專利名稱：一種篩選產(chǎn)生淀粉糖化酶菌株的方法
一種篩選產(chǎn)生淀粉糖化酶菌株的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬發(fā)酵工程領(lǐng)域，涉及一種菌種的篩選方法，具體的說，涉及一種篩選產(chǎn)生淀粉糖化酶菌種的方法，是一種將生淀粉進(jìn)行化學(xué)滅菌后添加到篩選培養(yǎng)基中，再通過透明圈法鑒別生淀粉糖化酶活性強(qiáng)的菌株的方法。
背景技術(shù)：
淀粉廣泛用于制藥、制酒和有機(jī)酸等加工產(chǎn)業(yè)。傳統(tǒng)的加工工藝是先將淀粉糊化，然后用糖化酶將淀粉降解為葡萄糖，用于后續(xù)的發(fā)酵加工。生淀粉糖化酶(Raw starch-digesting Glucoamylase, RSDG)能以沒有加熱糊化的生淀粉為底物,從淀粉非還原性末端依次水解α -1，4糖苷鍵得到一個(gè)個(gè)葡萄糖單元分子，省去加熱糊化步驟，達(dá)到簡化工藝、降低能耗的作用。目前，關(guān)于生淀粉糖化酶菌株篩選的報(bào)道有很多，但生淀粉糖化酶菌株的篩選方法單一，主要采用碘顯色反應(yīng)檢驗(yàn)水解圈進(jìn)行篩選，該方法需要對整個(gè)平板染色(加碘液)以便識別生淀粉糖化酶菌株。由于碘對菌株有強(qiáng)烈的殺害作用，不利于后續(xù)分離純化，因此常采用先純化保存再檢測的方法，操作較為繁瑣。也有報(bào)道利用碘的揮發(fā)特性，采用碘熏蒸代替碘液檢驗(yàn)水解圈再分離純化，但是不同的菌株碘熏量和時(shí)間不同，不易操作。另外，也有報(bào)道利用甲醛氣體熏蒸生淀粉滅菌24 h，再用105 1干熱滅菌2 h，用于配制生淀粉糖化酶篩選培養(yǎng)基，但該方法較為費(fèi)時(shí)，而且使用了高溫處理，處理不好可能使淀粉熟化，同時(shí)，由于甲醛氣體強(qiáng)烈刺激粘膜、具有致癌性、操作必須謹(jǐn)慎。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種篩選產(chǎn)生淀粉糖化酶菌種的方法，利用糖化酶產(chǎn)生菌可以在篩選培養(yǎng)基上形成透明水解圈，可以直接從平皿上觀測，不需要滴加碘液染色，菌落可以直接挑出純化進(jìn)入后續(xù)研究過程。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案
一種篩選產(chǎn)生淀粉糖化酶菌種的方法，其步驟如下
1、取不溶性生淀粉進(jìn)行消毒滅菌。
所述不溶性生淀粉的消毒滅菌方式是利用次氯酸鈉溶液對不溶性生淀粉消毒滅菌。
所述不溶性生淀粉的消毒滅菌方式是利用升汞溶液對不溶性生淀粉消毒滅菌。
所述不溶性生淀粉的消毒滅菌方式是利用雙氧水溶液對不溶性生淀粉消毒滅菌。
2、配制篩選培養(yǎng)基
平皿篩選培養(yǎng)基的配方為NaNO3O.1 O. 5%、K2HPO4 O.1 O. 3%、MgSO4 · 7H20O.03 O. 1%、KC10. 03 O. l%、FeS04 ·7Η200· 001 O. 003%、瓊脂粉 I 3%, ρΗ=5. 5 7. 5，高溫滅菌。待培養(yǎng)基冷卻到60 85°C時(shí)，加入經(jīng)過滅菌的不溶性生淀粉，使不溶性生淀粉的濃度達(dá)到I 3%，迅速倒平皿。
3、從田間收 集腐爛木薯、其他植物組織或土樣，用無菌水浸提，稀釋后涂布在平皿篩選培養(yǎng)基上，25 40°C下培養(yǎng)2 3天，挑取生長旺盛、水解透明圈明顯的菌落分離純化，再接種平板分離培養(yǎng)基中25 40°C培養(yǎng)2 3天，驗(yàn)證透明圈。驗(yàn)證方式采用滴加碘液檢驗(yàn)方式，即在部分平皿中用傳統(tǒng)方法滴加碘液檢驗(yàn)透明圈是否與傳統(tǒng)的染色圈一致。
作為優(yōu)選，在平皿篩選培養(yǎng)基涂布前采用富集培養(yǎng)方式，即取腐爛木薯、其他植物組織或土樣，表面消毒后加入搖瓶富集培養(yǎng)基中，25 40°C，100 400 r/min培養(yǎng)2 5天，取培養(yǎng)液稀釋后加入平皿篩選培養(yǎng)基中涂布。所述搖瓶富集培養(yǎng)基的配方為=NaNO3O.1 O. 5%、K2HPO4 O.1 O. 3%、MgSO4 · 7H20 O. 03 O. 1%、KCl O. 03 O. 1%、FeSO4 · 7H20O.001 O. 003%、pH=5. 5 6. 0，高溫滅菌后加入經(jīng)過滅菌的不溶性生淀粉，使不溶性生淀粉的濃度達(dá)到I 3%。
4、將分離純化的菌株進(jìn)一步培養(yǎng)，優(yōu)化產(chǎn)酶條件，測定酶學(xué)特性。
本發(fā)明利用糖化酶產(chǎn)生菌可以在篩選培養(yǎng)基上形成透明水解圈的特性，不需要滴加碘液染色，不需要先保存大量菌株再進(jìn)行篩選，可以直接從平皿上挑出菌落進(jìn)行純化進(jìn)入后續(xù)研究過程，操作簡單，安全。


圖1 :用不同滅菌溶液處理生淀粉所配制的篩選培養(yǎng)基的滅菌效果；
A:用75 %酒精滅菌的生淀粉所配制的培養(yǎng)基，在28°C培養(yǎng)5天，長出菌落，說明滅菌不徹底；
B :用4 %NaC102滅菌的生淀粉所配制的培養(yǎng)基，在28°C培養(yǎng)5天，沒有長出菌落， 說明滅菌效果好；
C :用O. 36 %升汞滅菌的生淀粉所配制的培養(yǎng)基，在28°C培養(yǎng)5天，沒有長出菌落， 說明滅菌效果好；
D :用3 % H2O2滅菌的生淀粉所配制的培養(yǎng)基，在28°C培養(yǎng)5天，沒有長出菌落，說明滅菌效果好；
圖2為采用本發(fā)明篩選糖化酶菌株的代表性結(jié)果；
A :將富集培養(yǎng)的菌液涂布在篩選培養(yǎng)基上，在28°C培養(yǎng)5天，長出大量菌落，其中少數(shù)菌落出現(xiàn)明顯的透明圈，可能具有高產(chǎn)生淀粉糖化酶的能力；
B:在篩選培養(yǎng)基上獲得產(chǎn)生淀粉糖化酶的真菌菌株。
C :經(jīng)純化所獲得的細(xì)菌菌株，周圍形成明顯透明圈，證實(shí)該菌落具有降解生淀粉能力。
D :經(jīng)純化所獲得的真菌菌株，周圍形成明顯透明圈，證實(shí)該菌落具有降解生淀粉能力。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未 注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例一
1、取不溶性生淀粉(木薯生淀粉或者其它植物生淀粉)用雙氧水浸泡滅菌，然后1500 r/min離心2 min,棄上清,無菌水清洗2次,1500 r/min離心2 min,棄上清。在沉淀中加入少量無菌水懸浮淀粉備用。
2、配制篩選培養(yǎng)基
平皿篩選培養(yǎng)基的配方為=NaNO3O. 2%、K2HPO4 O. 3%、MgSO4 · 7H20 O. 06%、 KC10. 08%、FeSO4 · 7Η200· 003%、瓊脂粉 5%, ρΗ=5. 5 6· 0，121 °C滅菌 15 min。待培養(yǎng)基冷卻到80°C時(shí)，加入經(jīng)過滅菌的不溶性生淀粉，使不溶性生淀粉的濃度達(dá)到3%，迅速倒平皿。
3、從田間收集腐爛木薯，用無菌水浸提，取浸提液按10的倍數(shù)稀釋，取60 Ul稀釋液加入平皿篩選培養(yǎng)基中涂布。37°C下培養(yǎng)2天，挑取生長旺盛、水解透明圈明顯的菌落分離純化，再接種平板分離培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)3天，滴加碘液檢驗(yàn)水解圈。
4、將分離純化的菌株進(jìn)一步培養(yǎng)，優(yōu)化產(chǎn)酶條件，測定酶學(xué)特性。取所獲得的一株酶活力較高的產(chǎn)生淀粉糖化酶菌株進(jìn)行酶學(xué)特性研究，其生淀粉糖化酶酶活力為780 U mL-1，此酶對溫度和pH較敏感,其最適pH為6左右,在其他pH條件下酶活力較低；此酶在 pH (5、6、7、8)條件下靜置I h，酶活力保持在86 %以上。此酶不耐酸性，酸性條件下易失活；最適溫度為45 °C，高于此溫度酶活力迅速下降，不耐高溫。
實(shí)施例二
1、取不溶性生淀粉(木薯生淀粉或者其它植物生淀粉)用4 %NaC102避光浸泡20 min滅菌,每隔5 min搖勻I次,1500 r/min離心2 min,棄上清,無菌水清洗2次,1500 r/ min離心2 min,棄上清。在沉淀中加入少量無菌水懸浮淀粉備用。
2、配制篩選培養(yǎng)基
搖瓶富集培養(yǎng)基的配方為=NaNO3O. 5%、K2HPO4 O. 2%、MgSO4 · 7H20 O. 08%、KClO.04%、FeSO4 · 7H20 O. 002%、pH=5. 5 6· 0，121 °C滅菌 20 min，加入經(jīng)過滅菌的不溶性生淀粉，使不溶性生淀粉的濃度達(dá)到2%。
平皿篩選培養(yǎng)基的配方為NaNO3O. 2%、K2HPO4 O. 1%、MgSO4 · 7H20 O. 05%、 KC10. 05%、FeSO4 · 7Η200· 001%、瓊脂粉 2%, ρΗ=5. 5 6· 0，121 °C滅菌 15 min。待培養(yǎng)基冷卻到70°C時(shí)，加入經(jīng)過滅菌的不溶性生淀粉，使不溶性生淀粉的濃度達(dá)到2%，迅速倒平皿。
3、從田間收集腐爛木薯，用75 %的酒精表面消毒，取內(nèi)部組織加入含150 ml搖瓶富集培養(yǎng)基中；40°C，200 r/min培養(yǎng)2天。取培養(yǎng)液按10的倍數(shù)稀釋，取60 ul稀釋液加入平皿篩選培養(yǎng)基中涂布。38°C下培養(yǎng)2天，挑取生長旺盛、水解透明圈明顯的菌落分離純`化，再接種平板分離培養(yǎng)基中37 °C培養(yǎng)2天，滴加碘液檢驗(yàn)水解圈。
4、將分離純化的菌株進(jìn)一步培養(yǎng)，優(yōu)化產(chǎn)酶條件，測定酶學(xué)特性。取所獲得的一株酶活力較高的產(chǎn)生淀粉糖化酶菌株進(jìn)行酶學(xué)特性研究，其生淀粉糖化酶活力為307 U mL-1，此酶在pH3 6條件下酶活力較高，在pH(4、5、6)條件下靜置I h后，酶活力保持在 93 %以上，具有良好的耐酸性；此酶具有良好的溫度耐受性，在75、85 °C條件下保溫I h， 酶活力仍保持在72 %以上，具有良好的應(yīng)用前景。
實(shí)施例三
1、取不溶性生淀粉(木薯生淀粉或者其它植物生淀粉)用O. 36 %升汞浸泡20 min 滅菌，每隔5 min搖勻I次1500 r/min離心2 min,棄上清,無菌水清洗2次,1500 r/min 離心2 min,棄上清。在沉淀中加入少量無菌水懸浮淀粉備用。
2、配制篩選培養(yǎng)基
搖瓶富集培養(yǎng)基的配方為=NaNO3O. 1%、K2HPO4 O. 3%、MgSO4 · 7H20 O. 1%、KClO.05%、FeSO4 · 7H20 O. 002%、pH=5. 5 6· 0，121 °C滅菌 20 min，加入經(jīng)過滅菌的不溶性生淀粉，使不溶性生淀粉的濃度達(dá)到3%。
平皿篩選培養(yǎng)基的配方為=NaNO3O. 5%、K2HPO4 O. 2%、MgSO4 · 7H20 O. 03%、 KC10. 08%、FeSO4 · 7Η200· 002%、瓊脂粉 3%, ρΗ=5. 5 6· 0，121 °C滅菌 15 min。待培養(yǎng)基冷卻到70°C時(shí)，加入經(jīng)過滅菌的不溶性生淀粉，使不溶性生淀粉的濃度達(dá)到3%。
3、從田間收集腐爛香蕉莖葉，用75 %的酒精表面消毒，取內(nèi)部組織加入含150 ml 搖瓶富集培養(yǎng)基中；36°C，200 r/min培養(yǎng)3天。取培養(yǎng)液按10的倍數(shù)稀釋，取60 ul稀釋液加入平皿篩選培養(yǎng)基中涂布。38°C下培養(yǎng)3天，挑取生長旺盛、水解透明圈明顯的菌落分離純化，再接種平板分離培養(yǎng)基中37 °C培養(yǎng)3天，滴加碘液檢驗(yàn)水解圈。
4、將分離純化的菌株進(jìn)一步培養(yǎng)，優(yōu)化產(chǎn)酶條件，測定酶學(xué)特性。取所獲得的一株酶活力較高的產(chǎn)生淀粉糖化酶菌株進(jìn)行酶學(xué)特性研究，其粗酶液酶活力為169 U/mL，其最適pH值為7，此酶在pH(5、6、7、8)條件下靜置I h，酶活力保持在83 %以上；其最適溫度為 50 V，高于此溫度，酶易失活，此酶不耐高溫，F(xiàn)e2+和Mn2+離子對酶活力有顯著的促進(jìn)作用， 相對未添 加金屬離子酶活力分別提高了 249 %和313%。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種篩選產(chǎn)生淀粉糖化酶菌種的方法，其特征在于，其步驟如下1)、取不溶性生淀粉進(jìn)行消毒滅菌；2)、配制篩選培養(yǎng)基平皿篩選培養(yǎng)基的配方為=NaNO3 O.1 O. 5%,K2HPO4 O.1 O. 3%,MgSO4 ·7Η20 O. 03 O.1%、KC10. 03 O. 1%, FeSO4 · 7H200. 001 O. 003%、瓊脂粉 I 3%, ρΗ=5· 5 7. 5，高溫滅菌；待培養(yǎng)基冷卻到60 85°C時(shí)，加入經(jīng)過滅菌的不溶性生淀粉，使不溶性生淀粉的濃度達(dá)到I 3%，迅速倒平皿；3)、從田間收集腐爛木薯、其他植物組織或土樣，用無菌水浸提，稀釋后涂布在平皿篩選培養(yǎng)基上，25 40°C下培養(yǎng)2 3天，挑取生長旺盛、水解透明圈明顯的菌落分離純化， 再接種平板分離培養(yǎng)基中25 40°C培養(yǎng)2 3天，驗(yàn)證透明圈；4)、將分離純化的菌株進(jìn)一步培養(yǎng)，優(yōu)化產(chǎn)酶條件，測定酶學(xué)特性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于所述不溶性生淀粉的消毒滅菌方式是利用次氯酸鈉溶液對不溶性生淀粉消毒滅菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于所述不溶性生淀粉的消毒滅菌方式是利用升汞溶液對不溶性生淀粉消毒滅菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于所述不溶性生淀粉的消毒滅菌方式是利用雙氧水溶液對不溶性生淀粉消毒滅菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于在平皿篩選培養(yǎng)基涂布前采用富集培養(yǎng)方式，即取腐爛木薯、其他植物組織或土樣，表面消毒后加入搖瓶富集培養(yǎng)基中，25 400C，100 400 r/min培養(yǎng)2 5天，取培養(yǎng)液稀釋后加入平皿篩選培養(yǎng)基中涂布；所述搖瓶富集培養(yǎng)基的配方為NaNO3 O.1 O. 5%, K2HPO4 O.1 O. 3%, MgSO4 · 7H20 O. 03 O. 1%、 KCl O. 03 O. 1%, FeSO4 · 7H20 O. 001 O. 003%、pH=5. 5 6. 0，高溫滅菌后加入經(jīng)過滅菌的不溶性生淀粉，使不溶性生淀粉的濃度達(dá)到I 3%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種篩選產(chǎn)生淀粉糖化酶菌種的方法，是將不溶性生淀粉用化學(xué)方法消毒滅菌；配制平皿篩選培養(yǎng)基；取腐爛木薯、其他植物組織或土樣浸提，將浸提液稀釋后加入平皿篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑取生長旺盛、水解透明圈明顯的菌落分離純化，將分離純化的菌株進(jìn)一步培養(yǎng)，優(yōu)化產(chǎn)酶條件，測定酶學(xué)特性。本發(fā)明利用糖化酶產(chǎn)生菌可以在篩選培養(yǎng)基上形成透明水解圈的特性，不需要滴加碘液染色，不需要先保存大量菌株再進(jìn)行篩選，可以直接從平皿上挑出菌落進(jìn)行純化進(jìn)入后續(xù)研究過程，操作簡單，安全。
文檔編號C12N1/14GK103060246SQ20131002532
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月23日
發(fā)明者張家明, 鐘坤, 譚德冠, 孫雪飄, 韓冰瑩 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所