專利名稱：一種抗楊尺蠖害蟲的轉基因歐美雜交楊的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物品種改良的生物技術，具體地涉及一種抗楊尺蠖害蟲的轉基因歐美雜交楊。
背景技術：
楊樹是世界上分布最廣，適應性最強的樹種，是我國重要的速生用材樹種之一。然而，隨著環境的不斷惡化，自然災害的頻繁發生，食葉害蟲和蛀干害蟲的危害成為大面積發展楊樹豐產林的最大障礙，化學防治方法不僅成本高、污染環境，而且易使害蟲產生抗藥性，因此，利用基因工程方法培育具有抗蟲能力的楊樹新品種是控制蟲害的重要途徑。林木植物由于生長周期較長，總是面臨周圍環境中各種病蟲害的侵犯，因此在長期的演化過程中，他們自身已獲得了適度、有效的生物抗性機制，能夠最大限度地避免逆境的危害。通過深入挖掘并利用林木植物這種自身的病蟲害防御機制，利用基因工程方法培育轉基因抗蟲林木新品種，對發展生態林業、保護生態環境具有重要意義。WIN4是一種楊樹葉片創傷后誘導表達的蛋白，目前僅被描述為一種營養儲存蛋白，尚無文獻資料報道其對楊樹主要食葉害蟲之一——鱗翅目楊尺蠖具有抗蟲能力。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種抗楊尺蠖害蟲的轉基因歐美雜交楊。本發明的技術方案概 述如下:一種抗楊尺蠖害蟲的轉基因歐美雜交楊，是用下述方法獲得:(I)以雜交楊(Populus trichocarpaXPopulus deltoides)葉片的總 RNA 為模板，以SEQID N0.2、SEQ ID N0.3所示核苷酸序列為上、下游引物，通過RT-PCR得到了 SEQID N0.1表示的核苷酸序列；(2)將凝膠回收的SEQ ID N0.1表示的核苷酸序列連接到pJETl.2載體上得到重組質粒并導入E.coli菌株T0P10，篩選出陽性克隆，提取質粒；(3)將步驟(2)獲得的質粒雙酶切，將凝膠回收的SEQ ID N0.1表示的核苷酸序列與經雙酶切的植物表達載體PBI121進行連接，轉化E.coli菌株T0P10 ；(4)用SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3篩選含有抗性質粒的菌落，提取質粒并進行質粒PCR驗證、BamHI/SacI雙酶切驗證，挑選正確的重組子，將其命名為pBI121WIN4 ；(5)將PBI121-WIN4通過電擊法轉入根癌農桿菌C58中，得到的菌落進行菌落PCR鑒定，大小為981bp片段的菌落即為正確的菌株；(6)將步驟(5)獲得的菌株轉化歐美雜交楊(Populus deltoides X Populusnigra),獲得一種抗楊尺蠖害蟲的轉基因歐美雜交楊。本發明將雜交楊(PopulustrichocarpaXPopulus del toides)中編碼創傷應答蛋白WIN4的基因導入歐美雜交楊(Populus deltoidesXPopulus nigra)中得到一種抗楊尺蠖害蟲的轉基因歐美雜交楊(轉基因雜交楊)，利用轉基因雜交楊和非轉基因歐美雜交楊(Populus deltoidesXPopulus nigra)(對照植物)的葉片分別飼喂楊尺蠖，結果證明，本發明的轉基因雜交楊對楊尺蠖幼蟲的致死率顯著優于對照植物；轉基因雜交楊對楊尺蠖幼蟲生長發育的負面影響顯著高于對照植物；轉基因雜交楊對楊尺蠖成蟲的化蛹率、羽化率、產卵量和卵孵化率的負面影響均顯著高于對照植物。本發明通過將創傷應答蛋白WIN4基因遺傳轉化重要林木植物歐美雜交楊以提高其抗蟲能力，利用該方法能夠顯著提高歐美雜交楊對我國楊樹主要食葉害蟲之一——鱗翅目楊尺蠖的抗蟲能力，為培育抗蟲林木提供了一種十分有效的方法，對降低農藥使用、延緩害蟲抗性的產生具有一定的意義，對維持生態系統的平衡和可持續發展也有重大的應用價值。


圖1 為來源于雜交楊(Populus trichocarpaXPopulus deltoides)的創傷應答蛋白基因cDNA的克隆。圖2為攜帶創傷應答蛋白基因WIN4的植物表達載體圖。圖3為轉基因雜交楊基因組DNA的PCR檢測。圖4為轉基因雜交楊的RT-PCR檢測。
具體實施例方式下述結合具體實施例對本發明作進一步的說明。本發明所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1:轉基因雜交楊的獲得1、雜交楊(Populus trichocarpa 母本 XPopulus del toides 父本)創傷應答蛋白基因cDNA的克隆根據Genbank 登錄的雜交楊(Populus trichocarpaXPopulus deltoides)創傷應答蛋白的部分cDNA序列(L20233.1),設計引物，以雜交楊(PopulustrichocarpaXPopulusdel toides)葉片總 RNA 為模板，以 Forward:5，-atgtcgagcgttaacttggtag-3，；(SEQ ID N0.2)和 Reverse:5，_tcattcacaagccaaacgtg_3，；(SEQ ID N0.3)為上、下游引物，通過RT-PCR得到了預期大小的特異條帶(SEQ IDN0.1表示的核苷酸序列)，結果如圖1所示。凝膠回收PCR產物(SEQ ID N0.1表示的核苷酸序列)，并將回收的PCR產物連接到PJET1.2載體上，將連接產物導入E.coli菌株T0P10 ;并篩選出陽性克隆，測序后利用DNAMAN進行氨基酸預測，并與Genbank中預測蛋白氨基酸序列(GenBank:AAA16342.1)比較，結果完全一致，表明克隆的序列正確，為雜交楊(Populustrichocarpa X Populusde I to ides)損傷應答蛋白基因 cDNA。2、植物表達載體的構建

將上述陽性克隆單菌落提取質粒(WIN4重組到測序載體pJETl.2后構建的質粒)經BamHI/SacI雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳回收981bp的片段，植物表達載體pBI121經BamHI/SacI雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳回收載體大片段。將回收的2種片段連接后轉化E.coli菌株T0P10，在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上用SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3篩選含有抗性質粒的菌落。對篩選出的單菌落提取質粒，并對質粒用WIN4目的基因的特異性引物(SEQ IDN0.2, SEQ ID N0.3)進行PCR驗證、BamHI/SacI雙酶切驗證，挑選正確的重組子，將其命名為PBI121-WIN4，載體圖譜如圖2所示。3、農桿菌工程菌株的制備將上述獲得的植物表達載體pBI121-WIN4通過電擊法轉入根癌農桿菌C58中，在含有利福平和卡那霉素各50mg/L的YEB固體培養基上涂板，得到的菌落進行菌落PCR鑒定，得到大小為981bp片段的菌落即為正確的菌株。將該菌株的單菌落接種到新鮮YEB培養基(含利福平和卡那霉素各50mg/L)中，28°C 180rpm震蕩培養至0D_大約為0.5時制得用于轉化的菌液。4、農桿菌介導的楊樹遺傳轉化在超凈工作臺上，將歐美雜交楊(Populusdeltoides XPopulus nigra)2_3cm 長的莖段放入上述菌液中浸泡lOmin ，之后將莖段轉移到共培養培養基中于23°C暗培養3天。之后將莖段轉入附加20mg/L卡那霉素的篩選培養基中，于23°C培養I個月后出現愈傷組織。將帶有抗性愈傷組織的莖段轉接于分化篩選培養基，大約I個月后可觀察到不定芽。待不定芽長至2-3cm時沿其基部剪下，轉移到生根篩選培養基，3-4周根系發育完全，獲得一種抗楊尺蠖害蟲的轉基因歐美雜交楊(轉基因雜交楊)。5、轉基因雜交楊的分子檢測(I)基因組DNA的PCR鑒定用Takara 公司的 Universal genomic DNA extraction kit 提取轉基因雜交楊葉片的基因組DNA，以該DNA為模板，用目的基因的特異性引物(SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3)對其進行PCR。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3所示，M:DNA marker ；1:非轉基因歐美雜交楊(Populus deltoides XPopulus nigra)(陰性對照)；2_6:轉基因雜交楊；7:pBI121-WIN4質粒(陽性對照)。從圖中可以看出，轉基因雜交楊和陽性對照均能擴增得到981bp的特異性條帶，證明WIN4已經整合進楊樹基因組中。(2) RT-PCR 檢測用QIAGEN公司的RNeasy mini kit提取轉基因雜交楊葉片的總RNA，以該RNA為模板進行cDNA合成(iScript cDNA Synthesis kit, BioRad),用目的基因的特異性引物(SEQID N0.2,SEQ ID N0.3)對反轉錄產物進行RT-PCR分析。結果如圖4所示，M:DNA marker ；1-6:轉基因雜交楊。從圖中可以看出，轉基因雜交楊均能擴增得到981bp的特異性條帶，證明WIN4已經在轉基因雜交楊葉片中表達。共培養培養基包括:MS鹽4.4g，蔗糖30g，生長素NAA1.86mg，細胞分裂素2ipl.02mg, pH=5.7,乙酰丁香酮 19.86mg,瓊脂 7.2g，加水至 1L。篩選培養基包括:MS鹽4.4g，蔗糖30g，細胞分裂素TDZ0.05mg, pH=5.7，頭孢霉素350mg,卡那霉素20mg,瓊脂7.2g,加水至1L。分化篩選培養基包括:MS鹽4.4g，蔗糖30g，細胞分裂素TDZ0.0022mg, pH=5.7，頭孢霉素350mg,卡那霉素20mg,瓊脂7.2g,加水至1L。生根篩選培養基包括:MS鹽2.2g，蔗糖30g，pH=5.7，頭孢霉素350mg，卡那霉素20mg，瓊脂7.2g，加水至IL0實施例2:—種抗楊尺蠖害蟲的轉基因歐美雜交楊(轉基因雜交楊)對楊尺蠖害蟲的抗蟲能力研究1、楊尺蠖的群體飼養在室內常溫條件下孵化楊尺蠖卵塊，將剛孵化的楊尺蠖I齡幼蟲放在清潔干燥的罐頭瓶中，用轉基因雜交楊和非轉基因歐美雜交楊(Populus deltoides XPopulus nigra)(對照植物)的葉片分別喂飼幼蟲，用透氣紗布扎緊瓶口，保證葉片新鮮、充足。每瓶30只幼蟲，設6個重復。將培養瓶置于(25±2) °C，相對濕度(RH) 70%-80%的生化培養箱中培養。飼養3周時統計各處理楊尺蠖幼蟲的體重和體長；化蛹前統計存活情況，計算死亡率；記錄每次飼喂葉片重量和剩余葉片重量，計算與對照相比的取食量；化蛹后統計化蛹率和平均蛹重；羽化后統計羽化、產卵量和孵化情況。2、轉基因雜交楊對楊尺蠖的抗蟲性分析(I)轉基因雜交楊對楊尺蠖幼蟲生長發育的影響分別用不同株系的轉基因雜交楊和非轉基因歐美雜交楊(Populusdeltoides XPopulusnigra)(對照植物)葉片飼養楊尺蠖初孵幼蟲，飼養3周時統計各處理楊尺蠖幼蟲的體重和體長,飼喂對照植物的幼蟲平均體重為292.6mg，平均體長2.9cm,化蛹后的平均蛹重為176.3mg，而飼喂轉基因雜交楊的幼蟲平均體重和體長及蛹重均顯著降低，說明轉基因雜交楊對楊尺蠖幼蟲的生長發育影響高于對照植物。化蛹前飼喂對照植物使楊尺蠖幼蟲的總死亡率為3.0%，而飼喂轉基因雜交楊使幼蟲的總死亡率顯著提高達18.1%-22.0%，表明轉基因雜交楊對楊尺蠖幼蟲的致死作用高于對照植物。結果見表I。表I轉基因雜交楊和對照植物對楊尺蠖幼蟲生長發育的影響
權利要求
1.一種抗楊尺蠖害蟲的轉基因歐美雜交楊，其特征是用下述方法獲得: (1)以雜交楊(PopulustrichocarpaXPopulus deltoides)葉片的總 RNA 為模板，以SEQID N0.2,SEQ ID N0.3所示核苷酸序列為上、下游引物，通過RT-PCR得到了 SEQ ID N0.1表示的核苷酸序列； (2)將凝膠回收的 SEQID N0.1表示的核苷酸序列連接到pJETl.2載體上得到重組質粒并導入E.coli菌株T0P10，篩選出陽性克隆，提取質粒； (3)將步驟(2)獲得的質粒雙酶切，將凝膠回收的SEQID N0.1表示的核苷酸序列與經雙酶切的植物表達載體PBI121進行連接，轉化E.coli菌株TOPlO ； (4)用SEQID N0.2,SEQ ID N0.3篩選含有抗性質粒的菌落，提取質粒并進行質粒PCR驗證、BamHI/SacI雙酶切驗證，挑選正確的重組子，將其命名為pBI121_WIN4 ； (5)將pBI121-WIN4通過電擊法轉入根癌農桿菌C58中，得到的菌落進行菌落PCR鑒定，大小為981bp片段的菌落即為正確的菌株； (6)將步驟(5)獲得的菌株轉化歐美雜交楊(PopulusdeltoidesXPopulus nigra),獲得一種抗楊尺蠖害蟲的轉基因歐美雜交楊。
全文摘要
本發明公開了一種抗楊尺蠖害蟲的轉基因歐美雜交楊，用下述方法獲得以雜交楊(Populus trichocarpa×Populus deltoides)葉片的總RNA為模板，以SEQ ID No.2、3為引物，RT-PCR得到SEQ ID No.1并連接到pJET1.2上得到重組質粒并導入E.coli菌株TOP10，篩選陽性克隆，篩選含有抗性質粒的菌落，提取質粒進行PCR驗證、雙酶切驗證，挑選正確的重組子，命名為pBI121-WIN4并轉入根癌農桿菌，進行菌落PCR鑒定；獲得的菌株轉化歐美雜交楊，得到抗楊尺蠖害蟲的轉基因歐美雜交楊。本發明的抗楊尺蠖害蟲的轉基因歐美雜交楊對楊尺蠖害蟲的抗蟲能力強。
文檔編號C12N15/84GK103088057SQ20131002955
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月25日 優先權日2013年1月25日
發明者王潔華, 楊少輝, 宋英今 申請人:天津大學