA結構修正、翻譯起始位點的優化等。2.密碼子偏愛性優 化密碼子偏愛性在原核基因表達中已經被證實是一個很重要的影響因素，它引起了同一密碼子在不同生物體之間，蛋白的表達水平之間以及同一操縱子的不同部位間利用率的改變。引起這種偏愛性差異的主要原因是不同細胞內可用的tRNAs量的差異。因此優化翻譯系統最佳的方法就是保持密碼子的使用頻率與同源tRNA之間的平衡。在大腸桿菌中表達哺乳動物基因是不可預測和具有挑戰的，如在大腸桿菌中，AGG和AGA所對應的tRNA分子就很少，這種差異很明顯會影響基因的表達。3.將低利用率的密碼子替換成宿主常用密碼子通常基因中包含的密碼子在特定宿主中的利用率越低，該種蛋白的表達量也就越少，甚至當這種密碼子存在與蛋白簇間或者N末端的時候表達量會更少。在不改變氨基酸序列的前提下將低利用率的密碼子替換為宿主常用密碼子能提高功能蛋白的表達水平。任何來源的密碼子如果在宿主生物體內的利用率低于5%到10%時，就會出現表達抑制，當這些低利用率密碼子臨近或相連時，對蛋白表達的影響更大。成簇的低利用率的密碼子抑制了核糖體的運動，這是基因不能以合適水平表達的一個明顯機制。核糖體翻譯由九個密碼子組成的信使(含幾個低利用率密碼子或全部為低利用率密碼子)時的運動速度要比翻譯不含低利用率密碼子的同樣長的信使的速度慢。即使低利用率密碼子簇位于3’端，信使最后也會被核糖體“擁擠”而損害，核糖體又回到5’端。3’端低利用率密碼子簇的抑制效應可以和全部信使都由低利用率密碼子組成的抑制效應一樣大。如果低利用率密碼子簇位于5’端，其效應是起始核糖體數目的全面減少，導致蛋白合成中信使的低效率。去除低利用率的密碼子或者容易被誤讀為終止信號的密碼子能夠防止低表達或者不表達。4.表達載體和轉錄啟動子雖然密碼子偏愛在基因表達中起著重要的作用，但表達載體和轉錄啟動子的選擇同樣重要，N端核苷酸序列的蛋白表達對于低利用率密碼子和接近起始位點的密碼子AUG非常敏感。翻譯與mRNA的穩定性間也存在著相互的影響，雖然降低翻譯效率會使mRNA由于缺少了核糖體的保護而更容易被endo-RNAses分解，但目前還沒有它們之間影響的完整解釋。
其他因素也可以影響蛋白表達，包括使mRNA去穩定的序列。穩定mRNA 二級結構和接近5'端的分子也對基因表達有重要的影響。利用翻譯時目的基因上游的開放式閱讀框能夠成功提高難度基因的表達效率。發明人根據GenBank 已公開的豬干擾素 al (Sus scrofa interferon,alpha I)的cDNA序列(GenBank登錄號NM_214393.1)，對該基因進行密碼子優化后得到本發明的重組豬干擾素α I基因，如SEQ ID No :1所示。下面是對重組豬干擾素α I進行密碼子優化，優化前后各參數對比如下1.密碼子適應指數(Codon Adaptation Index, CAI)由圖2-a可知，密碼子沒有優化前，豬干擾素α I天然基因在大腸桿菌中密碼子適應指數(CAI)為0.58。由圖2-b可知，通過密碼子優化后，使得本發明的重組豬干擾素α 基因在大腸桿菌中CAI指數為0. 86。通常CAI=I時被認為該基因在該表達系統中是最理想的高效表達狀態，CAI指數越低表明該基因在該宿主中表達水平越差，因此可以看出經過了密碼子優化后得到的基因序列可以提高重組豬干擾素αI基因在大腸桿菌中的表達水平。2.最優密碼子使用頻率(Frequency of Optimal Codons, FOP)由圖3_a可知，基于大腸桿菌表達載體，密碼子沒有優化前，豬干擾素α I天然基因序列的低利用率密碼子出現百分比為14%。這條未進行優化的基因含有串聯稀有密碼子，這些密碼子可能降低翻譯效率，甚至能夠解散翻譯裝配物。由圖3-b可知，通過密碼子優化后，本發明的重組豬干擾素αI基因在大腸桿菌系統中出現低利用率密碼子的頻率為O03. GC 喊基含量(GC curve)`
GC含量理想分布區域為30% -70%，在這個區域外的出現任何峰都會不同程度地影響轉錄和翻譯效率。由圖4-a、圖4-b的豬干擾素α I基因的GC堿基平均含量分布區域圖對比可知，由圖4-a中顯示豬干擾素α I天然基因中在優化前GC堿基平均含量為58. 57%,由圖4-b中顯示出優化后的序列消除了 GC含量在30% -70%區域外所有堿基，最終得到優化后重組豬干擾素α I的GC堿基平均含量為55. 15%。3.優化前后順式作用元件情況如下
權利要求
1.一種重組豬干擾素α 1，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
2.一種編碼權利要求1中所述的重組豬干擾素α I的基因,其堿基序列如SEQ ID NO I所示。
3.一種載體，所述載體具有權利要求2的基因。
4.如權利要求3所述的載體，所述載體為pET21b。
5.一種大腸桿菌，所述大腸桿菌具有權利要求3的載體。
6.如權利要求5所述的大腸桿菌，所述大腸桿菌為BL21(DE3)菌株。
7.一種重組豬干擾素α I的表達方法，包括如下步驟 (1)挑取含有權利要求5或6中所述的大腸桿菌菌落，接入含抗生素的LB培養液，培養過夜； (2)取過夜培養物轉接入于含抗生素的新鮮LB培養液中，震蕩培養至對數中期^600-1· O ; (3)在培養物中加入濃度為O.5-1. 5m mol/L的IPTG，37°C，誘導表達l_4h后，離心處理收集含有重組豬干擾素αI的大腸桿菌菌體沉淀。
8.—種重組豬干擾素α I的純化和復性方法，其特征在于，包含如下步驟 (1)將權利要求7中所述的含有重組豬干擾素αI的大腸桿菌菌體沉淀，用預冷的PBS重懸，于4°C,以12000rpm/min離心15min,重復一次； (2)吸去上清，按每克(菌體濕重)加入3-10mL裂解緩沖液BufferA，攪動緩沖液使菌體懸起； (3)每克(菌體濕重)菌體加入3-10μ L濃度為100mmol/L的PMSF，3-100 μ L濃度為100mg/mL的溶菌酶，冰上攪動； (4)破碎菌體細胞，4°C，高速離心，棄上清； (5)包涵體沉淀用洗漆緩沖液BufferB洗漆，4°C,高速離心15min,棄上清,包涵體沉淀重復本步驟一次； (6)包涵體沉淀用變性緩沖液BufferC溶解，室溫攪拌30_60min ； (7)充分混勻后室溫條件下高速離心15min，棄沉淀，取上清，即得到重組豬干擾素αI變性溶液； (8)取適量用變性緩沖液BufferC溶解的所述的重組豬干擾素α I變性溶液，測其濃度，然后用復性緩沖液Buffer D將蛋白濃度稀釋到0. 2mg/mL，4°C復性至24h時，將復性后重組蛋白溶液過0. 45 μ m濾膜，即得到重組豬干擾素α I復性溶液。
9.如權利要求8所述的純化和復性方法，其特征在于，所述重組豬干擾素αI復性溶液可進一步以截留分子量IOKDa超濾濃縮、脫鹽，低溫真空干燥，即獲得重組豬干擾素α I粉末。
10.一種藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物包含由權利要求8或9的方法得到的重組豬干擾素α I。
全文摘要
本發明提供了一種重組豬干擾素α1及其編碼基因、表達、純化和包涵體復性方法，屬于生物基因工程領域。重組干擾素α1作為一種非特異性廣譜抗病毒生物制劑在獸藥領域具有廣闊的藥用前景，但與大多基因工程獸藥一樣其一直存在著生產量不足、價格昂貴、藥品規格不一等問題。為獲取大量的重組豬干擾素α1，本發明采用大腸桿菌表達系統對密碼子優化后的重組豬干擾素α1基因進行異源表達。此外，針對原核表達體系中的豬干擾素α1多以包涵體的形式表達的問題，本發明還提供了重組干擾素α1包涵體純化及復性方法，使得制得的重組干擾素α1具有較高活力，達到了產業化生產的標準。
文檔編號C12R1/19GK103059122SQ20131002517
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月23日 優先權日2013年1月23日
發明者馬永, 王安良, 章成昌, 徐春林, 陳晨, 王耀方 申請人:江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司, 常州京森生物醫藥研究所有限公司