一種重組牛源性胰蛋白酶的制備方法
【專利摘要】本發明提供了重組牛源性胰蛋白酶（TRY）的制備方法以及所用的重組牛源性胰蛋白酶原類似物。本發明是在大腸桿菌系統中表達TRY酶原類似物的方法，表達量高，更進一步提供無需經過變性和復性的可溶性表達方法，在直接酶切去除前肽后即可得到有活性的TRY，并且后續的純化步驟也簡單方便。制備的重組牛源性胰蛋白酶可用于生產重組人胰島素及人胰島素類似物。
【專利說明】一種重組牛源性胰蛋白酶的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及牛源性胰蛋白酶原類似物，具體地說，涉及重組牛源性胰蛋白酶原類似物，還涉及應用該類似物制備胰蛋白酶的方法。
【背景技術】
[0002]胰蛋白酶(胰蛋白酶，簡稱TRY，EC 3.4.21.4)是一種由胰腺分泌的肽鏈內肽酶。胰腺最初分泌沒有活性的胰蛋白酶原，然后在小腸內經過胰蛋白酶或腸激酶的活化成為有活性的胰蛋白酶，有活性的胰蛋白酶又能自動催化活化更多胰蛋白酶原。牛源性胰蛋白酶含223個氨基酸殘基，分子量為23.3kDa。
[0003]胰蛋白酶能選擇地水解蛋白質中所有的由賴氨酸Lys或精氨酸Arg的羧基所構成的肽鏈，其不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體而起到活化酶原的作用。胰蛋白酶是特異性最強的蛋白酶，在決定蛋白質的氨基酸排列的步驟中，它成為不可缺少的工具。
[0004]胰蛋白酶在臨床上用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創傷性損傷、瘺管等所產生的局部水腫、血腫及膿腫等，其還常用于動物細胞培養前對組織的處理。在基因工程領域，胰蛋白酶也獲得了越來越廣泛的應用，特別在重組人胰島素及人胰島素類似物的生產過程中，胰蛋白酶是不可或缺的工具酶，其比活性的高低及穩定性是影響胰島素原活化收率的一個至關重要的參數。這其中尤以牛源性胰蛋白酶(Trypsin Bovine)作為目前被研究最多的胰蛋白酶之一，被廣泛應用。
[0005]目前制備活性胰蛋白酶的方法主要包括兩種:一種是從動物如豬、牛的胰臟中提取，該方法相對簡單，但是該方法目前并不能完全去除其他蛋白質，并且還可能使所制備的胰蛋白酶中含有感染物質，如病毒、朊病毒等，因此應用存在一定的局限性；另一種是采用基因重組的方法制備，例如在大腸桿菌中通過基因重組的方法制備人源或豬源胰蛋白酶，該方法先經表達得到不具活性的胰蛋白酶原包涵體，然后使胰蛋白酶原包涵體經過變性、復性過程，再經過酶切切去酶原的前肽部分，才能得到有活性的酶。而在所述變性、復性過程中，復性率不可能達到100%，因此該方法費時費力，產率不高。中國專利200910055493.8公開了一種可溶性表達重組胰蛋白酶的方法，但是該方法只涉及人源性胰蛋白酶，而且需要連接40-200個氨基酸的前肽才能掩蓋胰蛋白酶的天然活性。由此可知，目前采用基因重組制備的主要是人源性和豬源性胰蛋白酶，但是在將胰蛋白酶作為工具酶實際應用于蛋白質酶切時，人源性和豬源性的胰蛋白酶不如牛源性的應用效果好，即用人源和豬源胰蛋白酶酶切某些重組融合蛋白時效果不佳，收率很低，這可能是因為不同物種胰蛋白酶氨基酸序列的差異性會導致酶切行為的不同。
[0006]而目前，還沒有關于在大腸桿菌中制備重組牛源性胰蛋白酶的報導，也沒有可溶性表達牛源胰蛋白酶的報導。這可能是由于牛源性胰蛋白酶具有六對二硫鍵，一定程度上造成其在大腸桿菌中表達時難以形成正確構象且易于自溶。因此，現在仍需要表達量高，活性好且適用于生產的重組胰蛋白酶，以及新的制備活性胰蛋白酶的方法，既能夠高水平地重組表達胰蛋白酶，又能夠很簡單方便地進行表達后的處理工藝。

【發明內容】

[0007]為了解決現有的上述問題，本發明的目的是提供一種重組牛源性胰蛋白酶原類似物以及應用該酶原類似物制備牛源胰蛋白酶的方法，該方法實現了在大腸桿菌中高產量的制備牛源性胰蛋白酶。
[0008]本發明的另一個目的是提供一種在大腸桿菌中可溶性表達牛源性胰蛋白酶原類似物的方法，將該方法制備得到的牛源性胰蛋白酶原類似物直接酶切去除前肽后即可得到有活性的胰蛋白酶，并且后續的純化步驟也簡單方便。
[0009]因此，為了實現本發明的目的，本發明采用如下的技術方案: [0010]首先，本發明提供一種重組牛源性胰蛋白酶原類似物，其序列結構從N端到C端依次包括A1-A2-A3，其中Al序列由1_4個氨基酸組成，所述氨基酸選自A、F、P、V、D、S或K，A2序列為TRY酶切位點序列，A3序列為具有牛源性胰蛋白酶活性的蛋白質序列。
[0011]上述胰蛋白酶原類似物被酶切后具有胰蛋白酶活性。本發明前肽序列Al的引入，只在N端加了 1-4個氨基酸，不僅能夠在和胰蛋白酶共同表達時掩蓋胰蛋白酶的活性，副作用小，使胰蛋白酶高表達，還可以幫助該胰蛋白酶原類似物折疊成正確的蛋白質三維結構，從而實現在大腸桿菌中表達牛源胰蛋白酶。此外，通過各方面的調節，例如N端加入特定的氨基酸、采用可溶性表達載體等，還能進一步實現可溶性表達，對后續操作影響較小，純化后經酶切激活，不需要變性復性，可獲得有活性的重組牛源性胰蛋白酶。在本發明優選的實施方式中，所述Al序列選自AFPV、V、S或AFPS。
[0012]其中A2序列所述的TRY酶切位點序列，為本領域技術人員公知的技術，任何現有技術中的TRY酶切位點序列都可應用于本發明，例如但不限于由1-7個氨基酸組成，所述氨基酸選自R、S、D、N或K。在本發明優選的實施方式中，所述TRY酶切位點序列為DDDDK。
[0013]其中A3序列所述的具有胰蛋白酶活性的蛋白質是指牛源性胰蛋白酶。
[0014]在本發明優選的實施方式中，所述的重組牛源性胰蛋白酶原類似物，其結構包含選自 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO: 2 或 SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO:4 的氨基酸序列。
[0015]在本發明更優選的實施方式中，所述的重組牛源性胰蛋白酶原類似物，其結構的N端包括組氨酸標簽，即所述胰蛋白酶原的結構從N端到C端依次為組氨酸標簽-A1-A2-A3。需要說明的是，所帶的組氨酸標簽并不是必需的，若所選的載體中自帶組氨酸標簽，則表達產物的N端帶有該標簽，以便于進一步純化。
[0016]本發明還提供編碼所述的重組牛源性胰蛋白酶原類似物的核苷酸序列。
[0017]其中編碼所述具有胰蛋白酶活性的蛋白質的核苷酸序列可根據所用宿主的密碼子偏好性來確定，以增加宿主的表達效率。該確定方法為本領域技術人員所公知的技術，具體的核苷酸序列的確定方法可參見例如內蒙古大學學報:大腸桿菌和酵母密碼子使用對t匕，2006, Vol.37, N0.1:34-39。在本發明優選的實施方式中，是采用大腸桿菌為宿主，所用的模版是編碼天然牛源性胰蛋白酶原的核苷酸序列，具體是SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
[0018]在本發明優選的實施方式中，編碼所述的重組牛源性胰蛋白酶原類似物的核苷酸序列包含SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9或SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列。
[0019]本發明進一步提供一種表達載體，包含編碼所述重組牛源性胰蛋白酶原類似物的核苷酸序列。所述的載體還可包含與所述核苷酸序列操作性相連的表達調控序列，以便于所述重組牛源性胰蛋白酶原的表達。
[0020]另外，本發明提供一種重組牛源性胰蛋白酶的制備方法，該方法是以大腸桿菌作為表達宿主的包涵體表達方法，包括以下步驟:
[0021]I)通過引物對編碼胰蛋白酶酶原的SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列進行PCR擴增；
[0022]2)將擴增后的產物與質粒整合得到重組胰蛋白酶酶原表達載體，其中所述重組胰蛋白酶酶原表達載體載有編碼本發明所述重組胰蛋白酶原類似物的核苷酸序列；
[0023]3)將上述載體轉化 至大腸桿菌宿主；
[0024]4)誘導上述大腸桿菌宿主表達胰蛋白酶酶原包涵體；
[0025]5)將上述包涵體變性復性得到胰蛋白酶酶原；
[0026]6)純化上述胰蛋白酶酶原；
[0027]7)酶切上述純化后的胰蛋白酶酶原，生成胰蛋白酶；
[0028]8)純化上述胰蛋白酶。
[0029]通過上述方法能夠獲得較高活性的牛源性胰蛋白酶。
[0030]為了進一步提高活性蛋白的產量，本發明還提供一種重組牛源性胰蛋白酶的制備方法，該方法是以大腸桿菌作為表達宿主的可溶性表達方法，包括以下步驟:
[0031]I)通過引物對編碼胰蛋白酶酶原的SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列進行PCR擴增；
[0032]2)將擴增后的產物與質粒整合得到重組胰蛋白酶酶原表達載體，其中所述重組胰蛋白酶酶原表達載體載有編碼本發明所述重組胰蛋白酶原類似物的核苷酸序列；
[0033]3)將上述載體轉化至大腸桿菌宿主；
[0034]4)誘導上述大腸桿菌宿主表達胰蛋白酶酶原；
[0035]5)純化上述胰蛋白酶酶原；
[0036]6)酶切上述純化后的胰蛋白酶酶原，生成胰蛋白酶；
[0037]7)純化上述胰蛋白酶。
[0038]其中步驟2)所述質粒可以為任意一種能夠有助于蛋白形成可溶性表達的質粒。在本發明優選的實施方式中，所述質粒選自pET28a、pBV220、pQE30、pET32a、pNJUTRX-KpET21a其中之一。
[0039]其中步驟3)所述大腸桿菌宿主作為目的蛋白的表達系統，為本領域的公知技術，因此本發明的方法對大腸桿菌宿主的種類沒有任何限制。優選那些能夠直接表達構象正確的目的蛋白的宿主，無需后續的變性和復性過程。在本發明優選的實施方式中，所述大腸桿菌菌株可選自 DH5a、HB101、JM109、T0P10、BL21、M110、SCSllO 其中之一。
[0040]其中步驟4)所述誘導宿主表達蛋白的方法可采用本領域技術人員所公知的技術，例如參見Qiagen: Protein expression and purification Protocol。在本發明優選的實施方式中，是在誘導表達過程中，使用濃度為0.1mM至IOmM的IPTG (異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)在15°C至37°C溫度下進行誘導，使得目的蛋白可以獲得更高效的表達。[0041]其中步驟5)所述純化胰蛋白酶酶原的方法可采用本領域技術人員所公知的技術，具體方法可參見例如Qiagen: Protein expression and purification Protocol。例如米用離子交換和苯基疏水層析方法。
[0042]在本發明優選的實施方式中，是在所述胰蛋白酶原的結構中包含組氨酸標簽，帶有該組氨酸標簽的表達產物易于純化收集，回收率更高。這時純化步驟是采用Ni2+-NTA基質進行，并通過梯度為20mM至250mM的咪唑溶液洗脫或pH梯度洗脫N端帶有組氨酸標簽的胰蛋白酶酶原，可以有效的將帶有組氨酸標簽的目的蛋白跟雜蛋白分開，得到純度極高活性蛋白。
[0043]其中步驟6)所述酶切方法可采用本領域技術人員所公知的腸激酶或胰蛋白酶酶切方法，具體方法可參見例如上海索萊寶生物科技有限公司的產品說明書。
[0044]其中步驟7)所述純化胰蛋白酶的步驟無需洗脫而用PBS緩沖液收集透過即可獲得胰蛋白酶產品。活性測定表明利用大腸桿菌可溶性表達制備得到的重組牛源性胰蛋白酶與經變性復性制備得到的重組牛源性胰蛋白酶的活性相似。
[0045]與現有技術相比，本發明所提供的重組牛源性胰蛋白酶原類似物，以及制備重組牛源性胰蛋白酶的方法具有以下優點:
[0046]1、通過在重組牛源性胰蛋白酶原中引入Al序列，實現了在大腸桿菌系統中表達牛源性胰蛋白酶原類似物，從而相應的制備牛源性胰蛋白酶。
[0047]2、采用的大腸桿菌表達系統具有可控性高、方便操作的優點，相比于其他表達系統表達量通常較高。
[0048]3、在可溶性表達系統中進行重組表達，表達產物胰蛋白酶酶原結構與胰蛋白酶相似，無需經過變性和復性，且產量較高，其存在于菌體中，在直接酶切去除前肽后即可得到結構正確且有活性的胰蛋白酶。
[0049]4、胰蛋白酶對菌體有降解作用，同時還有一定的自溶現象，本方法所獲得的是沒有活性的酶原，因此基本上消除或抑制了上述現象。
[0050]5、表達生成N端帶有組氨酸標簽(His tag)的胰蛋白酶酶原有利于純化收集，使得酶原在后續的親和純化過程中，能夠使純化產物保留在洗脫液中，純化產物體積小，不需后續濃縮步驟。
[0051]6、使用本方法獲得的胰蛋白酶即可用于本方法中的酶切反應，無需再使用其他工具酶，既不引入雜蛋白又節約成本，可實現連續生產。
[0052]7、酶切后，胰蛋白酶失去組氨酸標簽，酶切產物純化時無需經過洗脫即可達到純化目的，獲得胰蛋白酶。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0053]圖1為采用本發明的方法制備得到的實施例1、3、5、7重組胰蛋白酶原類似物的SDS-PAGE電泳檢測圖。
[0054]圖2為采用本發明的方法制備得到的實施例1、3、5、7重組胰蛋白酶原類似物的western-blot 檢測圖。
【具體實施方式】[0055]下面結合實施例對本發明作進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發明的保護范圍。如本文所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構成”、“基本上由……構成”和“由……構成”。
[0056]材料:
[0057]菌株和質粒:克隆菌種Escherichia coll (DH5 a ,TOP I O)是基因工程常用工具菌種；表達菌株 JM109、BL21、SCS110，質粒 pET28a、pBV220、pQE30、pET32a、pNJUTRX_l 購自鼎國昌盛生物技術有限責任公司。
[0058]酶和試劑:
[0059]實施例中涉及分子生物學操作所用的酶均購于北京經科宏達公司，相應的操作步驟完全按照相關的產品說明書進行。
[0060]瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒、PCR產物純化試劑盒均購于北京天根公司(TianGen)，相應的操作步驟完全按照相關的產品說明書進行。
[0061]實施例中所涉及的編碼胰蛋白酶酶原的核苷酸序列的合成、引物的合成和DNA的測序工作由北京諾賽基因公司完成。
[0062]TAME 購于 sigma 公司。
[0063]培養基: [0064]以下培養基為固體及液體培養基:LB培養基、AMP抗性LB培養基、Kan抗性培養基。以上培養基是基因工程領域常用培養基，各培養基的配方可參見分子克隆第三版下冊附錄2。
[0065]其他未標明來源的原、輔料均為市售產品。
[0066]方法:
[0067]實施例不包括對傳統方法的詳細描述，如那些聚合酶鏈式反應，PCR產物純化，基因和質粒的酶切、回收、連接和轉化，以及大腸桿菌轉化子的篩選，鑒定，這些基因工程常規操作方法，對于本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的，并且在許多出版物中都有所描述，可參見 Sambrook J,Fristsh EF, Maniatis T.Molecular Cloning; A LaboiatoryManual 2nd ed.NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989， pp.16—340。
[0068]實施例1包涵體表達制備重組牛源性胰蛋白酶原類似物I
[0069]一、重組牛源性胰蛋白酶酶原表達載體的構建
[0070]1、構建胰蛋白酶酶原基因:按照大腸桿菌密碼子偏好性化學合成編碼陰性胰蛋白酶酶原的核苷酸序列，最終核苷酸序列為SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列。
[0071]2、以上述合成的核苷酸序列作為模板，以設計的兩條引物為上下游引物，進行PCR擴增，其中，
[0072]反應引物序列為:
[0073]上游引物Pet28_cation-bSF:
[0074]AGTCATATGGCATTCCCATCGGACGACGATGACAAGATC (SEQ ID NO: 11)
[0075]下游引物Pet28-cation_bR:
[0076]CTACTCGAGTTAATTGGAAGCGATGGTCTGCTT (SEQ ID NO:12)
[0077]反應PCR體系為:
[0078]
【權利要求】
1.一種重組牛源性胰蛋白酶原類似物，其序列結構從N端到C端依次包括A1-A2-A3，其中Al序列由1-4個氨基酸組成，所述氨基酸選自A、F、P、V、D、S或K，A2序列為TRY酶切位點序列，A3序列為具有牛源性胰蛋白酶活性的蛋白質序列。
2.根據權利要求1所述的重組牛源性胰蛋白酶原類似物，其中所述Al序列選自AFPV、V、S 或 AFPS。
3.根據權利要求1所述的重組牛源性胰蛋白酶原類似物，其中所述A2序列為DDDDK。
4.根據權利要求1-3任一項所述的重組牛源性胰蛋白酶原類似物，其結構包含選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4 的氨基酸序列。
5.編碼權利要求1-4任一項所述的重組牛源性胰蛋白酶原類似物的核苷酸序列。
6.根據權利要求5所述的核苷酸序列，包含SEQID N0:7或SEQ ID N0:8或SEQ IDNO:9或SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列。
7.—種表達載體,包含權利要求5或6所述的核苷酸序列。
8.—種重組牛源性胰蛋白酶的制備方法，該方法是以大腸桿菌作為表達宿主的包涵體表達方法，包括以下步驟: 1)通過引物對編碼胰蛋白酶酶原的SEQID NO: 5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列進行PCR擴增； 2)將擴增后的產物與質粒整合得到重組胰蛋白酶酶原表達載體，其中所述重組胰蛋白酶酶原表達載體載有的核苷酸序列為權利要求5-7任一項所述的核苷酸序列； 3)將上述載體轉化至大腸桿菌宿主； 4)誘導上述大腸桿菌宿主表達胰蛋白酶酶原包涵體； 5)將上述包涵體變性復性得到胰蛋白酶酶原； 6)純化上述胰蛋白酶酶原； 7)酶切上述純化后的胰蛋白酶酶原，生成胰蛋白酶； 8)純化上述胰蛋白酶。
9.一種重組牛源性胰蛋白酶的制備方法，該方法是以大腸桿菌作為表達宿主的可溶性表達方法，包括以下步驟: 1)通過引物對編碼胰蛋白酶酶原的SEQID NO: 5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列進行PCR擴增； 2)將擴增后的產物與質粒整合得到重組胰蛋白酶酶原表達載體，其中所述重組胰蛋白酶酶原表達載體載有的核苷酸序列為權利要求5-7任一項所述的核苷酸序列； 3)將上述載體轉化至大腸桿菌宿主； 4)誘導上述大腸桿菌宿主表達胰蛋白酶酶原； 5)純化上述胰蛋白酶酶原； 6)酶切上述純化后的胰蛋白酶酶原，生成胰蛋白酶； 7)純化上述胰蛋白酶。
10.根據權利要求9所述的制備方法，其中，步驟2)所述質粒選自pET28a、pBV220、pQE30、pET32a、pNJUTRX-l、pET21 其中之一；或 步驟3)所述大腸桿菌宿主選自DH5a、HB101、JM109、T0P10、BL21、M110、SCSllO其中之一;或步驟4)所述誘導表達是使用濃度為0.1mM至IOmM的IPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)在15°C至37°C溫度下進行的；或 步驟5)所述的純化是采用Ni2+-NTA基質進行，采用梯度為20mM至250mM的咪唑溶液或pH梯 度進行洗脫。
【文檔編號】C12N9/76GK103966191SQ201310043541
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月4日 優先權日:2013年2月4日
【發明者】王雪, 彭毅, 唐耀旺, 王大梅, 郭云亮, 趙淑紅, 楊青 申請人:甘李藥業股份有限公司