專利名稱：一種基于手性四面體構(gòu)象改變對(duì)目標(biāo)dna濃度進(jìn)行檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種基于手性四面體構(gòu)象改變對(duì)目標(biāo)DNA濃度進(jìn)行檢測的方法，屬于納米生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
手性也稱圓二色性，是一種識(shí)別分子構(gòu)象的特殊吸收光譜。當(dāng)一束平面偏振光通過光學(xué)活性物質(zhì)時(shí)，由于左右圓偏振光的折射率不同，偏振面將旋轉(zhuǎn)一定的角度，這種現(xiàn)象稱為旋光。若光學(xué)活性物質(zhì)含有生色團(tuán)對(duì)左、右圓偏振光的吸收能力也不同，則造成通過的左、右圓偏振光不僅速度不同，而且振幅也不一樣。因此，疊加產(chǎn)生的偏振光將不再是平面偏振光，而是橢圓偏振光，這種現(xiàn)象稱為圓二色性。手性分子是化學(xué)結(jié)構(gòu)上鏡像對(duì)稱而又不能完全重合的分子，一個(gè)化合物的分子與其鏡像不能互相疊合，則必然存在一個(gè)與鏡像相應(yīng)的化合物，這兩個(gè)化合物之間的關(guān)系，相當(dāng)于左手和右手的關(guān)系，即互相對(duì)映。這種互相對(duì)應(yīng)的兩個(gè)化合物成為對(duì)映異構(gòu)體。這類化合物分子稱為手性分子，它是一切生命的起源。納米技術(shù)被認(rèn)為是對(duì)21世紀(jì)一系列高新技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展有極為重要影響的一門熱點(diǎn)學(xué)科。所謂納米技術(shù)，是指用數(shù)千個(gè)分子或原子制造新型材料或微型器件的科學(xué)技術(shù)。其中納米材料是整個(gè)納米技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)。納米材料廣義上是三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍或者由該尺度范圍的物質(zhì)為基本結(jié)構(gòu)單元所構(gòu)成的材料的總稱。由于納米尺寸的物質(zhì)具有與宏觀物質(zhì)所迥異的表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)和量子限域效應(yīng)，因而納米材料具有異于普通材料的光、電、磁、熱、力學(xué)、機(jī)械等性能。納米技術(shù)的快速發(fā)展為手性研究提供了更大的發(fā)展空間，手性與納米材料的結(jié)合起來，創(chuàng)建了手性納米材料的新型研究領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于手性四面體的構(gòu)象改變，快速、簡單、超靈敏的檢測DNA的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案:一種基于手性四面體構(gòu)象改變對(duì)目標(biāo)DNA濃度進(jìn)行檢測的方法，包括不同尺寸金納米粒子的合成、金納米粒子修飾輔助DNA、手性四面體的組裝以及目標(biāo)DNA手性傳感器的構(gòu)建。檢測的目標(biāo)DNA為:5，-GGCGAA CTG GTC CCG TCT ACT TAC CGAAAC GCG CAC CTGAGA CCT TCT AAT AGG GAA AGC CGT AAT GTG CATGTA TCT CCA GGC AAA-3，。工藝步驟為:(I) 30nm (Au1)金納米粒子的合成30nm金納米粒子用朽1檬酸三納沸水中還原氯金酸法合成；(2) IOnm (Au2)金納米粒子的合成IOnm金納米粒子采用兩步法合成；
(3)鉀鹽包裹金納米粒子步驟(I)合成的30nm (Au1)金納米粒子及步驟(2)合成的IOnm (Au2)金納米粒子分別用二水合雙(對(duì)-磺酰苯基)苯基膦化二鉀鹽溶液進(jìn)行包裹使得在0.1-0.5M濃度NaCl溶液中穩(wěn)定存在，從而提高DNA的組裝效率；(4)金納米粒子和輔助DNA偶聯(lián)所用的輔助DNA共有四種=Dnapdna2Jna3Jna4 ^na1為與待測濃度的目標(biāo)dna完全互補(bǔ)，DNA2, DNA3, DNA4為依據(jù)目標(biāo)DNA而專門設(shè)計(jì)；DNA1:5’-TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCTATT AGA AGG TCTCAG GTG CGC GTT TCG GTA AGT AGA CGG GACCAG TTC GCC-3’ ；DNA2:5’-TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TM TAG GGT TTG CGACAG TCG TTC AACTAG AAT GCC CTT TGG GCT GTT CCG GGT GTG GCTCGT CGG-3’ ；DNA3:5，-TTT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCGAAC TGG TCC CGTCTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAACAG CCC-3’ ；DNA4:5’-TTT GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GCT TTC CGCAGC GGA GCA GGAGTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GACTGT CGC-3’ ；將步驟(3)包裹的30nm (Au1)和IOnm (Au2)的金納米粒子通過巰基與輔助DNA進(jìn)行偶聯(lián)，所用的輔助DNA共有四種(DNA1, DNA2, DNA3, DNA4),形成四種不同的金納米粒子-DNA復(fù)合物(Au1-DNA1, Au2-DNA2, Au2-DNA3, Au2-DNA4)；，(5)手性四面體結(jié)構(gòu)的組裝將步驟(4)組裝的四種 金納米粒子-DNA復(fù)合物等摩爾濃度混合，形成手性四面體結(jié)構(gòu)，并對(duì)此結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。(6 )手性四面體檢測目標(biāo)DNA。所述的基于手性四面體構(gòu)象改變對(duì)目標(biāo)DNA濃度進(jìn)行檢測的方法，步驟為:(I) 30nm (Au1)金納米粒子的合成30nm (Au1)金納米粒子的合成方法為:潔凈的三口燒瓶中加入47.5mL超純水，再加入2.5mL質(zhì)量濃度0.2%氯金酸溶液，攪拌并加熱至沸騰，7-8分鐘后快速加入0.75mL質(zhì)量濃度1%檸檬酸三鈉溶液，溶液從無色變?yōu)榧t色后，停止加熱，繼續(xù)攪拌15分鐘；透射電鏡顯示平均粒徑為30nm ；(2) IOnm (Au2)金納米粒子的合成IOnm (Au2)金納米粒子的合成方法為:潔凈的三口燒瓶中加入79mL超純水和ImL質(zhì)量濃度1%氯金酸作為A液；另取一潔凈的小瓶子，加入4mL質(zhì)量濃度1%檸檬酸三鈉，
0.1mL質(zhì)量濃度1%單寧酸，0.lmL25mM碳酸鉀，15.8mL超純水作為B液。A、B液均加熱到600C，然后在高速攪拌下把B液迅速加入A液中，混合液在60°C下繼續(xù)攪拌30分鐘到形成深紅色溶液。然后將溶液加熱回流2分鐘形成亮紅色溶液。最后冷卻到室溫形成檸檬酸穩(wěn)定的金納米粒子，透射電鏡顯示平均粒徑為10nm。( 3)鉀鹽包裹金納米粒子分別取步驟(I)制備的30nm (Au1)金納米粒子及步驟(2)制備的IOnm (Au2)金納米粒子各自取IOmL 50nM分別置于甲瓶及乙瓶中，甲瓶加入5 μ L 10mg/mL及乙瓶加入5 μ L20mg/mL的二水合雙(對(duì)-磺酰苯基)苯基膦化二鉀鹽溶液，室溫震蕩反應(yīng)10小時(shí)；各自用6000r/min及13000r/min,離心10分鐘后去除上清液,加水恢復(fù)到原體積；(4)金納米粒子和輔助DNA偶聯(lián)步驟(3)制備的鉀鹽包裹的兩種金納米粒子(Au1及Au2),分別取一份50 μ L30nm金納米粒子(Au1)于I號(hào)PCR管中，分別取三份50 μ L IOnm金納米粒子(Au2)于2，3及4號(hào)PCR管中，向4個(gè)管中依序各自加入IyL 10 μ M的DNA1, DNA2, DNA3及DNA4,混勻后，向各體系中加入5 μ L5 Xtris-硼酸緩沖液和1.25 μ L IM NaCl溶液，室溫振搖反應(yīng)2小時(shí)；Au1-DNA1 用 6000r/min 離心 10 分鐘，Au2-DNA2, Au2-DNA3 及 Au2-DNA4 用 13000r/min 離心 10分鐘，去除上清液，沉淀加水稀釋至原體積5倍；(5)手性四面體結(jié)構(gòu)的組裝步驟(4 )制備的四種金納米粒子-DNA的復(fù)合物(Au1-DNA1，Au2-DNA2，Au2-DNA3，Au2-DNA4)各取40 μ L混合于PCR管中，加入4μ L IM NaCl溶液，室溫反應(yīng)過夜，形成手性四面體結(jié)構(gòu)。這種手性四面體結(jié)構(gòu)，因?yàn)橐肓舜蟪叽纭⒎乔蛐蔚慕鸺{米粒子，增加了結(jié)構(gòu)的不對(duì)稱性，所以在523nm處有很強(qiáng)的圓二色信號(hào)。(6 )手性四面體檢測目標(biāo)DNA在步驟(5)的制備過程中加入與DNA1完全互補(bǔ)的目標(biāo)DNA，此時(shí)，目標(biāo)DNA會(huì)與Au1-DNA1互補(bǔ)雜交，其他三種金納米粒子-DNA復(fù)合物(Au2-DNA2, Au2-DNA3, Au2-DNA4)組裝形成IOnm金的三聚體結(jié)構(gòu)，此時(shí)手性四面體在523nm處的特征圓二色信號(hào)發(fā)生減弱。根據(jù)523nm處圓二色信號(hào)的比 值與目標(biāo)DNA的濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。本實(shí)驗(yàn)中，DNA的檢測限為0.97fM,線性范圍在 5fM-1000fM。表IDNA的編號(hào)、序列及長度
權(quán)利要求
1.一種基于手性四面體構(gòu)象改變對(duì)目標(biāo)DNA濃度進(jìn)行檢測的方法，其特征在于:包括不同尺寸金納米粒子的合成、金納米粒子修飾輔助DNA、手性四面體的組裝以及目標(biāo)DNA手性傳感器的構(gòu)建； 檢測的目標(biāo) DNA 為:5’ - GGC GAA CTG GTC CCG TCT ACT TAC CGA AAC GCG CAC CTGAGA CCT TCT AAT AGG GAA AGC CGT AAT GTG CAT GTA TCT CCA GGC AAA -3，； 步驟為: (1)30nm金納米粒子Au1的合成 30nm金納米粒子用朽1檬酸三納沸水中還原氯金酸法合成； (2)IOnm金納米粒子Au2的合成 IOnm金納米粒子采用兩步法合成； (3)鉀鹽包裹金納米粒子 步驟(I)合成的30nm金納米粒子Au1及步驟(2)合成的IOnm金納米粒子Au2分別用二水合雙(對(duì)-磺酰苯基)苯基膦化二鉀鹽溶液進(jìn)行包裹使得在0.1-0.5M濃度NaCl溶液中穩(wěn)定存在，從而提高DNA的組裝效率； (4)金納米粒子和輔助DNA偶聯(lián) 所用的輔助DNA共有四種=DNA1, DNA2, DNA3, DNA4 ^NA1為與待測濃度的目標(biāo)DNA完全互補(bǔ)，DNA2, DNA3, DNA4為依據(jù)目標(biāo)DNA而專門設(shè)計(jì)；DNA1:5’ - TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCT ATT AGA AGG TCTCAG GTG CGC GTT TCG GTA AG`T AGA CGG GAC CAG TTC GCC -3’ ；DNA2:5’ - TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GGT TTG CGA CAG TCG TTC AACTAG AAT GCC CTT TGG GCT GTT CCG GGT GTG GCT CGT CGG -3’ ；DNA3:5’ - TTT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCG AAC TGG TCC CGTCTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAA CAG CCC -3’ ；DNA4:5’ - TTT GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GCT TTC CGC AGC GGA GCA GGAGTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GAC TGT CGC -3’ ； 將步驟(3)鉀鹽包裹的Au1和Au2通過巰基與輔助DNA進(jìn)行偶聯(lián)，形成四種不同的金納米粒子-DNA 復(fù)合物=Au1-DNA1, Au2-DNA2, Au2-DNA3, Au2-DNA4 ； (5)手性四面體結(jié)構(gòu)的組裝 將步驟(4)組裝的四種金納米粒子-DNA復(fù)合物等摩爾濃度混合，組裝手性四面體結(jié)構(gòu)，并對(duì)此結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征； (6 )手性四面體檢測目標(biāo)DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于手性四面體構(gòu)象改變對(duì)目標(biāo)DNA濃度進(jìn)行檢測的方法，其特征在于: (1)30nm金納米粒子Au1的合成 30nm金納米粒子Au1的合成方法為:潔凈的三口燒瓶中加入47.5mL超純水，再加入2.5mL 0.2%氯金酸溶液，攪拌并加熱至沸騰，7-8分鐘后快速加入0.75mL 1%檸檬酸三鈉溶液，溶液從無色變?yōu)榧t色后，停止加熱，繼續(xù)攪拌15分鐘；透射電鏡顯示平均粒徑為30nm ； (2)IOnm金納米粒子Au2的合成 IOnm金納米粒子Au2的合成方法為:潔凈的三口燒瓶中加入79mL超純水和ImL 1%氯金酸作為A液；另取一潔凈的小瓶子，加入4mL 1%檸檬酸三鈉，0.1mL 1%單寧酸，0.1mL25mM碳酸鉀，15.8mL超純水作為B液；A、B液均加熱到60°C，然后在高速攪拌下將B液迅速加入A液中，混合液在60°C下繼續(xù)攪拌30分鐘到形成深紅色溶液，然后將溶液加熱回流2分鐘形成亮紅色溶液，最后冷卻到室溫形成檸檬酸穩(wěn)定的金納米粒子，透射電鏡顯示平均粒徑為IOnm ； (3)鉀鹽包裹金納米粒子 分別取步驟(I)制備的30nm金納米粒子Au1及步驟(2)制備的IOnm金納米粒子Au2各自取IOmL 50nM分別置于甲瓶及乙瓶中，甲瓶加入5 μ L 10 mg/mL及乙瓶加入5 μ L 20mg/mL的二水合雙(對(duì)-磺酰苯基)苯基膦化二鉀鹽溶液，室溫震蕩反應(yīng)10小時(shí)；各自用6000r/min及13000r/min,離心10分鐘后去除上清液,加水恢復(fù)到原體積； (4)金納米粒子和輔助DNA偶聯(lián) 步驟(3)制備的鉀鹽包裹的兩種金納米粒子Aui及Au2,分別取一份50 μ L 30nm金納米粒子Au1于I號(hào)PCR管中，分別取三份50 μ L IOnm金納米粒子Au2于2，3及4號(hào)PCR管中，向4個(gè)管中依序各自加入IyL 10 μ M的DNAnDNAyDNA3及DNA4,混勻后，向各體系中加Λ 5yL 5\廿丨8-硼酸緩沖液和1.25 4 1^ IM NaCl溶液，室溫振搖反應(yīng)2小時(shí)；Au1-DNA1用6000r/min 離心 10 分鐘，Au2-DNA2, Au2-DNA3 及 Au2-DNA4 用 13000r/min 離心 10 分鐘，，去除上清液，沉淀加水稀釋至原體積5倍； (5)手性四面體結(jié)構(gòu)的組裝 步驟(4)制備的四種金納米粒子-DNA的復(fù)合物=Au1-DNA1, Au2-DNA2, Au2-DNA3,Au2-DNA4,各取40 μ L混合于PCR管中，加入4 μ L IM NaCl溶液，室溫反應(yīng)過夜，形成手性四面體結(jié)構(gòu)，這種手性四面體結(jié)構(gòu)，因?yàn)橐肓舜蟪叽纭⒎乔蛐蔚慕鸺{米粒子，增加了結(jié)構(gòu)的不對(duì)稱性，所 以在523nm處有很強(qiáng)的圓二色信號(hào)； (6 )手性四面體檢測目標(biāo)DNA 在步驟(5)的制備過程中加入與DNA1完全互補(bǔ)的目標(biāo)DNA，此時(shí)，目標(biāo)DNA會(huì)與Au1-DNA1互補(bǔ)雜交，其他三種金納米粒子-DNA復(fù)合物Au2-DNA2, Au2-DNA3, Au2-DNA4組裝形成IOnm金的三聚體結(jié)構(gòu)，此時(shí)手性四面體在523nm處的特征圓二色信號(hào)發(fā)生減弱；根據(jù)523nm處圓二色信號(hào)的比值與目標(biāo)DNA的濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
全文摘要
一種基于手性四面體構(gòu)象改變對(duì)目標(biāo)DNA濃度進(jìn)行檢測的方法，屬于納米生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括不同尺寸金納米粒子的合成、金納米粒子修飾輔助DNA、手性四面體的組裝以及目標(biāo)DNA手性傳感器的構(gòu)建。本發(fā)明提供了一種利用金納米粒子-DNA復(fù)合物構(gòu)建的手性四面體，通過目標(biāo)DNA與大尺寸金納米粒子上的DNA雜交互補(bǔ)，組裝結(jié)構(gòu)從空間四面體變?yōu)槿垠w，通過圓二色譜法信號(hào)的變化對(duì)目標(biāo)DNA濃度進(jìn)行檢測，目標(biāo)DNA的檢測限為0.97fM，線性范圍在5fM-1000fM。本發(fā)明方法能特異性地對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行快速、超靈敏檢測，為痕量DNA的檢測提供了一種有效的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103103275SQ20131003676
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月30日
發(fā)明者胥傳來, 嚴(yán)文靜, 匡華, 王利兵, 徐麗廣, 馬偉 申請(qǐng)人:江南大學(xué)