一種產(chǎn)油酵母脂滴蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種產(chǎn)油酵母脂滴蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。所述產(chǎn)油酵母脂滴蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)：(a)由SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將SEQ?ID?NO：1的氨基酸經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且具有所述脂滴蛋白相關(guān)活性的由SEQ?ID?NO：1衍生的蛋白質(zhì)。綠色熒光蛋白共定位和油脂發(fā)酵分析證明本發(fā)明的產(chǎn)油酵母脂滴蛋白及其編碼基因能顯著提高細(xì)胞油脂積累和貯存量。本發(fā)明還通過基因異源表達(dá)獲得了可顯著提高油脂積累量的重組工程菌株。本發(fā)明的產(chǎn)油酵母脂滴蛋白及其編碼基因可應(yīng)用微生物油脂、脂肪酸衍生物生產(chǎn)菌株構(gòu)建，以及作為肥胖病人治療藥物篩選的靶標(biāo)。
【專利說明】一種產(chǎn)油酵母脂滴蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種產(chǎn)油酵母脂滴蛋白及其基因與應(yīng)用。具體地，所述產(chǎn)油酵母脂滴蛋白以及編碼其的核苷酸來源于擲孢酵母(SpOTobolomycesroseus)。本發(fā)明還提供一種構(gòu)建油脂生產(chǎn)重組細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]油脂是一種氧含量低、能量密度高、碳鏈長(zhǎng)度適中的可再生資源，可以代替化石資源作為化學(xué)工業(yè)和可再生能源產(chǎn)業(yè)的基本加工原料，是人類從碳?xì)浣?jīng)濟(jì)向碳?xì)溲踅?jīng)濟(jì)過渡的重要鏈接，其市場(chǎng)潛力巨大。自然界中一部分微生物在特定條件下(如氮源缺乏)能在胞內(nèi)貯存超過其細(xì)胞干重20%的油脂，其中以甘油三酯為主，具有這種表型的微生物稱為產(chǎn)油微生物，包括細(xì)菌、酵母、霉菌、藻類等，其中產(chǎn)油酵母包括Rhodotorula, Candida,Cryptococcus, Rhizopus, Trichosporon 和 Yarrowia 屬中的某些菌株[Ratledge C, WynnJ P.Adv Appl Microbiol2002,51,1-51]。利用微生物轉(zhuǎn)化生物質(zhì)資源生產(chǎn)油脂,可發(fā)展成基本不依賴耕地、可連續(xù)生產(chǎn)、降低農(nóng)業(yè)污染、資源綜合利用的新技術(shù)，形成化學(xué)品的石化資源替代品生產(chǎn)新途徑[趙宗保.中國(guó)生物工程雜志2005，25 (2)，8-11]。
[0003]半個(gè)世紀(jì)以來，國(guó)內(nèi)外微生物油脂研究的重點(diǎn)集中在菌株篩選、馴化和發(fā)酵工藝優(yōu)化等領(lǐng)域，取得了重大進(jìn)展。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，單純的菌種篩選和培養(yǎng)工藝的優(yōu)化已不能滿足產(chǎn) 油微生物性狀改良的需要。做為某一化學(xué)品的天然生產(chǎn)菌株，其特定的生產(chǎn)性能往往并非最優(yōu)。如何優(yōu)化或改變工業(yè)菌株的代謝網(wǎng)絡(luò)和表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以提高生物基產(chǎn)品的積累速度或定向控制靶產(chǎn)品的質(zhì)量，是當(dāng)今生物【技術(shù)領(lǐng)域】研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。油脂發(fā)酵研究需要油脂代謝途徑的重構(gòu)和強(qiáng)化，賦予重組菌株生產(chǎn)新型脂肪酸衍生物的性能。由于優(yōu)良土著生產(chǎn)菌株的遺傳背景目前仍不清楚，油脂積累代謝調(diào)控相關(guān)基因克隆有限，尋找更多的油脂積累代謝調(diào)控相關(guān)基因，是目前微生物油脂研究的重要方向之一。
[0004]研究人員發(fā)現(xiàn)，來源于產(chǎn)油微生物(圓紅冬孢酵母和斯氏油脂酵母)的異檸檬酸脫氫酶(IDH)和蘋果酸酶(ME)的編碼基因在土著菌油脂積累過程中有表達(dá)差異，釀酒酵母功能互補(bǔ)分析也證明這些基因可增加重組菌株的油脂含量，但并沒能將一個(gè)非產(chǎn)油菌株成功改造成一個(gè)產(chǎn)油菌株[Yang F, Zhang SF, Zhou YJ, Zhu Zff, Lin XP, Zhao ZK.Appl.Microbiol.Biotechnol.2012,94(4)，1095-1105]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示，微生物油脂積累代謝調(diào)控可能涉及更多的基因及其間的相互調(diào)節(jié)和相互作用。
[0005]脂滴(Lipid droplets)是細(xì)胞內(nèi)中性脂肪貯存的主要場(chǎng)所，直徑從40nm至100 μ m不等，廣泛存在于植物、昆蟲和動(dòng)物細(xì)胞中。其由極性單磷脂層包裹中性脂組成的疏水核心而構(gòu)成，并且表面分布有很多蛋白，成熟脂滴中含量最豐富的表面蛋白是周脂素(perilipin)0做為脂滴相關(guān)蛋白家族(PAT家族)成員，周脂素具有典型的PAT-1結(jié)構(gòu)域(氨基端1-1OOaa);其中間1/4部分為疏水氨基酸組成的脂滴錨定結(jié)構(gòu)域，而羧基端則和保護(hù)甘油三酯不被水解，增加油脂含量功能相關(guān)。Perilipin的功能與其磷酸化狀態(tài)有關(guān)，在基礎(chǔ)狀態(tài)下，perilipin未磷酸化，在脂滴表達(dá)形成一種物理屏障，阻止脂肪酶接觸到脂滴內(nèi)的甘油三酯，從而保護(hù)脂滴內(nèi)中性脂免受降解；在能量低下、營(yíng)養(yǎng)匱乏的條件下，它被蛋白激酶A(PKA)磷酸化，招募激素敏感脂肪酶(HSL)到脂滴表面，水解中性脂，為細(xì)胞提供能量；因此該蛋白在調(diào)節(jié)脂質(zhì)儲(chǔ)存和降解具有重要作用[Bickel PE, Tansey JT, WelteMA.Biochim Biophys Acta.2009,1791(6),419-440][Miura S, Gan Jff, Brzostowski J,Parisi MJ, Schultz CJ, Londos C，Oliver B，Kimmel AR.J Biol Chem.2002，277(35)，32253-32257]。該基因在動(dòng)物與某些子實(shí)體真菌中廣泛存在，但是在釀酒酵母中未發(fā)現(xiàn)周脂素同源蛋白；在動(dòng)物體內(nèi)，周脂素做為一種重要的信號(hào)調(diào)控“開關(guān)裝置”，可以調(diào)控機(jī)體脂肪的儲(chǔ)存和釋放。
[0006] 和動(dòng)物的脂肪細(xì)胞一樣，產(chǎn)油酵母合成的甘油三酯以脂滴的形式貯存在細(xì)胞內(nèi)部，隨著油脂積累量的增加，脂滴不斷變大或相互融合，在油脂積累后期，脂滴幾乎占據(jù)了整個(gè)產(chǎn)油酵母的細(xì)胞大小[Zhu Zff, Zhang SF, Liu HW, Shen HW, Lin XP, Yang F，Zhou YJ,Jin GJ, Ye ML, Zou HF, Zhao ZK.Nat.Commun.2012,3,1112, Supplementary Figure S6]。2007年，在金龜子綠僵菌中首次鑒定了周脂素，并證明它具有保護(hù)脂滴免受降解的作用[Wang C，St Leger RJ.J Biol Chem.2007，282 (29)，21110-21115]。最近，通過脂滴蛋白質(zhì)組學(xué)研究，我們鑒定擲孢酵母(S.roseus)油脂積累期間一種新穎的周脂素(perilipin)樣蛋白高豐度表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)該蛋白的豐度與油脂含量成正比，將其命名為SrLDPl (S.roseuslipid droplet proteinl,擲孢酵母脂滴蛋白I),根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測(cè)該基因與產(chǎn)油微生物油脂積累、貯運(yùn)和代謝調(diào)控密切相關(guān)。截止專利提交日，NCBI上未檢索到關(guān)于擲孢酵母perilipin的任何序列信息。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)油酵母脂滴蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明提供的產(chǎn)油酵母脂滴蛋白，名稱為SrLDPl (S.roseus lipid dropletproteinl,擲孢酵母脂滴蛋白I),來源于擲孢酵母S.roseus JCM8242,是由如下a)或(b)的蛋白質(zhì):
[0009](a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0010](b)將SEQ ID NO:1的氨基酸經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且具有所述脂滴蛋白相關(guān)活性的由SEQ ID NO:1衍生的蛋白質(zhì)。
[0011]其中所述“脂滴蛋白相關(guān)活性”是指促進(jìn)脂滴融合、生長(zhǎng)，增加脂滴內(nèi)油脂積累，穩(wěn)定脂滴形態(tài)與功能，參與油脂貯運(yùn)和代謝調(diào)控相關(guān)的脂滴蛋白活性。
[0012]為了使本發(fā)明的產(chǎn)油酵母脂滴蛋白便于純化，可以在上述(a)或(b)的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0013]表1標(biāo)簽及其序列
[0014]
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)油酵母脂滴蛋白，是下述(a)或(b)的蛋白質(zhì): (a)由SEQID NO:1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將SEQID NO:1的氨基酸經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且具有所述脂滴蛋白相關(guān)活性的由SEQ ID NO:1衍生的蛋白質(zhì)。
2.一種編碼權(quán)利要求1的產(chǎn)油酵母脂滴蛋白的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列是SEQID NO:2所示的DNA分子。
4.包含權(quán)利要求2或3的核苷酸序列的重組載體。
5.一種重組細(xì)胞，所述細(xì)胞導(dǎo)入權(quán)利要求4所述的重組載體。
6.一種構(gòu)建油脂生產(chǎn)重組細(xì)胞的方法，所述方法包括:將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，得到油脂生產(chǎn)重組細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中通過用權(quán)利要求4所述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而導(dǎo)入權(quán)利要求2或3所述的基因。
8.根據(jù)權(quán)利要 求6所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞選自酵母、微藻、紅球菌或大腸桿菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述酵母選自釀酒酵母或擲孢酵母，所述微藻選自衣藻或聚球藻，所述紅球菌是渾濁紅球菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述衣藻是萊茵衣藻。
【文檔編號(hào)】C12R1/89GK103965304SQ201310038897
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2013年1月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月31日
【發(fā)明者】趙宗保, 朱志偉, 張素芳 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所