專利名稱：一種可溶藻的賴氨酸芽孢桿菌原生質體制備與再生方法
一種可溶藻的賴氨酸芽孢桿菌原生質體制備與再生方法技術領域
本發明屬于環境工程微生物領域，具體涉及一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌原生質體的制備與再生方法。
背景技術：
近年來，隨著水體富營養化程度的加劇，夏秋季節藍藻大面積快速繁殖，藍藻水華頻繁暴發，大量的藍藻覆蓋在水體表面，嚴重阻礙了水體的流動，水體自凈能力降低，復氧率減小，水體透明度下降，水質惡臭，魚、蝦等浮游生物因生活環境發生惡化而死亡。目前控制藍藻最常用的依然是傳統的機械打撈，然而人力、物力有限，僅能打撈小部分的藍藻，大部分的藍藻在水體內因腐爛而消失，而藍藻危害并沒有隨著其消失而減弱，腐爛的藍藻細胞破碎后就會向水體釋放各種藻類毒素，其中屬于藍藻門的微囊藻在世界藍藻水華水體中占有相當大的比例，我國的太湖流域就以微囊藻為主，它在繁殖的過程中產生大量的毒性較大的MCs，并儲存在細胞內，隨著微囊藻的死亡及藻細胞的破碎，MCs被釋放到水體中，且以溶解性狀態存在，嚴重威脅流域附近居民的健康。在現有的物理、化學及生物等傳統方法達不到理想控制效果的情況下，利用溶藻細菌和MCs降解菌聯合處理藍藻，構建兼具溶藻和MCs降解功能的雙效工程菌即成為一個新的研究方向。
原生質體融合重組可使兩親本菌株的優良性狀同時表達出來，也可能使隱性基因因重組而暴露表達或隨機產生新的基因表達出新的性狀，從而成為微生物育種的一種途徑。應用原生質體融合技術構建 高效降解菌株用以處理污水的研究已經有報道?！妒称放c生物技術學報》2005年第24卷第2期34-37頁報道了廖勁松等以單重抗藥性的突變菌株 (S27和K215)為親本菌株，通過原生質體融合獲得高效PVA降解菌F-4。《河南科學》2009 年第27卷第7期809-812頁報道了張琪等利用原生質體融合技術獲得兼具兩個親本優良性狀的紅霉素高產菌株，對提高紅霉素產量及化學藥價具有較大的應用價值。
微生物溶藻、降解MCs是一個很有效的方法，國內外不少學者已篩選出多種溶藻菌、MCs降解菌，溶藻菌在溶藻過程中，破壞藍藻細胞，釋放出胞內MCs。利用原生質體融合技術可能將兩株分別具有溶藻、MCs降解能力的細菌構建成兼具兩個親本菌株優良性狀的高效降解工程菌。目前，原生質體融合技術在溶藻、MCs降解工程菌構建上的應用，國內外鮮有報道。
通過分離篩選獲得溶藻細菌F8，其對銅綠微囊藻FACHB-905均有較好的溶藻效果?？蓮囊韵聝蓚€思路出發一是制備溶藻細菌、MC降解菌復合菌劑；二是構建兼具溶藻和 MC降解功能的轉基因工程菌。本方法以原生質體融合技術構建工程菌為基礎，主要研究實驗室已分離的溶藻細菌fusiformis)的原生質體制備,該菌是本實驗室從太湖流域野生白鰱魚腸道中篩選出的I株溶解銅綠微囊藻的紡錘形賴氨酸芽孢桿菌，已申請發明專利，保藏號為CGMCC NO. 6106。鑒于親本菌株的抗性標記工作量大，天然抗性難以確定，抗性突變亦可能使優良性狀發生不定向改變，為確保親本菌株保持其各自的優良生物學特性，本研究選用滅活原生質體融合法，既減少了工作量，又保證了后續研究中融合子的質量。發明內容
本發明的目的是提供一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌原生質體制備與再生的方法，使得其制備率與再生率都達到較高范圍。
本發明所采用的技術方案如下一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌的原生質體制備與再生方法，按照下述步驟進(1)菌種活化培養將保藏的菌株F8重新轉接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細菌液體培養基中，置于溫度為30°C，轉速120 r/min的振蕩培養箱中純培養至對數期，約為IO8-1O9個 /mL ；(2)原生質體的破壁酶解取4 mL活化的菌液，4500 r/min離心10 min，收集菌體，經SMM緩沖液洗滌3次，用 3. 2-3. 8mL的SMM緩沖液重懸；加入O. 1-1 mg/mL的溶菌酶O. 2-0. 8mL,在水浴溫度30°C條件下酶解O. 17-1 h;酶解結束后，3000 r/min離心收集原生質體，用O. 55 mol/L的NaCl溶液洗滌3次，洗去酶解液后用4 mL O. 55 mol/L NaCl溶液懸浮即可制備得到原生質體；(3)原生質體的再生 取上述步驟的原生質體懸浮液，用高滲NaCl溶液稀釋到合適的三個梯度，分別吸取 200 μ I涂布于高滲固體培養基,每個梯度做三個平行，置于30°C恒溫培養箱培養48 h,使得原生質體再生。
本發明所述的溶藻細菌iLysinibacillus fusiformis),保藏號為CGMCC NO. 6106。其建議的分類命名為紡錘形賴氨酸芽孢桿菌fusiformis、。已于2012年5月11日保藏于位于中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC NO. 6106。
本發明中步驟(I)中菌種活化培養用細菌培養基組成如下牛肉膏3 g;蛋白胨10 g ;NaCl 5 g ;蒸餾水1000 mL ；pH 7. 0-7. 2 ;固體培養基添加瓊脂粉2. 4% ;上述培養基根據要求在高壓滅菌鍋中于121°C條件下滅菌20 min。
本發明中步驟(3)中原生質體的再生用的高滲液體培養基組成如下蛋白胨10 g，酵母浸出汁5 g,牛肉膏5 g,鹿糖170 g (0.5 mol/L),蒸懼水定容至1000 mL, pH 7. 2 ;高滲固體培養基加入瓊脂粉20-24 g。上述培養基根據要求在高壓滅菌鍋中于121°C條件下滅菌20 min。
本發明所述的溶液配制如下(I)高滲NaCl溶液=NaCl O. 55 mol/L。(2)SMM緩沖液蔗糖 O. 55 mol/L，順丁希二酸 20 mmol/L, MgCl2 · 6H20 20 mmol/L, pH 6.8。(3) EDTA 溶液EDTA 0. 8 g/L，SMM緩沖液配制。(4)溶菌酶0. 01-0.1 mg/mL, SMM緩沖液配制。上述溶液根據要求在高壓滅菌鍋中于121°C條件下滅菌20 min。
上述原生質體制備與再生方法優選加入溶菌酶使得體系中酶濃度為0. 005 mg/mL，在溫度為30°C時酶解O. 5h，該賴氨酸芽孢桿菌原生質體制備率與再生率最佳，有利于后續融合子的制備與再生。
本發明的有益效果采用本發明的原生質體制備與再生方法，工藝簡單，便于操作，可重復性強；所獲得的原生質體制備率最高可達86. 25%，且再生率最高可達在76. 81%，原生質體體制備率高且原生質體活性保持較好，有利于后續兼具溶藻與降解MC-LR功能的融合子的制備與再生。
具體實施方式
一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌原生質體制備與再生的方法提供了適合該菌原生質體制備及高效再生的方法。
以下提供本發明利用上述方法的5個實施例實施例1將保藏的菌株F8重新轉接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細菌液體培養基中，置于溫度為30°C，轉速120 r/min的振蕩培養箱中純培養至對數期，約為IO8-1O9個 /mL。取4 mL活化的菌液，4500 r/min離心10 min,收集菌體，經SMM緩沖液洗滌3次，用 3. 2mL的SMM緩沖液重懸；加入O. 01 mg/mL的溶菌酶O. 8mL,在水浴溫度30°C條件下酶解 O. 5 h ;酶解結束后，3000 r/min離心收集原生質體，用O. 55 mol/L的NaCl溶液洗滌3次， 洗去酶解液后用4 mL O. 55 mol/L NaCl溶液懸浮備用，該過程所獲得的原生質體制備率為 65. 75%,再生率為 79. 85%。
其中原生質體制備率測定方法如下將溶菌酶處理前的細胞和酶解后的原生質體懸液均用無菌蒸餾水稀釋，放置約10 min，使原生質體吸水 脹破，分別吸取100 μ I涂布在細菌固體平板培養基上，每個梯度做三個平行，于30°C恒溫培養箱中倒置培養48 h，分別計菌落數A和B，根據下述公式計算原生質體制備率，以檢驗制備效果。'康生質體制備率< %> = XlOO %A
其中A為總菌落數，即未經溶菌酶處理的菌液涂布于細菌平板上生長的菌落數；B 為未原生質體化的細菌菌落數，即原生質體懸液經無菌蒸餾水稀釋后涂布于細菌平板上生長的菌落數。
其中所述的原生質體的再生方法如下取原生質體懸浮液，用高滲NaCl溶液稀釋到合適的三個梯度，分別吸取200 μ I涂布于高滲固體培養基，每個梯度做三個平行，置于30°C恒溫培養箱培養48 h，計再生菌落數 C，根據下述公式計算原生質體再生率，以檢驗再生效果。原生質體再生率(％) = Xioo%A-B
其中A為總菌落數，即未經溶菌酶處理的菌液涂布于細菌平板上生長的菌落數；B 為未原生質體化的細菌菌落數，即原生質體懸液經無菌蒸餾水稀釋后涂布于細菌平板上生長的菌落數；C為再生菌落數，即原生質體懸液，經高滲NaCl溶液稀釋后在高滲平板上長出來的菌落數。
實施例2將保藏的菌株F8重新轉接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細菌液體培養基中，置于溫度為30°C，轉速120 r/min的振蕩培養箱中純培養至對數期，約為IO8-1O9 個/mL。取4 mL活化的菌液，4500 r/min離心10 min,收集菌體，經SMM緩沖液洗滌3次， 用3. 8mL的SMM緩沖液重懸；加入O.1 mg/mL的溶菌酶O. 2mL,在水浴溫度30°C條件下酶解 O. 5 h ;酶解結束后，3000 r/min離心收集原生質體，用O. 55 mol/L的NaCl溶液洗滌3次， 洗去酶解液后用4 mL O. 55 mol/L NaCl溶液懸浮備用，該過程所獲得的原生質體制備率為86.25%，再生率為 76. 81%。
實施例3將保藏的菌株F8重新轉接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細菌液體培養基中，置于溫度為30°C，轉速120 r/min的振蕩培養箱中純培養至對數期，約為IO8-1O9 個/mL。取4 mL活化的菌液，4500 r/min離心10 min,收集菌體，經SMM緩沖液洗滌3次， 用3. 6mL的SMM緩沖液重懸；加入O.1 mg/mL的溶菌酶O. 4mL,在水浴溫度30°C條件下酶解O.5 h ;酶解結束后，3000 r/min離心收集原生質體，用O. 55 mol/L的NaCl溶液洗滌3次， 洗去酶解液后用4 mL O. 55 mol/L NaCl溶液懸浮備用，該過程所獲得的原生質體制備率為87.5%,再生率為 42. 86%ο
實施例4將保藏的菌株F8重新轉接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細菌液體培養基中，置于溫度為30°C，轉速120 r/min的振蕩培養箱中純培養至對數期，約為IO8-1O9 個/mL。取4 mL活化的菌液，4500 r/min離心10 min,收集菌體，經SMM緩沖液洗滌3次， 用3. 8mL的SMM緩沖液重懸；加入O.1 mg/mL的溶菌酶O. 2mL,在水浴溫度30°C條件下酶解O.17 h;酶解結束后，3000 r/min離心收集原生質體，用O. 55 mol/L的NaCl溶液洗滌3次， 洗去酶解液后用4 mL 0. 55 mol/L NaCl溶液懸浮備用，該過程所獲得的原生質體制備率為 78. 95%,再生率 34. 44%ο
實施例5將保藏的菌株F8重新轉接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細菌液體培養基中，置于溫度為30°C，轉速120 r/min的振蕩培養箱中純培養至對數期，約為IO8-1O9 個/mL。取4 mL活化的菌液，4500 r/min離心10 min,收集菌體，經SMM緩沖液洗滌3次， 用3. 8mL的SMM緩沖液重懸；加入0.1 mg/mL的溶菌酶0. 2mL,在水浴溫度30°C條件下酶解I h;酶解結束后，3000 r/min離心收集原生質體，用0.55 mol/L的NaCl溶液洗滌3次， 洗去酶解液后用4 mL 0. 55 mol/L NaCl溶液懸浮備用，該過程所獲得的原生質體制備率為 85. 09%,再生率 50. 52%。
權利要求
1.一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌的原生質體制備與再生方法，其特征在于按照下述步驟進行 (1)菌種活化培養 將保藏的菌株F8重新轉接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細菌液體培養基中，置于溫度為30°C，轉速120 r/min的振蕩培養箱中純培養至對數期，為IO8-1O9個/mL ； (2)原生質體的破壁酶解 取4 mL活化的菌液，4500 r/min離心10 min，收集菌體，經SMM緩沖液洗滌3次，用3.2-3. 8mL的SMM緩沖液重懸；加入O. 1-1 mg/mL的溶菌酶O. 2-0. 8mL,在水浴溫度30°C條件下酶解O. 17-1 h;酶解結束后，3000 r/min離心收集原生質體，用O. 55 mol/L的NaCl溶液洗滌3次，洗去酶解液后用4 mL O. 55 mol/L NaCl溶液懸浮即可制備得到原生質體； (3)原生質體的再生 取上述步驟的原生質體懸浮液，用高滲NaCl溶液稀釋到合適的三個梯度，分別吸取200 μ I涂布于高滲固體培養基,每個梯度做三個平行，置于30°C恒溫培養箱培養48 h,使得原生質體再生。
2.根據權利要求1所述的一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌的原生質體制備與再生方法，其特征在于所述的溶藻細菌iLysinibadIlus fusiformis),保藏號為CGMCCNO. 6106。
3.根據權利要求1所述的一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌的原生質體制備與再生方法，其特征在于步驟(I)中菌種活化培養用細菌培養基組成如下牛肉膏3 g ;蛋白胨10 g ；NaCl 5 g ;蒸餾水1000 mL ；pH 7. 0-7. 2 ;若為固體培養基則添加瓊脂粉2. 4% ;上述培養基根據要求在高壓滅菌鍋中于121°C條件下滅菌20 min。
4.根據權利要求1所述的一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌的原生質體制備與再生方法，其特征在于步驟(3)中原生質體的再生用的高滲液體培養基組成如下蛋白胨10 g，酵母浸出汁5 g，牛肉膏5 g，蔗糖170 g，蒸餾水定容至1000 mL，pH 7. 2 ;若為高滲固體培養基則加入瓊脂粉20-24 g ;上述培養基根據要求在高壓滅菌鍋中于121°C條件下滅菌20 min。
5.根據權利要求1所述的一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌的原生質體制備與再生方法，其特征在于所述的溶液配制如下(I)高滲NaCl溶液NaCl O. 55 mol/L； (2)SMM 緩沖液蔗糖 O. 55 mol/L，順丁希二酸 20 mmol/L, MgCl2 · 6H20 20 mmol/L, pH 6. 8 ；(3)溶菌酶0. 1-1 mg/mL，SMM緩沖液配制；上述溶液根據要求在高壓滅菌鍋中于121°C條件下滅菌20 min。
全文摘要
本發明一種可溶藻的賴氨酸芽孢桿菌原生質體制備與再生方法，屬于環境工程微生物領域。本發明采用原生質體制備與再生方法，工藝簡單，便于操作，可重復性強；所獲得的原生質體制備率最高可達86.25%，且再生率最高可達在76.81%，原生質體體制備率高且原生質體活性保持較好，有利于后續兼具溶藻與降解MC-LR功能的融合子的制備與再生。
文檔編號C12R1/01GK103013849SQ20121034222
公開日2013年4月3日 申請日期2012年9月17日 優先權日2012年9月17日
發明者張文藝, 陳雪珍, 李仁霞, 李秋艷 申請人:常州大學