專利名稱：一種大黃魚干擾素(ifn)基因及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大黃魚干擾素(IFN)基因全長cDNA序列及其克隆方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大黃魚是我國海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖量最大的魚類，年產(chǎn)量7萬噸，年產(chǎn)值30多億元。但是目前大黃魚的養(yǎng)殖受到多種疾病的嚴(yán)重威脅，其中病毒繼發(fā)感染是導(dǎo)致魚類大規(guī)模死亡最主要的原因之一。在1957 年就已確認(rèn)干擾素的作用[Isaacs A, Lindenmann J, 1957. Virus interference. I. The interferon. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 147: 258-267]。但是到2003年才首次從斑馬魚中克隆到第一個魚類干擾素基因[Altmarm SM, Mellon MT, Distel DL, Kim CH, 2003. Molecular and functional analysis of an interferon gene from the zebrafish, Danio rerio. J Virol. 77: 1992-2002]。干擾素的生物學(xué)作用干擾素anterferons)是一類主要由病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子，能夠誘導(dǎo)魚類進(jìn)入抗病毒狀態(tài)。干擾素系統(tǒng)包括應(yīng)答外界刺激(如病毒感染)而合成干擾素的細(xì)胞和應(yīng)答干擾素作用而建立抗病毒狀態(tài)的細(xì)胞，是機(jī)體防御反應(yīng)中出現(xiàn)最早的防御系統(tǒng)[Zou J, Secombes CJ, 2011. Teleost fish interferons and their role in immunity, Dev Comp Immunol, doi:10. 1016/j. dci. 2011.07.001, In publish.]。干擾素系統(tǒng)是連接機(jī)體非特異性免疫和特異性免疫的橋梁[Le Bon A, Tough DF. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Curr Opin Immunol 2002; 14:432-6] 0除了抗病毒作用外，它還具有抗菌功能[Bogdan C. The function of type I interferons in antimicrobial immunity. Curr Opin Immunol 2000;12:419-24.]以及參與其他重要的生理過程，如調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、凋亡以及機(jī)體免疫反應(yīng)等[Maher SGj Romero-Weaver ALj Scarzello AJj Gamero AM. Interferon: cellular executioner or white knight Curr Med Chem 2007;14:1279-89·]。目前在魚類中發(fā)現(xiàn)的干擾素具有重要的抗病毒等疾病、免疫保護(hù)等功能[Collet B, Munro ES, Gahlawat S， Acosta F， Garcia J， Roemelt C， et al. 2007. Infectious pancreatic necrosis virus suppresses type I interferon signalling in rainbow trout gonad cell line but not in Atlantic salmon macrophages. Fish Shellfish Immunol. 22: 44-56； Zou J， Secombes CJj 2011. Teleost fish interferons and their role in immunity, Dev Comp Immunol, doi : 10· 1016/j. dci. 2011. 07. 001， In publish ； Robertsen B， 2006. The interferon system of teleost fish. Fish Shellfish Immunol. 20: 172-191.]。但是，目前尚無對大黃魚干擾素基因的序列信息報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種大黃魚干擾素(IFN)全長蛋白編碼區(qū)的cDNA序列及其克隆方法。本發(fā)明在大黃魚疾病防治及進(jìn)一步開發(fā)為醫(yī)藥產(chǎn)品方面具有良好應(yīng)用前景，并為大黃魚分子標(biāo)記輔助選育的抗病育種、魚類健康狀態(tài)的檢測奠定基礎(chǔ)。為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的解決方案是
一種大黃魚干擾素(IFN)基因，其蛋白編碼區(qū)的cDNA序列，具有序列表中SEQ ID NO. 1 堿基序列及SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。一種大黃魚干擾素(IFN)基因的克隆方法，包括如下步驟
(1)從大黃魚的肝臟和皮膚組織中提取總RNA；
(2)然后進(jìn)行cDNA第一鏈合成；
(3)根據(jù)硬骨魚類IFN的同源片段序列設(shè)計引物進(jìn)行嵌套聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)，以肝臟為模板，得到大黃魚IFN基因片段，其中正向引物Fl :5' ATGCTCAACAGGATTTTCT 3'， F2 5' GGCTAATAACTCCACTAAC3’，反向引物 Rl :5, TCAGCTCCCAGGCTTCAGC 3' ，R2 5' TGTGTTCTCCTCCCATGA 3'；
(4)又以大黃魚皮膚組織為模板，用2條基因特異性正向引物3F1 5，ACAGCCAGGCGTCCAAAG 3，，3F2 :5，TCAGGTTCTGGAGGAGGC 3’ 進(jìn)行大黃魚 IFN cDNA 3， 端快速擴(kuò)增(3’ RACE)；
(5)然后以大黃魚皮膚組織為模板，用2條基因反向引物Rl 5，TCAGCTCCCAGGCTTCAGC3’ R2 :5，TGTGTTCTCCTCCCATGA 3'進(jìn)行對大黃魚 IFN cDNA 5'端克隆(5，RACE)。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、嵌套聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Nested-PCR)、3，端cDNA快速擴(kuò)增(3，- RACE)以及5，端cDNA快速擴(kuò)增(5，-RACE)的方法，對大黃魚一種干擾素基因全長cDNA進(jìn)行了研究，首次從大黃魚中克隆到了一種干擾素基因全長cDNA序列，用于干擾素基因的重組表達(dá)和功能研究。采用本發(fā)明中所述方法，能夠從大黃魚肝臟和皮膚中克隆到1種干擾素基因(稱為大黃魚IFN基因)，采用本發(fā)明對大黃魚IFN基因的成功克隆和測序，首次得到了 1種大黃魚的IFN基因，搞清了它們的全部編碼序列和非編碼序列，從而也弄清了它所編碼的氨基酸序列，該序列可以用以設(shè)計引物再克隆該基因(所以可以不用以上引物和方法)，也可以根據(jù)該序列或該序列所推導(dǎo)的氨基酸序列對該基因進(jìn)行重組表達(dá)。通過網(wǎng)上相似性和同源性檢索，提示大黃魚IFN可以激活大黃魚的免疫反應(yīng)，在大黃魚的病害防治中具有廣泛的應(yīng)用價值。采用本發(fā)明使通過重組表達(dá)，生產(chǎn)重組表達(dá)大黃魚IFN的重組蛋白藥物，環(huán)境友好，無污染。在大黃魚疾病防治及進(jìn)一步開發(fā)為海水魚類醫(yī)藥產(chǎn)品方面具有良好應(yīng)用前；同時，可以以此為基礎(chǔ)，篩選與抗病相關(guān)的單個苷酸多態(tài)性(SNP)，為大黃魚分子標(biāo)記輔助選育的抗病育種、魚類健康狀態(tài)的檢測奠定基礎(chǔ)。
具體實施例方式實施例1
本實施例的一種克隆的大黃魚干擾素基因，具有序列表中SEQ ID NO. 1堿基序列。(1) SEQ ID NO 1的信息(參見序列表) (a)序列特征
*長度:878堿基對*類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b)分子類型cDNA
(c)假設(shè)否
(d)反義否
(e )最初來源大黃魚 iLarimich thys crocea )。本實施例的一種克隆的大黃魚干擾素基因，具有序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列
(2) SEQ ID NO. 2的信息(參見序列表)
(a)序列特征
*長度185氨基酸 *類型氨基酸 *鏈型單鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b)分子類型蛋白質(zhì)
其中大黃魚干擾素基因的克隆方法為
1.總RNA提取用手術(shù)剪刀解剖活的大黃魚，取其肝臟、皮膚，迅速放到RNA保護(hù)液(百泰克)中，樣品保存按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行，保存的樣品用于RNA的提取。總RNA的提取使用 Invitrogen (中國，上海)生物公司的Trizol RNA提取試劑，提取方法參照使用說明書。2. cDNA 第一鏈合成據(jù) Ferments life sience 公司 RevertAid 第一鏈 cDNA 合成試劑盒說明書進(jìn)行。3.大黃魚干擾素基因cDNA片段克隆
(1)根據(jù)GenBank中報道的魚類干擾素的保守序列設(shè)計引物，用于PCR擴(kuò)增，得到大黃魚干擾素基因片段。2 條正向引物 Fl: 5' ATGCTCAACAGGATTTTCT3’，F(xiàn)2 :5’ GGCTAATAACTCCACTAAC 3，，2 條反向引物 Rl :5，TCAGCTCCCAGGCTTCAGC 3，，R2 :5，TGTGTTCTCCTCCCATGA 3，。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的試劑與條件
10 χ PCR 緩沖液(Mg2+濃度為 15 mM) 2μ 1 (TaKaRa,大連) 模板大黃魚肝臟cDNA1 μ 1
正向引物(ΙΟμΜ) (Fl 5’ ATGCTCAACAGGATTTTCT3’ ) 1 μ 1 反向引物(ΙΟμΜ) (R1 5 TCAGCTCCCAGGCTTCAGC 3 ) 1 μ 1 脫氧核苷酸混合物(dNTP，2. 5mM)1.6μ 1 (TaKaRa,大連)
DNA 聚合酶(5U/ μ L)0· 2 μ 1 (TaKaRa,大連)
滅菌水13. 2 μ 1
PCR反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性:3min，然后進(jìn)入下列循環(huán)94 °C 45s, 50 °C 30s, 72 °C 50s (30個循環(huán))；72°C 8min ；上述PCR程序反應(yīng)結(jié)束后，在20 μ L PCR反應(yīng)體系中，模板更換為入1 :10稀釋的首輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 μ L，引物更換為IFN F2(10yM) (5’ GGCTAATAACTCCACTAAC 3’，)禾口 IFN R2(10yM) (5，TGTGTTCTCCTCCCATGA 3’)各 1 μ L，進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，退火溫度由50°C更換為52°C，其他反應(yīng)條件同前，1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。(2)反應(yīng)產(chǎn)物純化利用上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品(DNA UNIQ-10柱式DNA 膠回收試劑盒)，操作步驟按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。(3)基因片段的克隆純化的PCR產(chǎn)物與pMD 19_T載體(寶生物工程(大連)有限公司)連接，轉(zhuǎn)化TOP 10 (天根公司)菌株，進(jìn)行氨芐抗性篩選，挑取單克隆擴(kuò)增培養(yǎng)后，以 1 μ L菌液PCR為模板，以F2、R2為引物做PCR檢測，重復(fù)上述PCR條件，擴(kuò)增后瓊脂糖電泳檢測，確認(rèn)插入片段大小后進(jìn)行測序。4.大黃魚 IFN cDNA 3，端快速擴(kuò)增(3，一 RACE)
根據(jù)得到的大黃魚IFN基因片段序列，又設(shè)計2條特異性正向引物 3F1:5，ACAGCCAGGCGTCCAAAG 3'，3F2:5' TCAGGTTCTGGAGGAGGC,及通用引物 A0LP: 5，GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)^ 3，禾口 AP: 5，GGCCACGCGTCGACTAGTAC 3 講行 cDNA 3，端快速擴(kuò)增，PCR反應(yīng)的試劑與條件為
10 χ PCR 緩沖液(Mg2+濃度為 15mM) 2μ 1 (TaKaRa,大連) 模板皮膚cDNA1 μ 1
正向引物 3F1 (ΙΟμΜ)0. 5μ 1
反向引物 AOLP (10 μ Μ)0. 5μ 1
脫氧核苷酸混合物(dNTP，2. 5mM)1.6μ1 (TaKaRa,大連)
DNA 聚合酶(5U/ μ L)0· 2 μ 1 (TaKaRa,大連)
滅菌水14. 2 μ 1
PCR 反應(yīng)條件為94°C 變性:3min ；94°C 變性 45s ；56°C 退火 30s ；72°C 延伸 30s ；30 個循環(huán)；最后72°C延伸8min。PCR第一輪擴(kuò)增后，在20 μ L PCR反應(yīng)體系中，模板更換為1:10稀釋的首輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物lyL，引物更換為基因特異性引物IFN 3F2 (5’ TCAGGTTCTGGAGGAGGC 3')和錨定引物 AP (5’ GGCCACGCGTCGACTAGTAC 3’)各 0. 5 μ L，進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，退火溫度改為58 °C，其它反應(yīng)條件同前。5.大黃魚 IFN cDNA 5，端快速擴(kuò)增(5，一 RACE) (1)第一鏈cDNA合成
以從大黃魚皮膚組織提取的RNA為模板，用Oligo (dT) 18為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA，采用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行(TaKaRa,大連)。反應(yīng)體系如下0. 1 — 5 μ g RNA, 1 μ L Oligo (dT) 18 Primer (0· 5 μ g/ μ L)，加入無 RNase 的水補(bǔ)足到 12 μ L，混勻，簡單離心，65°C下水浴5min，取出立即冰上放置。然后按照順序加入如下反應(yīng)體系， 5 X反應(yīng)緩沖液4 μ 1
Ribolock RNase 抑制劑(20U/μ 1，F(xiàn)ermentas, MBI) 1 μ 1 dNTP mix (IOmM)2 μ 1
RevertAid M-Mulv 反轉(zhuǎn)錄酶(200υ/μ 1)1 μ 1
混勻離心，42°C保溫60min，最后70°C保溫5min終止反應(yīng)。(2 ) cDNA第一鏈的純化
采用TaKaRa DNA片段純化試劑盒(TaKaRa，大連)，按照試劑盒操作說明進(jìn)行。(3)加尾合成的cDNA經(jīng)DNA純化試劑盒(TaKaRa，大連)純化后，用末端轉(zhuǎn)移酶(TdT， Fermentas)在新合成的cDNA末端加上poly C尾。(3)第一輪 PCR 擴(kuò)增
以加尾的 dC-cDNA 為樽板，用接頭引物 AAP(5，GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG 3') 和基因特異性引物IFN Rl(5’ TCAGCTCCCAGGCTTCAGC 3’),擴(kuò)增序列的5’末端。20 yL反應(yīng)體系中包括10XPCR buffer (Mg2+濃度為 15 mM) 2 μ LCTaKaRa,大連)，dNTP (2. 5mM) 1.6 μ L(TaKaR￡i，大連)，正向引物MP (10 μ Μ) 0.5 μ L，反向引物 Rl (10 μ Μ) 0.5 μ L， 模板(cDNA 3，端加尾產(chǎn)物)1 UL, Taq酶(5 U/μ L) 0.2 μ L (TaKaRa,大連)，滅菌雙蒸水 14. 2μ L。PCR 反應(yīng)條件94°C 3 min ;94°C 45 s ；55°C 30 s ；72°C 40s ;30 個循環(huán)；最后 720C 8 min。(3)半巢式PCR擴(kuò)增
PCR第一輪擴(kuò)增后，在20 PL PCR反應(yīng)體系中，加入1 μ L首輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，基因特異性引物IFN R2(5’ TGTGTTCTCCTCCCATGA 3，)和通用引物AP各0. 5 yL，進(jìn)行第二輪PCR 擴(kuò)增，退火溫度改為53°C，72°C延伸改為40s，其它反應(yīng)條件同前。(4)反應(yīng)產(chǎn)物純化、克隆和測序同前。大黃魚IFN cDNA序列驗證根據(jù)拼接得到的大黃魚IFN cDNA全序列的5，和3， 端特異性序列，設(shè)計1對特異性引物進(jìn)行全長序列擴(kuò)增，再測序驗證。通過網(wǎng)上相似性和同源性檢索，提示大黃魚IFN與其他魚類的IFN的序列相似性較高。大黃魚IFN cDNA可以編碼185個氨基酸的蛋白質(zhì)，預(yù)測分子量為20. 94kDa，等電點(diǎn)為6. 35，酸性蛋白質(zhì)。應(yīng)用SMART在線分析軟件預(yù)測含有20個氨基酸的信號肽，預(yù)測其成熟肽等電點(diǎn)為6. 20，分子量18. SlkDa0氨基酸序列用SMART軟件分析發(fā)現(xiàn)該蛋白具有一個結(jié)構(gòu)域，為I型干擾素同源區(qū)(IFabd domain)，從60到171個氨基酸。大黃魚的IFN在不同組織中可以受病毒模式分子polyI:C、副溶血弧菌、LPS等激活，被激活后，可以激發(fā)產(chǎn)生抗病毒、抗菌反應(yīng)，在大黃魚疾病防治、魚藥受體方面及進(jìn)一步開發(fā)為醫(yī)藥產(chǎn)品方面具有良好應(yīng)用前景，并以此為基礎(chǔ)，篩選抗病分子標(biāo)記，在為大黃魚分子標(biāo)記輔助選育的抗病育種、魚類健康狀態(tài)的檢測奠定基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種大黃魚干擾素基因，其特征在于其蛋白編碼區(qū)的CDNA序列，具有序列表中SEQ ID NO. 1堿基序列及SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
2.一種如權(quán)利要求1所述的大黃魚干擾素基因的克隆方法，其特征在于包括如下步驟(1)從大黃魚的肝臟和皮膚組織中提取總RNA；(2)然后進(jìn)行cDNA第一鏈合成；(3)根據(jù)硬骨魚類IFN的同源片段序列設(shè)計引物進(jìn)行嵌套聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)，得到大黃魚IFN基因片段，其中正向引物Fl :5，ATGCTCAACAGGATTTTCT 3’， F2 5 GGCTAATAACTCCACTAAC 3，，反向引物 Rl 5 TCAGCTCCCAGGCTTCAGC 3 , R2 5， TGTGTTCTCCTCCCATGA 3，；(4)又用2 條基因特異件 ιΗ 向引物 3F1 :5’ ACAGCCAGGCGTCCAAAG 3’ , 3F2 :5’ TCAGGTTCTGGAGGAGGC 3’ 進(jìn)行大黃魚 IFN cDNA 3’ 端快速擴(kuò)增(3’ RACE)；(5)然后用2 條基因反向引物 Rl 5’ TCAGCTCCCAGGCTTCAGC3 ’ R2 5’ TGTGTTCTCCTCCCATGA 3’ 進(jìn)行對大黃魚 IFN cDNA 5’ 端克隆(5’ RACE)。
全文摘要
本發(fā)明公開一種大黃魚干擾素基因，其特征在于其蛋白編碼區(qū)的cDNA序列，具有序列表中SEQIDNO.1堿基序列及SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；及其克隆方法。本發(fā)明在大黃魚病害防治及進(jìn)一步開發(fā)為生物漁藥產(chǎn)品方面具有良好應(yīng)用前景，在為大黃魚分子標(biāo)記輔助選育的抗病育種、魚類健康狀態(tài)的檢測奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/20GK102559695SQ201110363640
公開日2012年7月11日 申請日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者姚翠鸞, 李嬋, 王志勇 申請人:集美大學(xué)