專利名稱：一種同步檢測二十二種呼吸道病原體的試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及呼吸道病原體的檢測試劑盒及其檢測方法，尤其是涉及一種基于GeXP多重基因表達遺傳分析系統的同步檢測二十二種呼吸道病原體的試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
呼吸道感染每年造成大量人群生病或死亡，尤其甲型流感病毒時有局部暴發或爆發性流行，對人民的健康及社會造成巨大威脅；其他病原體感染也會引起暴發流行。目前對呼吸道感染的最終診斷方法仍以病原體檢查為主，往往在確診上報之時，疫情已經有一定程度的傳播。因此亟需建立呼吸道病原體快速高效的診斷方法。目前，我國呼吸道病原體的傳統檢測方法主要包括以下幾種:(1)病原體檢查:即直接做影像及活組織檢查，或病原體分離培養，之后在顯微鏡、電鏡下觀察，做出診斷。優點是成本低，對實驗室硬件要求低。但存在如下缺點:1)耗時長:一般需3-5天或更長。2)診斷效率低:只能每個菌單獨培養；對一些表型特征變異的病原體，用形態學經驗很難辨別；此外，由于抗生素的濫用，細菌在檢測過程中生長受到抑制，導致假陰性的結果；3)工作量巨大:由于對每個抽檢樣品的每種菌都必須進行檢測，工作量非常巨大，特別是部分對培養環境要求較為苛刻的菌，更加大了檢測的工作量和難度。(2)免疫學檢查:應用最廣泛的是酶聯免疫技術(ELISA): 一般先用一抗與抗原發生特異性結合，然后用通用的酶標記的二抗與一抗發生特異性結合，再將酶顯色，之后觀察結果。優點:1)樣品通量較高:利用96孔酶標板，一塊平板可完成多個樣品的檢測；2)較敏感:利用酶聯的特性，可將原來的抗原信號放大；3)快捷:在時間上，比傳統的培養基微生物培養檢查法要縮短很多。但存在如下缺點:1)易出現假陽性:由于洗滌和抗原包被的操作，或由于抗原表面決定簇類似而發生交叉反應，故易出現假陽性；2)耗時耗力:制作抗體是非常耗時耗力的工作；3)靈敏度不確定:實驗的靈敏度取決于抗體的好壞，而每個抗體的好壞不一，質量難以控制；4)無法檢測多變異的病毒:變異性較快的病毒，如甲流病毒，存在多種亞型，并且經常變異，變異導致抗體失效，無法檢測抗原。(3)分子生物學——PCR檢測方法:目前經常應用的有實時熒光定量PCR、免疫PCR、反轉錄PCR等，都是針對病原體的特異性靶基因進行檢測。其中，熒光定量PCR檢測方法最為成熟。熒光定量PCR技術的優點:靈敏性高，并可精確定量，在對李氏桿菌、沙門氏菌、肉毒桿菌、大腸桿菌等的檢測中都取得了良好效果。2004年，中國發布了實施熒光定量PCR檢測禽流感H7亞型的國家標準。2009年，美國FDA批準了用熒光定量PCR檢測豬流感HlNl亞型的試劑盒。但也存在如下缺點:1)通量低:一次只能檢測一個病原成分，如需要檢測多種病原菌，就需要多臺PCR儀同時工作，效率低，周期長，對大批量的多種病原污染的樣品更是無從下手；2)成本相對較高:因一次只能檢測一個病原體，當一個樣品同時需要檢測多種病原菌時，必須一個一個檢測，成本相對增高。(4)分子生物學一基因芯片法:基因芯片是通過微加工技術，將數以萬計、乃至百萬計的特定序列的DNA片段(基因探針)，有規律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，構成的一個二維DNA探針陣列，利用這類芯片與標記的生物樣品進行雜交，可對樣品的基因表達譜生物信息進行快速定性和定量分析。優點:1)高通量并行檢測:當一個樣品同時需要檢測多種病原菌時，一次實驗即可得出全部結果；2)操作簡便快速:整個檢測只需4-8小時基本可以出結果；但也存在如下缺點:1)技術成本昂貴、復雜:每個樣品需要一個芯片，成本大于YlOOO/樣品，不利于大規模推廣；2)探針的合成與固定比較復雜，特別是制作高密度的探針陣列，是主要的限速步驟；3)不能精確定量，重復性差；4)靈敏度較低:芯片法需核酸量較大，一般須先做多重PCR擴增，由于引物較多，容易自身產生二聚體，發夾結構，或由于Tm值不同，而導致擴增目的片段效率不同，進而影響檢測的靈敏度；5)由于芯片的種類較多，難以制定一個統一的質量控制標準。Gen0meLabTMGeXP多重基因表達遺傳分析系統基于貝克曼公司成熟的毛細管電泳分離技術及高靈敏度的激光誘導熒光技術研發而成，一束8道的毛細管陳列設計充分利用了 96孔板的排列特性，降低了使用更大的陳列帶來的花費和復雜性。采用多重PCR方法，通過Beckman Coulter染色標記,在同一個EP管中同時分析多個基因的表達,能快速有效地檢測基因的表達狀況，克服了上述呼吸道病原體傳統檢測方法存在的缺陷，具有以下優1、高通量:本系統采用雙(96孔)板、自動加樣和樣品追蹤技術，實現單個反應檢測30-40個位點，可同時做192個反應(如192個患者樣品，每個樣品檢測30種腹瀉病毒，30個位點)，一天出結果；對于交叉感染患者，本方法可一次性給出準確報告，避免漏檢。2、準確性強:GeXP采用毛細管電泳對PCR產物進行分離檢測，可將非特異性擴增產物、引物二聚體和特異性擴增產物分離，最大程度降低假陽性；3、敏感性高，結果重復性好:GeXP系統克服了傳統PCR擴增方法的不均等擴增造成的偏差，提高了對一套目的基因進行定量的速度和敏感性，采用激光誘導熒光-PMT，具有超聞靈敏度；4、方法簡便，使用經濟=GeXP提供從試劑、多重PCR引物設計、結果及定量表達譜分析等全套實驗方案；每個樣品的檢測成本少于￥50，利于大規模推廣；5、精確定量、靈活性強:可精確定量病原體基因拷貝數，可隨時根據需求調整檢測的靶基因。6、易于實現自動化:就樣品制備而言，Biomek系列自動液體處理儀可以與GeXP分析儀和Ampligrid擴增儀完全匹配，集成的條形碼閱讀器保證了準確的樣品追蹤和結果報
生口 o目前，國內外還沒有關于基于GeXP多重基因表達遺傳分析系統的同步檢測二十二種呼吸道病原體的試劑盒及其檢測方法的相關研究報道。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種特異性強、靈敏度高、通量高、可靠性強、成本低、無假陰性結果的基于GeXP多重基因表達遺傳分析系統的同步檢測二十二種呼吸道病原體的試劑盒及其檢測方法。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為:一種同步檢測二十二種呼吸道病原體的試劑盒，包括DEPC水、5 X RT緩沖液、反轉錄弓I物、反轉錄酶、X溶液，10 X PCR緩沖液、PCR引物、25mM氯化鎂溶液、DNA聚合酶和陽性對照品,所述的反轉錄弓I物包括以下表I中九種呼吸道病原體的RT擴增引物及人RNA內參的RT擴增引物，所述的PCR引物包括以下表I中余下十三種呼吸道病原體的正反向PCR擴增引物、人DNA內參的正反向PCR擴增引物、反應內參的正反向PCR擴增引物以及上述九種呼吸道病原體的PCR擴增引物及人RNA內參的PCR擴增引物，基因序列如下表1所示:表權利要求
1.一種同步檢測二十二種呼吸道病原體的試劑盒，包括DEPC水、5 X RT緩沖液、反轉錄引物、反轉錄酶、X溶液，IOXPCR緩沖液、PCR引物、25mM氯化鎂溶液、DNA聚合酶和陽性對照品，其特征在于:所述的反轉錄引物包括以下表中九種呼吸道病原體的RT擴增引物及人RNA內參的RT擴增引物，所述的PCR引物包括以下表中余下十三種呼吸道病原體的正反向PCR擴增引物、人DNA內參的正反向PCR擴增引物、反應內參的正反向PCR擴增引物以及上述九種呼吸道病原體的PCR擴增引物及人RNA內參的PCR擴增引物，基因序列如下表所示:
2.根據權利要求1所述的一種同步檢測二十二種呼吸道病原體的試劑盒，其特征在于:所述的X溶液為包括三磷酸脫氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向擴增引物序列為AGGTGACACTATAGAATA ;反向擴增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向擴增引物帶熒光標記。
3.根據權利要求1所述的一種同步檢測二十二種呼吸道病原體的試劑盒，其特征在于:所述的陽性對照品連接有設計上述二十二種呼吸道病原體、RNA內參、DNA內參和反應內參的引物的基因保守序列的PMD18-T的克隆載體。
4.一種利用權利要求1-3中任一項所述的同步檢測二十二種呼吸道病原體的試劑盒的檢測呼吸道病原體的方法，其特征在于具體包括以下步驟: (1)采集樣本并提取核酸 采集呼吸道感染患者的鼻咽拭子或痰液的分離培養物，從分離培養物中提取核酸； (2)以患者核酸為模板進行RT反應 取5-20ng/ul的核酸樣品RNA5 u L，DEPC水8uL,5XRT緩沖液4 y L，RT引物溶液2 u L,RT酶Iii L混勻后加入到96孔樣品板上進行反轉錄，反應條件:48° Cl分鐘；42° C60分鐘；95° C5分鐘；4° C直至收取RT產物；其中反轉錄引物溶液中各RT引物濃度均為500nM，所述的RT引物包括九種呼吸道病原體的RT擴增引物及人RNA內參的RT擴增引物，基因序列如序列表中SEQ ID N0.1 N0.10所不； (3)以反轉錄產物為模板進行PCR反應 取RT產物8.6 ii L，10 X PCR緩沖液2 y L，25mM的氯化鎂4 y L，PCR引物溶液2 y L，DNA聚合酶1.4 ii L，X溶液2 ii L混勻后加入到96孔樣品板上進行PCR反應，反應條件:95° ClO分鐘；94° C30秒鐘，55° C30秒鐘，70° Cl分鐘，循環35次；70° Cl分鐘；4° C直至收取PCR產物；其中所述的X溶液為包括三磷酸脫氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向擴增引物序列為AGGTGACACTATAGAATA ;反向擴增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向擴增引物帶熒光標記，PCR引物溶液中各PCR引物濃度均為200nM，所述的PCR引物包括余下十三種呼吸道病原體的正反向PCR擴增引物、人DNA內參的正反向PCR擴增引物、反應內參的正反向PCR擴增引物以及上述九種呼吸道病原體的PCR擴增引物及人RNA內參的PCR擴增引物，基因序列如序列表中SEQ ID N0.10 N0.50所示； (4)GeXP遺傳分析儀毛細電泳分離樣品取PCR產物1 u L，GeXP遺傳分析儀配套的上樣緩沖液38.75 u L，DNA標準品0.5 y L，礦物油一滴混合均勻后加入到96孔分離液板上進行毛細電泳分離樣品，將GeXP遺傳分析儀的軟件獲得的圖譜與 標準圖譜對比，判斷呼吸道病原體的種類。
全文摘要
本發明公開了一種同步檢測二十二種呼吸道病原體的試劑盒及其檢測方法，該試劑盒包括DEPC水、5×RT緩沖液、反轉錄引物、反轉錄酶、X溶液、10×PCR緩沖液、PCR引物、25mM氯化鎂溶液、DNA聚合酶和陽性對照品，特點是反轉錄引物包括九種呼吸道病原體的RT擴增引物及人RNA內參的反向引物，基因序列如SEQ ID NO.1～NO.6所示，PCR引物包括余下十三種呼吸道病原體的正反向PCR擴增引物、人DNA內參的正反向擴增引物、反應內參的正反向擴增引物以及上述九種呼吸道病原體的PCR擴增引物與人RNA內參的PCR擴增引物，基因序列如SEQ ID NO.7～NO.44所示，優點是特異性強、靈敏度高、通量高、可靠性強、成本低、無假陰性結果。
文檔編號C12Q1/68GK103074451SQ20131003329
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月25日 優先權日2013年1月25日
發明者吳勇, 黃迎彬, 南麗 申請人:海爾施生物醫藥股份有限公司