生物轉化法生產核苷類藥物中間體阿糖胞苷的方法
【專利摘要】本發明公開了一種生物轉化法生產阿糖胞苷的方法。該方法是將瑞士乳桿菌種子液接入發酵培養基中發酵培養，得到粗菌體，將緩沖溶液加入粗菌體，制成細胞懸浮液，向所述細胞懸浮液中加入阿糖尿苷和胞嘧啶進行酶促反應，獲得阿糖胞苷。所述發酵培養基由下列重量份的物質組成：酵母浸粉10-50份，葡萄糖1-10份，蛋白胨1-15份，硫酸氨1-7份，磷酸氫二鉀2-12份，玉米漿2-17份，氯化鈣0.5-6份，水1000份。本發明是生物轉化法生產阿糖胞苷，充分利用酶的高效性、專一性和溫和性，與傳統化學合成方法相比，具有選擇性高、條件溫和、工藝簡單、成本低和污染小等特點。
【專利說明】生物轉化法生產核苷類藥物中間體阿糖胞苷的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物轉化法生產阿糖胞苷的方法。
【背景技術】
[0002]阿糖胞苷是目前治療急性非淋巴白血病有效的一線藥物之一，屬于抗代謝類化療藥物中嘧啶類似物，是2’ -脫氧胞苷的結構類似物，同時又是細胞周期特異性藥物。主要用于急性白血病，其中對急性粒細胞白血病療效最好，對急性單核細胞白血病及急性淋巴細胞白血病也有效。臨床應用上，一般均與其他藥物合并應用，對惡性淋巴瘤、肺癌、消化道癌、頭頸部癌有一定療效，對病毒性角膜炎及流行性結膜炎等也有一定療效。
[0003]目前阿糖胞苷的制備方法主要是化學合成法。湖南醫藥工業研究所等較早報道了阿糖胞苷鹽酸鹽的合成方法(中國醫藥工業，1972年07期，12-16)。該工藝由D-阿拉伯糖(I)起始，經甲醚化(II)，2，3，5位保護羥基得到(III)，水解分離出1-位羥基物(IV)，并轉為對硝基苯甲酸酯(V)，繼而形成氯代糖(VI)，再與二甲氧嘧啶縮合(VII)、氨化(VIII)、氫化(IX)、成鹽⑴、精制而得到阿糖胞苷鹽酸鹽。德國專利DE2027305A和DE2601399A公開了以阿拉伯糖為初始原料進行全合成阿糖胞苷的方法，工藝較簡單，但所用原料丙炔酰胺(HC = CCN)的制備復雜，且易爆；還使用有毒物質氨基氰(H2NCN),對環境和人員健康有害。文獻(J.Chem.Soc.Perkin.Trans I，1982，1171-1176)報道以阿糖尿苷為起始原料，與乙酐在吡啶中反應合成阿糖尿苷乙酯，然后三氮唑、三氯化磷和三乙胺在乙腈中反應后，再與阿糖尿苷乙酯反應得中間體II，最后與氨水、二氧六環混合物反應，再與甲醇氨反應得阿糖胞苷。該路線中吡啶和乙腈用量大，每克阿糖尿苷所用吡啶和乙腈用量分別在10克和22克以上，難以回收，對環境污染大，對操作人員健康不利；另外，三乙胺、三氯化磷和三氮唑用量也大。生產成本高，終產品純度較低。專利(CN101948492A，2011年)報道了采用以阿糖尿苷為原料，與六甲基二硅胺烷(HMDS)在5-20kg公斤壓力和70-160°C溫度條件下反應10-80小時后，中間產物(II)在有機溶劑進行水解得到阿糖胞苷。方法工藝較簡單，收率也較高，但使用的HMDS溶劑用量大；且制備中間體II需高溫高壓條件，對設備要求高。
[0004]從上可知，化學法生產阿糖胞苷步驟多，條件苛刻，大量使用有機溶劑，環境污染較嚴重，且生產成本高，工藝復雜。
[0005]目前，國內外對于生物轉化法生產阿糖胞苷的文獻報道很少。本發明以阿糖尿苷和胞嘧啶為原料，在全細胞下進行一步生物催化反應，從而得到阿糖胞苷。該方法選擇性高、純度高、條件溫和、成本低和污染小，具有重要的應用價值。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種生物轉化法生產阿糖胞苷的方法。
[0007] 本發明所提供的生產阿糖胞苷的方法，是將瑞士乳桿菌種子液接入發酵培養基中發酵培養，得到粗菌體，加入緩沖溶液得到細胞懸浮液。然后加入底物阿糖尿苷和胞嘧啶進行生物催化反應，獲得阿糖胞苷轉化液。離心，調節溶液PH，柱層析，解析，濃縮得到高純度-1r 口
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[0008]其中，所述發酵培養基由下列重量份的物質組成:酵母浸粉10-50份，葡萄糖1-10份，蛋白胨1-15份，硫酸氨1-7份，磷酸氫二鉀2-12份，玉米漿2-17份，氯化鈣0.5-6份，水1000份。
[0009]所述發酵培養基優選由下列重量份的物質組成:酵母浸粉20-45份，葡萄糖2-5份，蛋白胨5-10份，硫酸氨2-5份，磷酸氫二鉀5-10份，玉米漿5-15份，氯化鈣1_5份，水1000 份。 [0010]所述發酵培養的溫度為30-42°C，優選為37-40°C;攪拌轉速為120-160轉/分鐘，優選140-160轉/分鐘；pH值為6.0-7.5，優選6.0-6.5 ;發酵時間為24-36小時。
[0011]所述瑞士乳桿菌種子液與所述發酵培養基的體積比為10% -15%。
[0012]所述瑞士乳桿菌種子液是按照如下方法獲得:將瑞士乳桿菌接種到斜面培養基培養制成斜面菌種，將所述斜面菌種接入發酵培養基中培養獲得種子液；所述斜面培養基由下列重量份的物質組成:葡萄糖10-20、蛋白胨10-20、酵母膏3-8、檸檬酸胺1_2、磷酸氫二鉀1-2、硫酸鈉5-10、硫酸錳0.02-0.4，瓊脂15-20和水1000。[酵母浸粉5-20份，葡萄糖
0.5-2.5份，蛋白胨1-6份，磷酸氫二鉀3-12份，玉米漿0.3-1.5份，氯化鈉0.5-6份，瓊脂15-20份和水1000份]。
[0013]所述斜面培養基優選由下列重量份的物質組成:酵母浸粉10-15份，葡萄糖1-2份，蛋白胨2-5份，磷酸氫二鉀5-10份，玉米漿0.5-1份，氯化鈉1-5份，瓊脂15-20份和水1000 份。
[0014]所述瑞士乳桿菌接種到斜面培養基培養的溫度為30_42°C，優選37_40°C ；pH為
6.5-8.0，培養 24-48 小時。
[0015]所述菌體液按照如下方法制備:將所述粗菌體用檸檬酸緩沖液洗滌，然后用PH6.0-7.0磷酸緩沖液懸浮，獲得細胞懸浮液。
[0016]所述檸檬酸緩沖液的pH6.0-7.0,優選為pH6.5-7.0。所述磷酸緩沖液的pH值優選為6.0，磷酸緩沖液的濃度為10-20mmol/L。所述細胞懸浮液中菌體的質量百分含量為5% -35%，優選為 10%。
[0017]所述底物中，阿糖尿苷加入濃度為20_40g/L，胞嘧啶加入濃度為10_20g/L。
[0018]所述生物催化反應條件是，反應溫度30-65°C，反應時間12_24h，離心，獲得含有阿糖胞苷的溶液，溶液經HPLC檢測，阿糖尿苷的轉化率達80%以上。
[0019]所述調節溶液pH是將pH值調節至5-8，然后上樣于所述層析柱中，依次用碳酸鈉水溶液和乙醇水溶液進行洗脫，收集用所述乙醇水溶液洗脫得到的洗脫液。
[0020]所述層析柱中的介質為離子交換樹脂或大孔吸附樹脂。
[0021]所述離子交換樹脂優選為陰離子型樹脂。常用的由公開商業途徑購買所得陰離子交換樹脂如717型陰離子型樹脂、D201型陰離子型樹脂或D290型陰離子型樹脂，優選717型陰離子型樹脂；常用的由公開商業途徑購買所得大孔吸附樹脂如DlOl型大孔吸附樹脂、DM18型大孔吸附樹脂、HPD722型大孔吸附樹脂或AB-8型大孔吸附樹脂，優選DlOl型大孔吸附樹脂。
[0022]本發明是生物轉化法生產阿糖胞苷，充分利用酶的高效性、專一性和溫和性，與傳統化學合成方法相比，具有選擇性高、條件溫和、工藝簡單、成本低和污染小等特點。[0023]本發明的生物轉化法生產阿糖胞苷，所用菌株為瑞士乳桿菌，瑞士乳桿菌轉化產物簡單，副產物極小；通過大孔吸附樹脂分離純化，純度可達到99%以上；本發明的生物轉化法生產阿糖胞苷，產量可達20g/L以上，阿糖尿苷轉化率可達80%以上。
【具體實施方式】
[0024]實施例1、生物轉化法生產阿糖胞苷
[0025](I)菌種斜面培養
[0026]將瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus) CGMCC1.1877 (中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)接種到斜面培養基，37°C、pH值6.5，培養24小時制成斜面菌種；斜面培養基由下列重量份的組分組成:
[0027]酵母浸粉10份，葡萄糖1份，蛋白胨5份，磷酸氫二鉀5份，玉米漿0.5份，氯化鈉2份，瓊脂15份和水1000份。
[0028](2)接種發酵
[0029]將斜面菌株接入發酵培養基中擴大培養作為種子液；將種子液按10% (體積百分比)的接種量接入裝有發酵培養基的發酵罐中37°C，160轉/分鐘，pH值為6.0，發酵36小時；發酵培養基由下列重量份的組分組成:
[0030]酵母浸粉35份 ，葡萄糖4份，蛋白胨5份，硫酸氨3份，磷酸氫二鉀6份，玉米漿I份，氯化鈣2份，水1000份。
[0031](3)生產阿糖胞苷
[0032]a)發酵液在4°C、8000轉/分鐘、離心20分鐘，收集濕菌體；
[0033]b)檸檬酸緩沖液(PH6.5)洗滌步驟a)菌體，4°C離心10分鐘，收集濕菌體，稱重，用磷酸緩沖液(PH6.0，10mmol/L)重懸菌體，制成10% (濕菌體重量和緩沖液的體積比)的細胞懸浮液；
[0034]c)向步驟b)的懸浮液中加入底物混合后40°C反應24小時，底物含有20g/L阿糖尿苷和20g/L胞嘧啶。
[0035]HPLC 檢測(色譜柱:Diamonsil C18, 5um, 250x4.6mm ;流動相:甲醇:0.01mol 憐酸緩沖鹽=20: 80 ;流速:0.9ml/min ;檢測波長:254nm)阿糖尿苷轉化為阿糖胞苷的轉化率達92 %，每升發酵液中含有阿糖胞苷18.4g/L。
[0036](4)阿糖胞苷的分離純化
[0037]發酵液用IN NaOH調節pH到中性，高速離心機離心20分鐘得上清液，上清液過AB-8大孔吸附樹脂，用碳酸鈉水溶液(2% )洗到流出液為近無色，然后用20%乙醇洗3個柱體積，30%乙醇洗2個柱體積，最后用50%乙醇從樹脂上解吸出含阿糖胞苷解吸液，HPLC檢測，收集阿糖胞苷含量在50%以上的解吸液，然后濃縮得阿糖胞苷，收率為92%，純度為99.2%。
[0038]實施例2、生物轉化法生產阿糖胞苷
[0039](I)將瑞士乳桿菌CGMCC 1.1877接種到斜面培養基，40°C，pH6.5，培養24小時制成斜面菌種；斜面培養基由下列重量份的組分組成:
[0040]酵母浸粉12份，葡萄糖1.5份，蛋白胨2.5份，磷酸氫二鉀5份，玉米漿0.75份，氯化鈉2份，瓊脂17份和水1000份。[0041](2)接種發酵
[0042]將斜面菌株接入發酵培養基中擴大培養作為種子液；將種子液按20% (體積百分比)的接種量接入裝有發酵培養基的發酵罐中37°C，140轉/分鐘，pH值為6.5，發酵36小時；發酵培養基由下列重量份的組分組成:
[0043]酵母浸粉40份，葡萄糖4份，蛋白胨8份，硫酸氨5份，磷酸氫二鉀10份，玉米漿10份，氯化鈣3份，水1000份。
[0044](3)生產阿糖胞苷
[0045]d)發酵液在4°C、10000轉/分鐘、離心10分鐘，收集濕菌體；
[0046]e)檸檬酸緩沖液(PH6.0)洗滌步驟a)菌體，4°C離心10分鐘，收集濕菌體，稱重，用磷酸緩沖液(PH6.0，15mmol/L)重懸菌體，制成10% (濕菌體重量和緩沖液的體積比)的細胞懸浮液；
[0047]f)向步驟e)的細胞懸浮液中加入底物混合后55°C反應24小時，底物含有40g/L阿糖尿苷和20g/L胞嘧啶。
[0048]HPLC檢測(色譜柱:Diamonsil C18, 5um, 250x4.6mm ;流動相:甲醇:0.01mol 憐酸緩沖鹽=20: 80 ;流速:0.9ml/min ;檢測波長:254nm)脫氧胸苷轉化為阿糖胞苷的轉化率達82 %，每升發酵液中含有阿糖胞苷32.8g/L。
[0049](4)阿糖胞苷的分離純化 [0050]發酵液用IN NaOH調節pH到中性，高速離心機離心20分鐘得上清液，上清液過D-101大孔吸附樹脂，用碳酸鈉水溶液(2%)洗到流出液為近無色，然后用20%乙醇洗3個柱體積，用55%乙醇從樹脂上解吸出含阿糖胞苷解吸液，HPLC檢測，收集阿糖胞苷含量在50 %以上的解吸液，然后濃縮得阿糖胞苷，收率為90 %，純度為99.1 %。
【權利要求】
1.一種生產阿糖胞苷的方法，是將瑞士乳桿菌種子液接入發酵培養基中發酵培養，得到粗菌體，加入緩沖液制成細胞懸浮液，向所述細胞懸浮液中加入底物阿糖尿苷和胞嘧啶進行生物轉化反應，獲得阿糖胞苷轉化液。離心，調節溶液pH，柱層析，解析，濃縮得到高純度阿糖胞苷。
2.根據權利要求所述的方法，其特征在于:采用生物轉化法生產阿糖胞苷。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述發酵培養基由下列重量份的物質組成:酵母浸粉20-45，葡萄糖2-5，蛋白胨5-10，硫酸氨2_5，磷酸氫二鉀5_10，玉米漿5_15，氯化鈣1-5，水1000 ;所述發酵培養的溫度為30-42°C，攪拌轉速為120-160轉/分鐘，pH值為6.0-7.5，發酵時間為24-36小時。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述瑞士乳桿菌種子液與所述發酵培養基的體積比為10% -15%。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于:所述瑞士乳桿菌種子液是按照如下方法獲得:將瑞士乳桿菌接種到斜面培養基培養制成斜面菌種，將所述斜面菌種接入發酵培養基中培養獲得種子液；所述斜面培養基由下列重量份的物質組成:酵母浸粉10-15份，葡萄糖1-2份，蛋白胨2-5份，磷酸氫二鉀5-10份，玉米漿0.5-1份，氯化鈉1_5份，瓊脂15-20份和水1000份。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于:所述瑞士乳桿菌接種到斜面培養基培養的溫度為30-42°C, pH為6.5-8.0，培養24-48小時。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于:所述細胞懸浮液按照如下方法制備:將所述粗菌體用檸檬酸緩沖液洗 滌，然后用PH6.0-7.0磷酸緩沖液懸浮，獲得細胞懸浮液。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于:所述檸檬酸緩沖液的pH6.0-7.0 ;所述磷酸緩沖液的PH6.0，濃度為10-20mmol/L。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述生物轉化反應的溫度為35-65°C。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述底物阿糖尿苷加入濃度為20-40g/L，胞嘧啶加入濃度為10-20g/L。
11.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述層析柱中的介質為離子交換樹脂或大孔吸附樹脂。
【文檔編號】C12R1/225GK103966281SQ201310044260
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月5日 優先權日:2013年2月5日
【發明者】朱嘉震, 史峻嵩, 李海存, 王穎, 趙新遠, 尹傳祥, 王金才 申請人:山東斯遞爾化工科技有限公司