專利名稱：魚成分檢測實時pcr檢測引物、試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及食品中魚成分檢測實時PCR檢測引物、試劑盒及檢測方法。
背景技術：
水產品是世界經濟貿易的重要組成部分，也是重要的食品蛋白質來源。可食用水產品種類繁多，國際貿易的主要品種有25大種群，僅美國食品藥品管理局列出的可食水產品名單上就有約1700多種。隨著水產品國際貿易的發展和加工水平的提高，特定種類產品供需關系的變化，部分商家用低值水產品假冒高值水產品進行銷售，獲得不當的經濟利益，如將養殖的鱒魚假冒大西洋鮭，將羅非魚、錤鰍魚假冒紅鯛等。也曾有將河豚魚片混入安康魚片導致食用者中毒死亡的案例。由美國National Seafood Inspection Laboratory開展的一項為期9年的調查結果顯示:有37%的魚類產品和13%的其它海洋食品的物種沒有正確標識。最近歐洲和北美進行的市場調查表明，水產品原料錯誤標識率在15-43%，紅鯛產品的錯誤標識率竟高達75%。除了經濟損失之外，該行為還對保護頻臨滅絕物種、食品安全、經濟秩序帶來嚴重危 害。水產加工品的物種真偽鑒定目前已經成為水產加工業中面臨的重要問題。歐盟已經建立了標簽法，強制生產商提供水產品物種證明、產地和生產方法等信息；美國按照食品藥品化妝品聯邦法案的規定，禁止水產品的假冒行為；加拿大食品檢驗局及進口商于2011年12月起嘗試對部分進口海產品進行DNA檢驗。這種檢測主要針對以低值魚冒充高值魚的經濟欺詐情況。為了防止經濟欺詐行為的發生，確保食品安全，有必要針對水產加工品的原料真偽進行鑒定。當水產品未經加工處理、外觀完整時，通常可以通過形態學特征判斷品種的真偽。對于水產加工品如魚糜、烤魚片、生魚片、罐頭、魚粉等，則需要建立基于DNA分析的鑒定方法。河豚魚和安康魚加工成魚片或魚泥之后，很難從形態上加以區別。為了確保食用安全性，防止食用河豚魚中毒，有必要選擇合適的基因片段，建立實用、可行的鑒定實時PCR方法。目前我國在食品中魚成分檢測方法仍是個空白，在保證方法穩定性、特異性等方面存在很多困難，這也是制約方法建立的瓶頸。鑒于水產品原料真偽鑒定在維護貿易公平、保障食品安全、保護瀕危物種等方面的重要性，很多研究人員均對該領域展開了深入研究，建立了一系列的方法并加以應用。EspineiraM等采用PCR測序的FINS方法鑒定鯛、羅非魚、鯖魚、鮫錬魚、比目魚、鮭魚。DNA條形碼計劃是FINS技術中的重要組成部分，該計劃是利用一段被稱作DNA條形碼的序列(C0I)通過PCR測序和分析將物種鑒定標準化的一項全球性項目。到目前為止，已有93%的淡水魚物種和98%的海洋魚物種可以通過該方法準確鑒別。Rasmussen R S，Rea S和HsiehC H分別利用PCR-RFLP進行魚醬、河豚魚肉、鮭魚與鱒魚等海洋食品的鑒定。Rehbein H等利用PCR-SSCP法進行鮭魚、沙丁魚、鰻魚、金槍魚、鰹魚、鱘魚等多種魚的鑒定。LowensteinJ H等采用RAro方法用于鯰魚等遺傳分析與鑒定。最近有報道針對DNA條形碼，利用物種特異性多重PCR成功鑒定鯊魚、比目魚、鰹魚、鯖魚、鮭魚和鱒魚。Taylor等根據ATPase6和ATPase8基因建立了多重Real-time PCR方法，用來鑒定三種具有重要商業價值的鱈魚。此夕卜，Rasmussen、Itoi S和Lopez I分別采用TaqMan MGB探針用于鰻魚、金槍魚、鮭魚和鱒魚的鑒定，Bayha K Mort等采用TaqMan LNA探針用于真鯛和美國紅魚的鑒定。2004年，法國率先開發出用于食品與動物飼料檢測的DNA芯片FoodExpert-1D系統，可同時分析超過數十種新鮮的或加工過的脊椎動物，包括15種魚類。Chisholm J等將FoodExpert-1D系統與Real-time PCR進行了比較,表明具有很好的適用性。Kochzius等針對歐盟重要的11種進口魚類建立了一種DNA芯片。每種方法都有各自的優勢和不足。PCR測序法在速度與成本這兩方面沒有優勢。PCR-RFLP方法的分析步驟比較多，相當費時。SSCP的高靈敏度要求很高程度的可重復性，每一次的實驗條件要沒有差別。PCR-RAPD的主要缺點在于該方法的可重復性，尤其是目標DNA的量少或輕微降解時，這個缺點尤其突出。AFLP方法相對費時，沒有大規模應用。DNA芯片與其它方法相比，樣本分析相對較慢并且成本過高。Real-time PCR方法具有成本低、操作簡便的特點，特別適用于對混合樣品的鑒定，應用最為廣泛。但是該方法只能用一對特異性的引物分析一個物種，在通用性上受到很大限制。

發明內容
為了解決上述實際問題，本發明建立了一種魚成分檢測實時PCR檢測引物、試劑盒及檢測方法。提取樣品DNA，以DNA為模板，分別采用特異性檢測引物和探針進行實時熒光PCR擴增，直接讀取實時熒光PCR的增幅現象，能夠對食品中的魚成分進行鑒定。本發明 的一方面在于:公開一種魚成分檢測用引物與探針，其包括堿基序列SEQID N0.f 3。本發明建立對魚物種的真偽鑒別，本發明在使用了歐洲分子生物學實驗室的數據庫(gene databanks, EMBL)和BOL、FishTrace參考序列數據庫，比較了其中足夠多的魚的種間數據。在一些侯選基因片段中，選擇了魚物種12s基因片段進行設計引物和探針，采用DNAMAN8.0軟件，據此設計了本發明用于檢測的魚成分的檢測引物和探針，序列信息見表I。在引物的設計上對引物和探針的退火溫度的一致性，GC含量的相似性等因素進行了充分的考慮，引物和探針由寶生物工程(大連)有限公司合成。表I魚特異性檢測弓I物和探針序列
權利要求
1.一種食品中魚成分檢測用引物與探針，其特征在于，包括以下堿基序列: 上游引物:SEQ ID N0.1 下游引物:SEQ ID N0.2 探針:SEQ ID N0.3。
2.一種食品中魚成分實時熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于:包括權利要求1所述魚成分檢測用引物與探針。
3.一種食品中魚成分的實時熒光PCR檢測方法，其特征在于:利用權利要求1所述的引物與探針，對樣品DNA進行實時熒光PCR方法檢測。
4.根據權利要求3所述的食品中魚成分的實時熒光PCR檢測方法，其特征在于:所述的對樣品DNA進行實時熒光PCR方法檢測為: ①實時熒光PCR反應體系: 反應體系總體積為25ii L，其中:
全文摘要
本發明公開了食品中魚成分的實時熒光PCR檢測引物、試劑盒及檢測方法。該方法針對魚的特異性基因序列，設計了魚基因的檢測用引物和探針SEQ ID NO.1~3，采用實時熒光PCR法對食品中魚成分的定性檢測。本發明所研制的食品中魚成分的實時熒光PCR法定性檢測方法、對提高食品中魚成分成份的檢測效率及靈敏度，降低檢測成本，檢測市場上相關假冒產品，進行食品安全監測和提高檢驗技術具有重要意義，具有廣闊發展前景。
文檔編號C12N15/11GK103103281SQ20131004192
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月4日 優先權日2013年2月4日
發明者曹際娟, 李晶泉, 徐君怡, 徐楊 申請人:曹際娟, 李晶泉, 徐君怡, 徐楊