專利名稱：抗-系統(tǒng)asc氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2 (asct2)抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單克隆抗體或其抗體片段，所述單克隆抗體特異性識(shí)別系統(tǒng)ASC氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(以下稱為“ASCT2”)的細(xì)胞外區(qū)域的天然三維結(jié)構(gòu)并與該細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合；產(chǎn)生所述抗體的雜交瘤；編碼所述抗體的DNA ;包含所述DNA的載體；可通過(guò)導(dǎo)入所述載體獲得的轉(zhuǎn)化體；利用所述雜交瘤或轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)抗體或其抗體片段的方法；和利用所述抗體或其抗體片段的治療藥，以及利用所述抗體或其抗體片段的診斷試劑。
背景技術(shù)：
ASCT2多肽是由541個(gè)氨基酸構(gòu)成的全長(zhǎng)10次跨膜蛋白，并依賴鈉離子發(fā)揮將中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白根據(jù)包括底物特異性等在內(nèi)的功能功能特征分成幾個(gè)系統(tǒng)。ASCT2屬于系統(tǒng)ASC并具有依賴鈉離子進(jìn)行中性氨基酸例如L-丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-半胱氨酸、和L-谷氨酰胺的細(xì)胞內(nèi)攝取的功能(非專利文獻(xiàn)I)。此外，ASCT2是D型猿逆轉(zhuǎn)錄病毒和三種C型病毒[貓內(nèi)源病毒(RD114)，狒狒內(nèi)源病毒，和鳥(niǎo)類網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒](非專利文獻(xiàn)2和3)共享的病毒細(xì)胞表面受體。ASCT2也被稱為2型鈉依賴性中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，脂肪細(xì)胞氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，AAAT，中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白B，ATB，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Β°，ΑΤΒ°，ΑΤΒ0，狒狒M7病毒受體，M7V1，M7VS1，胰島素活化氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，F(xiàn)LJ31068，RDl 14病毒受體，RDl 14/猿D型逆轉(zhuǎn)錄病毒受體，RDR, RDRC,或R16 (非專利文獻(xiàn)I和3)。此外，作為另一 個(gè)名稱，ASCT2被稱為溶質(zhì)載體家族I (中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn))、成員5、溶質(zhì)載體家族I成員5或SLC1A5，并屬于SLCl家族。關(guān)于癌癥發(fā)展和ASCT2或SLC1A5表達(dá)之間的關(guān)系，利用表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，SLC1A5、SLC7A5和SLC38A5三者在癌組織中的表達(dá)水平顯著增加(非專利文獻(xiàn)4)。此外，在正常肝臟中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)SLC1A5的表達(dá)，但是在肝細(xì)胞癌或肝母細(xì)胞瘤的臨床組織中發(fā)現(xiàn)SLC1A5的表達(dá)(非專利文獻(xiàn)5)。另外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在低分化的星形細(xì)胞瘤或多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的臨床組織中SLC1A5的表達(dá)比在正常組織中高(非專利文獻(xiàn)6)。此外，通過(guò)免疫組織學(xué)染色或Western印跡法，在大腸癌和前列腺癌臨床組織中檢出了 ASCT2的表達(dá)，而高度表達(dá)ASCT2的患者的后果較差(非專利文獻(xiàn)7和8)。此外，ASCT2擔(dān)負(fù)大腸癌、肝癌、乳腺癌、星形細(xì)胞瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤的幾個(gè)細(xì)胞系中谷氨酰胺的攝取(非P專利文獻(xiàn)9至12)，并通過(guò)利用ASCT2的底物丙氨酸-絲氨酸-蘇氨酸混合物來(lái)競(jìng)爭(zhēng)性抑制谷氨酰胺的細(xì)胞內(nèi)攝取，從而抑制了細(xì)胞增殖(非專利文獻(xiàn)9)。至于與ASCT2結(jié)合的抗體，已知的是抗人ASCT2的細(xì)胞內(nèi)N-末端或C-末端部分肽的多克隆抗體(非專利文獻(xiàn)13、14和15)。因?yàn)檫@些抗體全都是識(shí)別ASCT2的細(xì)胞內(nèi)部分，所以它們不能與細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)的ASCT2相結(jié)合。已知當(dāng)抗體與細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原蛋白結(jié)合時(shí)，在生物體內(nèi)誘導(dǎo)了抗體的效應(yīng)子活性引起的細(xì)胞毒性，例如抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(以下稱為“ADCC活性”)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(以下稱為“CDC活性”)(非專利文獻(xiàn)16)。但是，因?yàn)檫@些抗體不能與細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)的ASCT2結(jié)合，不能期待由效應(yīng)子活性引起的這些細(xì)胞毒性。另外，因?yàn)樗羞@些抗體是識(shí)別ASCT2的細(xì)胞內(nèi)部分的抗體，它們不能抑制由活細(xì)胞中表達(dá)的ASCT2細(xì)胞內(nèi)攝取氨基酸。另外，識(shí)別人類ASCT2的多克隆抗體可以從:LifeSpan BioSciences (產(chǎn)品編號(hào):LS-C16840 和 LC-C31887)，Avia Systems Biology (產(chǎn)品編號(hào):ARP42247_T100)，Santa CruzBiotechnology (產(chǎn)品編號(hào):sc_50698 和 sc-50701)，或 Millipore (產(chǎn)品編號(hào):AB5468)獲得。但是，尚不知道特異性識(shí)別ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的天然三維結(jié)構(gòu)并與所述細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合的單克隆抗體。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I: J.Biol.Chemistry, 271, 18657 (1996)非專利文獻(xiàn)2:Proc, Natl.Acad, Sc1.USA, 96, 2129 (1999)非專利文獻(xiàn)3:J.Virology, 73，4470 (1999)非專利文獻(xiàn)4:Seminars in Cancer Biology, 15, 254(2005)非專利文獻(xiàn)5:Am.J.Physiol`.`Gastrointest.Liver Physiol., 283, G1062 (2002)非專利文獻(xiàn)6:NeuroReport, 15，575 (2004)非專利文獻(xiàn)7:Anticancer Research, 22, 2555 (2002)非專利文獻(xiàn)8:Anticancer Research, 23, 3413 (2003)非專利文獻(xiàn)9:J.Surgical Research, 90, 149 (2000)非專利文獻(xiàn)10:J.Cellular Physiology, 176, 166(1998)非專利文獻(xiàn)11:J.Neuroscience Research, 66, 959 (2001)非專利文獻(xiàn)12:Am.J.Physiol.Cell Physiol.，282，C1246 (2002)非專利文獻(xiàn)13:J.Gene Medicine, 6，249 (2004)非專利文獻(xiàn)14:Am.J.Physiol.Cell Physiol.，281，C963 (2001)非專利文獻(xiàn)15:Biochem.J.，382，27 (2004)非專利文獻(xiàn)16 =Cancer Res.，56，1118(1996)
發(fā)明概要 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供單克隆抗體或其抗體片段，所述單克隆抗體特異性識(shí)別ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的天然三維結(jié)構(gòu)并與該細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合；產(chǎn)生所述抗體的雜交瘤；編碼所述抗體的DNA ;包含所述DNA的載體；可通過(guò)導(dǎo)入所述載體獲得的轉(zhuǎn)化體；利用所述雜交瘤或轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)抗體或其抗體片段的方法；和利用所述抗體或其抗體片段的治療藥，以及利用所述抗體或其抗體片段的診斷試劑
解決問(wèn)題的方案本發(fā)明涉及以下(I)至(44):(I)單克隆抗體或其抗體片段，所述單克隆抗體特異性識(shí)別系統(tǒng)ASC氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(以下稱為“ASCT2”)的細(xì)胞外區(qū)域的天然三維結(jié)構(gòu)并與該細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合；(2) (I)所述的單克隆抗體或其抗體片段，其抑制通過(guò)ASCT2細(xì)胞內(nèi)攝取氨基酸；(3) (I)或(2)所述的單克隆抗體或其抗體片段，其具有細(xì)胞的細(xì)胞毒性；(4) (3)所述的單克隆抗體或其抗體片段，其中所述細(xì)胞毒性是抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)活性或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性；(5)⑴至(4)任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其抗體片段，其與人類ASCT2結(jié)合而不與小鼠ASCT2結(jié)合；(6) (5)所述的單克隆抗體或其抗體片段，其與人類ASCT2的至少EL2區(qū)域結(jié)合；(7) (6)所述的單克隆抗體或其抗體片段，其與選自SEQ ID N0:2表示的氨基酸序列中 154,159 至 160,163 至 171,173 至 174、177、188、204 至 205,207,210 至 212 和 214 至223位的至少任何一個(gè)氨基酸結(jié)合； (8)⑴至(7)任一項(xiàng)所述的抗體或其抗體片段，其中所述單克隆抗體是與選自雜交瘤KM4008 (FERM BP-10962)和雜交瘤KM4012 (FERM BP-10963)的任何一種雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體所識(shí)別的表位結(jié)合的單克隆抗體；(9) (I)至(8)任一項(xiàng)所述的抗體或其抗體片段，其中所述單克隆抗體是選自雜交瘤KM4008(FERM BP-10962)和雜交瘤KM4012 (FERM BP-10963)的任何一種雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體；(10)⑴至(9)任一項(xiàng)所述的抗體片段，其中所述抗體片段是選自Fab、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體(scFv)、二聚體化V區(qū)(雙抗體)、二硫鍵穩(wěn)定的V區(qū)(dsFv)和包含CDR的肽的抗體片段；(11) (I)至(10)任一項(xiàng)所述的抗體或其抗體片段，其中所述單克隆抗體是重組抗體；(12) (11)所述的重組抗體或其抗體片段，其中所述重組抗體是選自人嵌合抗體、人源化抗體和人類抗體的重組抗體；(13) (11)所述的重組抗體或其抗體片段，其包括(I)至(9)任一項(xiàng)所述的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)(以下稱為“VH”)和輕鏈可變區(qū)(以下稱為“VL”)的互補(bǔ)決定區(qū)(以下稱為“CDR”)；(14) (13)所述的重組抗體或其抗體片段，其中抗體的VH的和⑶R3分別包含SEQ ID NO:26、27和28表示的氨基酸序列；(15) (13)所述的重組抗體或其抗體片段，其中抗體的VL的⑶R1XDR2和⑶R3分別包含SEQ ID NO:29、30和31表示的氨基酸序列；(16) (13)所述的重組抗體或其抗體片段，其中抗體的VH的⑶R1XDR2和⑶R3分別包含SEQ ID NO: 26、27和28表示的氨基酸序列，和抗體的VL的CDR1、CDR2和CDR3分別包含SEQ ID NO:29、30和31表示的氨基酸序列；(17) (13)所述的重組抗體或其抗體片段，其中抗體的VH的⑶R1XDR2和⑶R3分別包含SEQ ID NO: 32、33和34表示的氨基酸序列；
(18) (13)所述的重組抗體或其抗體片段，其中抗體的VL的CDR1、CDR2和CDR3分別包含SEQ ID NO:35、36和37表示的氨基酸序列；(19) (13)所述的重組抗體或其抗體片段，其中抗體的VH的⑶R1XDR2和⑶R3分別包含SEQ ID NO: 32、33和34表示的氨基酸序列，而抗體的VL的CDR1、CDR2和CDR3分別包含SEQ ID NO:35、36和37表示的氨基酸序列；(20) (13)所述的重組抗體或其抗體片段，其中抗體的VH的⑶R1XDR2和⑶R3分別包含SEQ ID NO:49、50和51表示的氨基酸序列；(21) (13)所述的重組抗體或其抗體片段，其中抗體的VL的⑶R1XDR2和⑶R3分別包含SEQ ID NO: 52、53和54表示的氨基酸序列；(22) (13)所述的重組抗體或其抗體片段，其中抗體的VH的⑶R1XDR2和⑶R3分別包含SEQ ID N0:49、50和51表示的氨基酸序列，而抗體的VL的CDR1、CDR2和CDR3分別包含SEQ ID NO: 52、53和54表示的氨基酸序列；

(23) (12)所述的人嵌合抗體或其抗體片段，其包含⑴至⑶的任一項(xiàng)所述的單克隆抗體的VH和VL ；(24) (23)所述的人嵌合抗體或其抗體片段，其選自其中抗體的VH包含SEQ IDNO: 19表示的氨基酸序列和抗體的VL包含SEQ ID NO:21表示的氨基酸序列的人嵌合抗體、其中抗體的VH包含SEQ ID NO: 23表示的氨基酸序列和抗體的VL包含SEQ ID NO: 25表示的氨基酸序列的人嵌合抗體、和其中抗體的VH包含SEQ ID NO:46表示的氨基酸序列和抗體的VL包含SEQ ID NO:48表示的氨基酸序列的人嵌合抗體；(25) (12)所述的人源化抗體或其抗體片段，其中抗體的VH包含SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列，或其中選自SEQ ID N0:71表示的氨基酸序列中第2位Val、第9位Ser、第20 位 Val、第 30 位 Ser、第 38 位 Arg、第 46 位 Glu、第 86 位 Leu、第 93 位 Val、第 95 位 Tyr和第116位Val的至少一個(gè)氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列；和/或其中抗體的VL包含SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列，或其中選自SEQ ID N0:72表示的氨基酸序列中第8位Pro、第15位Val、第38位Gin、第43位Ala、第44位Pro、71位Phe和第87位Tyr的至少一個(gè)氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列，(26) (25)所述的人源化抗體或其抗體片段，其中抗體的VH包含的氨基酸序列在SEQ ID N0:71表示的氨基酸序列中導(dǎo)入選自Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val，Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的修飾中的至少一個(gè)修飾，和抗體的VL包含的氨基酸序列在SEQ ID N0:72表示的氨基酸序列中導(dǎo)入選自Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代71位Phe和Phe取代第87位Tyr的修飾中的至少一個(gè)修飾；(27) (25)所述的人源化抗體或其抗體片段，其中人源化抗體選自抗體的VH包含SEQ ID NO: 76表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列的人源化抗體，抗體的VH包含SEQ ID NO: 78表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ IDN0:72表示的氨基酸序列的人源化抗體，抗體的VH包含SEQ ID NO:80表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列的人源化抗體，抗體的VH包含SEQ IDNO:82表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列的人源化抗體，抗體的VH包含SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO:84表示的氨基酸序列的人源化抗體，抗體的VH包含SEQ ID N0:76表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID N0:84表示的氨基酸序列的人源化抗體，抗體的VH包含SEQ ID NO: 78表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID N0:84表示的氨基酸序列的人源化抗體，抗體的VH包含SEQ ID NO: 80表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO: 84表示的氨基酸序列的人源化抗體，和抗體的VH包含SEQ ID NO:82表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO:84表示的氨基酸序列的人源化抗體；(28)產(chǎn)生(1)至(27)任一項(xiàng)所述的單克隆抗體的雜交瘤；(29) (28)所述的雜交瘤，其中所述雜交瘤是雜交瘤KM4008 (FERM BP-10962)或雜交瘤 KM4012(FERM BP-10963)；(30)編碼(1)至(29)任一項(xiàng)所述的抗體或其抗體片段的DNA ；(31)包含(30)所述的DNA的重組載體；(32)可通過(guò)將(31)所述的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞而獲得的轉(zhuǎn)化體；(33)生產(chǎn)(1)至(27)任一項(xiàng)所述的抗體或其抗體片段的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)(28)或(29)所述的雜交瘤或(32)所述的轉(zhuǎn)化體以在所述培養(yǎng)物中形成和累積(I)至
(27)任一項(xiàng)所述的抗 體或其抗體片段，和從所述培養(yǎng)物收集所述抗體或其抗體片段；(34)包含(1)至(27)任一項(xiàng)所述的抗體或其抗體片段作為活性成分的ASCT2相關(guān)疾病的治療藥；(35) (34)所述的治療藥，其中所述與ASCT2相關(guān)的疾病是癌癥；(36) (35)所述的治療藥，其中所述癌癥是血液癌，食道癌，胃癌，大腸癌，肝癌或前列腺癌；(37)免疫學(xué)檢測(cè)或測(cè)量ASCT2的方法，其利用(I)至(27)的任一項(xiàng)所述的抗體或其抗體片段；(38) (37)所述的方法，其中所述免疫學(xué)測(cè)量方法是免疫沉淀法；(39)免疫學(xué)檢測(cè)或測(cè)量表達(dá)ASCT2的細(xì)胞的方法，其利用(I)至(27)任一項(xiàng)所述的抗體或其抗體片段；(40) (39)所述的方法，其中所述免疫學(xué)檢測(cè)方法是熒光細(xì)胞染色法；(41)免疫學(xué)檢測(cè)或測(cè)量ASCT2的試劑，其利用⑴至(27)任一項(xiàng)所述的抗體或其抗體片段；(42)ASCT2相關(guān)疾病的診斷試劑，其利用⑴至(27)任一項(xiàng)所述的抗體或其抗體片段；(43) (42)所述的診斷試劑，其中所述與ASCT2相關(guān)的疾病是癌癥；和(44) (43)所述的診斷試劑，其中所述癌癥是血液癌，食道癌，胃癌，大腸癌，肝癌或前列腺癌。發(fā)明的有益效果本發(fā)明能提供單克隆抗體或其抗體片段，所述單克隆抗體特異性識(shí)別ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的天然三維結(jié)構(gòu)并與該細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合；產(chǎn)生所述抗體的雜交瘤；編碼所述抗體的DNA ;包含所述DNA的載體；可通過(guò)導(dǎo)入所述載體獲得的轉(zhuǎn)化體；利用所述雜交瘤或轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生抗體或其抗體片段的方法；和利用所述抗體或其抗體片段的治療藥，以及利用所述抗體或其抗體片段的診斷試劑


圖 1-1 顯示了 NM_005628(SEQ ID NO:1)和HCH0N2001712 (SEQ ID N0:87)的比對(duì)。
*表不兩個(gè)核苷酸序列在該位置相同。圖 1-2顯示了 NM_005628(SEQ ID NO:1)和HCH0N2001712 (SEQ ID N0:87)的比對(duì)。
*表不兩個(gè)核苷酸序列在該位置相同。圖 1-3 顯示了 NM_005628(SEQ ID NO:1)和 HCH0N2001712 (SEQ ID N0:87)的比對(duì)。*表示兩個(gè)核苷酸序列在該位置相同。下劃線處是用于Q-PCR的擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)位置(Fw#l對(duì)應(yīng)NM_005628的2281至2301位核苷酸和HCH0N2001712的1689至1709位核苷酸，Rv#l對(duì)應(yīng)NM_005628的2739至2719位反向核苷酸鏈和HCH0N2001712的2139至2119位的反向核苷酸鏈)。圖 1-4 顯示了 NM_005628(SEQ ID NO:1)和 HCH0N2001712 (SEQ ID N0:87)的比對(duì)。*表示兩個(gè)核苷酸序列在該位置相同。下劃線處是用于Q-PCR的擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)位置(Fw#l對(duì)應(yīng)NM_005628的2281至2301位核苷酸和HCH0N2001712的1689至1709位核苷酸，Rv#l對(duì)應(yīng)NM_005628的2739 至2719位反向核苷酸鏈和HCH0N2001712的2139至2119位的反向核苷酸鏈)。圖2-1顯示癌細(xì)胞系、異種移植物、正常組織和臨床癌組織中ASCT2基因的mRNA表達(dá)水平。圖2-2顯示癌細(xì)胞系、異種移植物、正常組織和臨床癌組織中ASCT2基因的mRNA表達(dá)水平。圖3顯示通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)量的抗-myc抗體(抗_myc)和抗-His抗體(抗-His)與固定化的人ASCT2-myc/His基因-導(dǎo)入CHO細(xì)胞(ASCT2/CH0)和載體導(dǎo)入CHO細(xì)胞(載體/CH0)的反應(yīng)性。橫坐標(biāo)表示突光強(qiáng)度,縱坐標(biāo)表示細(xì)胞計(jì)數(shù)。抗體通過(guò)涂黑指示，緩沖液由白色曲線指示。圖4顯示在結(jié)合ELISA中，抗ASCT2的N-末端肽的單克隆抗體KM3842與ASCT2的N-末端肽的反應(yīng)性。橫坐標(biāo)表示抗體濃度(μ g/mL)，縱坐標(biāo)表示吸光度比值(0D415/490)。▲表示在利用人ASCT2N-末端肽-THY結(jié)合物情況下的吸光度比值和■表示在利用對(duì)照肽-THY結(jié)合物情況下的吸光度比值。圖5顯示利用熒光細(xì)胞染色(流式細(xì)胞儀)檢測(cè)的抗ASCT2單克隆抗體KM3998與ASCT2-myc/His基因?qū)氲腃HO細(xì)胞(ASCT2/CH0)、載體導(dǎo)入的CHO細(xì)胞(載體/CH0)和KMS-1l的反應(yīng)性。橫坐標(biāo)表示突光強(qiáng)度,縱坐標(biāo)表示細(xì)胞計(jì)數(shù)。KM3998通過(guò)涂黑指示,大鼠IgG2a-UNLB由白色曲線指示。圖6顯示利用熒光細(xì)胞染色(流式細(xì)胞儀)檢測(cè)的抗-ASCT2單克隆抗體KM4000、KM4001、KM4008、KM4012 和 KM4018 與人 ASCT2_myc/His 基因?qū)氲?CHO 細(xì)胞(ASCT2/CH0)、載體導(dǎo)入的CHO細(xì)胞(載體/CH0)和KMS-1l的反應(yīng)性。橫坐標(biāo)表示抗體濃度(μ g/mL)，縱坐標(biāo)表示平均熒光強(qiáng)度。KM511的平均熒光強(qiáng)度由籲和實(shí)線表示，KM4000的平均熒光強(qiáng)度由■和粗實(shí)線表示，KM4001的平均熒光強(qiáng)度由▲和虛線表示，KM4008的平均熒光強(qiáng)度由O和虛線表示，KM4012的平均熒光強(qiáng)度由□和虛線表示，大鼠IgG2a-UNLB的平均熒光強(qiáng)度由符號(hào)□和實(shí)線表示，和KM4018的平均熒光強(qiáng)度由▲和粗實(shí)線表示。圖7顯示抗-ASCT2單克隆抗體KM3998對(duì)人大腸癌細(xì)胞系WiDr的谷氨酰胺依賴性增殖的抑制活性。橫坐標(biāo)表示KM3998的終濃度(μ g/mL)，縱坐標(biāo)表示以抗體未處理的細(xì)胞的增殖作為100%得到的相對(duì)值(%)。KM3998的相對(duì)增殖率由 和實(shí)線表示，大鼠IgG2a-UNLB的相對(duì)增殖率由符號(hào)X和實(shí)線表示，AST混合物的相對(duì)增殖率由虛線表示。圖8 顯示抗-ASCT2 單克隆抗體 KM4000、KM4001、KM4008、KM4012 和 KM4018 對(duì)人大腸癌細(xì)胞系WiDr的谷氨酰胺依賴性增殖的抑制活性。橫坐標(biāo)表示各個(gè)抗體的終濃度(μ g/mL)，縱坐標(biāo)表示以抗體未處理的細(xì)胞的增殖作為100%得到的相對(duì)值(%)。KM4000的相對(duì)增殖率由 和實(shí)線表示，KM4001的相對(duì)增殖率由■和實(shí)線表示,KM4008的相對(duì)增殖率由Δ和實(shí)線表示，KM4012的相對(duì)增殖率由O和實(shí)線表示，KM511的相對(duì)增殖率由X和實(shí)線表示，KM4018的相對(duì)增殖率由■和實(shí)線表示，大鼠IgG2a-UNLB的相對(duì)增殖率由X和實(shí)線表示，AST混合物的相對(duì)增殖率由虛線表示。圖9顯示利用熒光細(xì)胞染色(流式細(xì)胞儀)檢測(cè)的抗-ASCT2人嵌合抗體與人ASCT2-myc/His基因?qū)氲腃HO細(xì)胞(ASCT2/CH0)和人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系0PM-2的反應(yīng)性。橫坐標(biāo)表示抗體濃度(μ g/mL)，縱坐標(biāo)表示平均熒光強(qiáng)度。CKM4008的平均熒光強(qiáng)度由O和實(shí)線表示，CKM4012的平均熒光強(qiáng)度由Λ和實(shí)線表示，CKM4018的平均熒光強(qiáng)度由.和實(shí)線表示。圖10顯示抗-ASCT2人嵌合抗體對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系KMS-11的ADCC活性。橫坐標(biāo)表示抗體濃度(ng/mL)，縱坐標(biāo)表示ADCC活性。cKM4008的ADCC活性由O和實(shí)線表示，CKM4012的ADCC活性由Λ和實(shí)線表示，cKM4018的ADCC活性由■和實(shí)線表示。圖11顯示抗-ASCT2人嵌合抗體對(duì)人ASCT2-myc/His基因?qū)氲腃HO細(xì)胞(ASCT2/CH0)和人大腸癌細(xì)胞系Colo205的⑶C活性。橫坐標(biāo)表示抗體濃度(μ g/mL)，縱坐標(biāo)表示⑶C活性。CKM4008的⑶C活性由O和實(shí)線表示，CKM4012的⑶C活性由Λ和實(shí)線表示，CKM4018的⑶C活性由■和實(shí)線表示。圖12顯示抗_asct2人嵌合抗體對(duì)人大腸癌細(xì)胞系WiDr的谷氨酰胺依賴性增殖的抑制活性。橫坐標(biāo)表示各個(gè)抗體的終濃度(μ g/mL)，縱坐標(biāo)表示以抗體未處理的細(xì)胞的增殖作為100%得到的相對(duì)值(%)。KM4008的相對(duì)增殖率由O和實(shí)線表示，KM4012的相對(duì)增殖率由Λ和實(shí)線表示，ΚΜ4018的相對(duì)增殖率由■和實(shí)線表示，ΚΜ511的相對(duì)增殖率由+和實(shí)線表示，AST混合物的相對(duì)增殖率由虛線表示。圖13顯示人ASCT2蛋白和小鼠ASCT2蛋白的示意圖。黑色表示在推定的細(xì)胞外區(qū)域(EL1，EL2，EL3，EL4和EL5)中人和小鼠蛋白之間不同的氨基酸。
具體實(shí)施方案本發(fā)明涉及單克隆抗體或其抗體片段，所述單克隆抗體特異性識(shí)別ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的天然三維結(jié)構(gòu)并與該細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合。本發(fā)明的ASCT2的物種沒(méi)有特別的限制。物種的例子可優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，具體是人類。ASCT2的氨基酸序列信息可以從已知的數(shù)據(jù)庫(kù)例如NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)獲得。實(shí)例包括 SEQ ID NO: 2 表示的人 ASCT2 (NCBI 登錄號(hào) NP_005619)，SEQ IDNO: 86表示的小鼠ASCT2(NCBI登錄號(hào)NP_033227)，等等。本發(fā)明的ASCT2包括包含SEQ ID NO: 2表示的氨基酸序列或者SEQ ID NO: 2表示的氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被缺失、取代和/或添加并具有ASCT2功能的多肽。本發(fā)明的ASCT2還包括與SEQ ID NO: 2表示的氨基酸序列具有60%以上同源性、優(yōu)選80%以上同源性、更優(yōu)選90%以上同源性、更加優(yōu)選95%以上同源性并具有ASCT2功能的多肽。在本發(fā)明中，包含在SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基缺失、取代和/或添加的氨基酸序列的所述多肽，可通過(guò)位點(diǎn)特異性誘變得到[MolecularCloning, A Laboratory Manual, Second Edition (分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版)，ColdSpring Harbor Laboratory Press (1989) ；Current Protocols in Molecular Biology(現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù))，John ffiley&Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)，Prop, Natl.Acad Sc1.，USA, 79, 6409(1982)，Gene, 34, 315(1985)，Nucleic AcidsResearch, 13, 4431 (1985), Proc.Natl Acad Sci USA, 82, 488(1985)] 例如，其可在具有帶有SEQ ID N0:2表示的氨 基酸序列的多肽的編碼核苷酸序列中導(dǎo)入位點(diǎn)特異性突變而得至IJ。被缺失、取代和/或添加飛氨基酸殘基數(shù)量沒(méi)有特別限定。適當(dāng)?shù)臄?shù)量是I至數(shù)十個(gè)，優(yōu)選I至20個(gè)，更優(yōu)選I至數(shù)個(gè)，更加優(yōu)選I至5個(gè)。編碼ASCT2的基因的實(shí)例包括SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列。編碼ASCT2的基因的實(shí)例還包括:其包含的DNA含有在SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列中具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、取代或添加的核苷酸序列、并編碼具有ASCT2功能的多肽的基因；其包含的DNA含有與SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列具有至少60%以上同源性、優(yōu)選80%以上同源性和更優(yōu)選95%以上同源性的核苷酸序列、并編碼具有ASCT2功能的多肽的基因；其包含的DNA在嚴(yán)格條件下與具有SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列的DNA雜交、并包含具有ASCT2功能的多肽的編碼DNA的基因；等等。在本發(fā)明中，在嚴(yán)格條件下雜交的DNA是指通過(guò)集落雜交、卩遼斑雜交、Southern雜交、DNA微陣列等，利用具有SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列的DNA作為探針而得到的DNA。這樣的DNA的具體實(shí)例是雜交的菌落或斑塊來(lái)源的DNA，其可如下進(jìn)行鑒別:在0.7至1.0mol/l氯化鈉存在下，利用其上有固定化PCR產(chǎn)物或寡聚DNA的濾光片或載玻片，在65 °C進(jìn)行雜交，然后在65 °C下用0.1至2-倍濃度的SSC溶液(1_倍濃度SSC溶液:150mmol/l氯化鈉和15mmol/l檸檬酸鈉)洗滌所述濾光片或載玻片。雜交可以根據(jù)下列文獻(xiàn)中記載的方法進(jìn)行:Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition(分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版)，Cold Spring Harbor Lab, Press (1989), Current Protocolsin Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù))，John ffiley&Sons (1987-1997) ;DNACloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition (DNA 克隆 1:核心技術(shù)，實(shí)用方法)，Oxford University (1995)。具體地說(shuō)，能夠雜交的DNA包括與SEQ IDNO:1表示的核苷酸序列具有至少60%以上同源性、優(yōu)選80%以上同源性、更優(yōu)選90%以上同源性和最優(yōu)選95%以上同源性的DNA。在編碼真核生物蛋白質(zhì)的核苷酸序列中，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)遺傳多態(tài)性。用于本發(fā)明的ASCT2基因還包括在核苷酸序列中通過(guò)這樣的多態(tài)性產(chǎn)生小修飾的基因。除非另有陳述，本發(fā)明所記載的同源性數(shù)值可以是利用技術(shù)人員已知的同源性檢索程序計(jì)算的數(shù)值。關(guān)于核苷酸序列，所述數(shù)值可以通過(guò)BLAST[J.MotBiol, 215, 403 (1990)]用缺省參數(shù)等計(jì)算，而關(guān)于氨基酸序列，所述數(shù)值可以利用BLAST2[Nucleic Acids Res.,25, 3389 (1997);Genome Res.,7,649 (1997);http://www.ncb1.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.htmll 用缺省參數(shù)等計(jì)算。
作為缺省參數(shù)，G (開(kāi)放缺口成本(cost to open gap))對(duì)于核苷酸序列來(lái)說(shuō)是5，對(duì)于氨基酸序列來(lái)說(shuō)是11 ;_E (延伸缺口成本(cost to extend gap))對(duì)于核苷酸序列來(lái)說(shuō)是2,對(duì)于氨基酸序列來(lái)說(shuō)是I ;_q (核苷酸錯(cuò)配的罰分(penalty for nucleotidemismatch))是-3 ;_r (核苷酸匹配的獎(jiǎng)勵(lì)(reward for nucleotide match))是 I ;_e (預(yù)期值(expect value))是10 ;_W (字長(zhǎng)(wordsize))對(duì)于核苷酸序列來(lái)說(shuō)是11個(gè)殘基,對(duì)于氨基酸序列來(lái)說(shuō)是3個(gè)殘基；-y (以比特計(jì)blast延伸的下降值(X) (dropoff (X) forblast extensions in bits))對(duì)于blastn來(lái)說(shuō)是20,對(duì)于blastn之外的程序來(lái)說(shuō)是7 ;_X(以比特計(jì)的缺口比對(duì)的 X 下降值(X dropoff value for gapped alignment in bits))是15 ;和_Z(以比特計(jì)的缺口比對(duì)的最終X下降值(final X dropoff value for gappedalignment in bits))對(duì) blastn 是 50 和對(duì)于 blastn 之外的程序是 25(http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。包含SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的部分序列的多肽可通過(guò)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法制備，例如通過(guò)部分缺失編碼SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的DNA、并培養(yǎng)導(dǎo)入了包含所述部分缺失的DNA的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體而制備。基于這樣構(gòu)建的多肽或DNA，還可以依照上面描述的相同方法，得到在SEQ ID N0:2表示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽。還可以通過(guò)化學(xué)合成方法，例如芴基甲氧基羰基(Fmoc)法、叔丁氧基羰基(tBoc)法等，生產(chǎn)包含SEQ ID NO: 2表示的氨基酸序列的部分序列的多肽，或在SEQ ID NO: 2表示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽。本發(fā)明ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的實(shí)例包括根據(jù)SEQ ID NO:2表示的多肽的氨基酸序列，通過(guò)已知的跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)程序預(yù)測(cè)的區(qū)域，所述預(yù)測(cè)程序是S0SUI(http;//SOSu1.proteome.bi0.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html)、TMHMM 第二版(http: /www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/), ExPAsy Proteomics Server (http: //Ca.expasy.0rg/)等。具體地說(shuō)，范例包括在74至98位、154至224位、287至305位、357至376位和420至425位的五個(gè)區(qū)，它們是ExPASy Proteomics Server預(yù)測(cè)的細(xì)胞外區(qū)域。或者，范例包括在65至88位、152至224位、288至306位、361至380位和447至451位的五個(gè)區(qū)，它們是文獻(xiàn)[J.Biol.Chemistry, 271.18657(1996)]或[J.Virology, 73, 4470 (1999)]預(yù)測(cè)的細(xì)胞外區(qū)域。在本發(fā)明中，所述五個(gè)細(xì)胞外區(qū)域從N-末端側(cè)起順序表示為ELl區(qū)域、EL2區(qū)域、EL3區(qū)域、EL4區(qū)域和EL5區(qū)域。例如，在SEQ ID N0:2表示的ASCT2多肽的氨基酸序列中的EL2區(qū)域?qū)?yīng)154至224位或152至224位。本發(fā)明的單克隆抗體與ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合，優(yōu)選與ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域中以上所述的ELl至EL5結(jié)合，更優(yōu)選至少與ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域中的EL2結(jié)合。本發(fā)明中ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的天然三維結(jié)構(gòu)可以是任意結(jié)構(gòu)，只要它具有的三維結(jié)構(gòu)等同于由具有SEQ ID N0:2表示的氨基酸序列的ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域以天然狀態(tài)形成的三維結(jié)構(gòu)即可。
本發(fā)明的抗體或其抗體片段是否特異性識(shí)別ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的天然三維結(jié)構(gòu)并與所述細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合，可通過(guò)利用固相夾心法等的放射免疫分析，或通過(guò)利用例如酶免疫分析(ELISA)法等的ASCT2表達(dá)細(xì)胞的已知免疫檢測(cè)方法來(lái)證實(shí)，優(yōu)選能夠研究抗體與特定抗原和表達(dá)所述特定抗原的細(xì)胞結(jié)合的方法，例如熒光細(xì)胞染色法。例如，具體例子包括利用FMAT8100HTS系統(tǒng)的熒光抗體染色法(Applied Biosystems制造)[CancerImmunol.1mmunother, 36, 373(1993)]等，利用流式細(xì)胞術(shù)突光細(xì)胞染色法，利用Biacore系統(tǒng)的表面等離子體共振(GE Healthcare制造)等，或其它方法。此外，已知的免疫學(xué)檢測(cè)方法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition (單克隆抗體-原理和實(shí)踐，第三版)，Academic Press (1996) ；Antibodies-A Laboratory Manual (抗體-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Monoclonal AntibodyExperimental Manual (單克隆抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè))，Kodan-sha Scientific (1987)]等可加以組合來(lái)驗(yàn)證結(jié)合。在本發(fā)明中，表達(dá)ASCT2的細(xì)胞可以是任意細(xì)胞，只要它表達(dá)ASCT2即可，例子包括天然存在于人體的細(xì)胞、從天然存在于人體的細(xì)胞建立的細(xì)胞系、通過(guò)基因重組技術(shù)得到的細(xì)胞等等。天然存在于人體的細(xì)胞包括在癌癥患者體內(nèi)表達(dá)多肽的細(xì)胞，例如通過(guò)活組織檢查得到的在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)ASCT2的細(xì)胞等。從天然存在于人體的細(xì)胞建立的細(xì)胞系的例子包括通過(guò)建立從上述癌癥患者得到的ASCT2-表達(dá)細(xì)胞而制備的細(xì)胞系中，表達(dá)ASCT2的細(xì)胞系，例子還包括多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系KMS-1l [人類科學(xué)研究資源庫(kù)(HSRRB)序號(hào)JCRBl 179]，RPMI8226 (HSRRB序號(hào):JCRB0034)等。通過(guò)基因重組技術(shù)得到的細(xì)胞的具體例子可包括通過(guò)將包含ASCT2-編碼cDNA的表達(dá)載體導(dǎo)入昆蟲(chóng)細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞等得到的ASCT2-表達(dá)細(xì)胞，等等。本發(fā)明的單克隆抗體包括通過(guò)雜交瘤生產(chǎn)的抗體和通過(guò)用包含抗體編碼基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體生 產(chǎn)的重組抗體。雜交瘤可以例如如下制備:制備表達(dá)ASCT2作為抗原的上述細(xì)胞，從用所述抗原免疫的動(dòng)物誘導(dǎo)抗原特異性的抗體生產(chǎn)細(xì)胞，和將該抗體生產(chǎn)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。而抗-ASCT2抗體可以如下得到:培養(yǎng)雜交瘤或?qū)⑺鲭s交瘤細(xì)胞施用到動(dòng)物中以在所述動(dòng)物中引起腹水腫瘤，分離和提純所述培養(yǎng)物或腹水。用抗原免疫的動(dòng)物可以是任何動(dòng)物，只要可以制備雜交瘤即可，小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、兔子等都適合使用。本發(fā)明的抗體還包括從這樣的動(dòng)物得到具有抗體生產(chǎn)活性的細(xì)胞，并在體外免疫之后，與骨髓瘤細(xì)胞融合得到的雜交瘤生產(chǎn)的抗體。本發(fā)明的雜交瘤生產(chǎn)的單克隆抗體的具體例子可以包括雜交瘤KM3998生產(chǎn)的抗體KM3998、雜交瘤KM4000生產(chǎn)的抗體KM4000、雜交瘤KM4001生產(chǎn)的抗體KM4001、雜交瘤KM4008生產(chǎn)的抗體KM4008、雜交瘤KM4012生產(chǎn)的抗體KM4012、雜交瘤KM4018生產(chǎn)的抗體KM4018等。雜交瘤KM4008和KM4012已經(jīng)根據(jù)布達(dá)佩斯公約，在2008年5月I日保藏獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心，保藏號(hào)分別為FERM BP-10962和FERMBP-10963。此外，本發(fā)明的單克隆抗體還包括與以上所述雜交瘤生產(chǎn)的抗體所結(jié)合的表位相結(jié)合的單克隆抗體。本發(fā)明的重組抗體包括通過(guò)基因重組生產(chǎn)的抗體，例如人嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體和其抗體片段。在重組抗體當(dāng)中，具有單克隆抗體的共有特性、即免疫原性低和血液半衰期延長(zhǎng)的重組抗體優(yōu)選作為治療藥。所述重組抗體的例子包括利用重組技術(shù)修飾上述單克隆抗體得到的重組抗體。本發(fā)明的重組抗體的例子包括:其中抗體的重鏈可變區(qū)(以下稱為VH)的互補(bǔ)性決定區(qū)(以下稱為⑶R1、⑶R2和⑶R3)分別包含SEQ ID NOs:26,27和28表示的氨基酸序列，和/或抗體的輕鏈可變區(qū)(以下稱為VL)的⑶R1、⑶R2和⑶R3分別包含SEQ IDNOs: 29、30和31表示的氨基酸序列的抗體；其中抗體的VH的⑶R1XDR2和⑶R3分別包含SEQ ID NOs: 32、33和34表示的氨基酸序列，和/或抗體的VL的CDRl、CDR2和CDR3分別包含SEQ ID NOs:35,36和37表示的氨基酸序列的重組抗體；其中抗體的VH的CDR1、CDR2和CDR3分別包含SEQ ID N0s:49、50和51表示的氨基酸序列，和/或抗體的VL的CDR1、⑶R2和⑶R3分別包含SEQ ID N0s:52、53和54表示的氨基酸序列的重組抗體；等等。人嵌合抗體是包含非人動(dòng)物的抗體的VH和VL、以及人類抗體的重鏈恒定區(qū)(以下稱為CH)和輕鏈恒定區(qū)(以下稱為CL)的抗體。具體地說(shuō)，本發(fā)明的人嵌合抗體可以如下生產(chǎn):從生產(chǎn)特異性識(shí)別ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的天然三維結(jié)構(gòu)并與所述細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤獲得編碼VH和VL的cDNA，將它們各插入包含編碼人類抗體的CH和CL的DNA的動(dòng)物細(xì)胞用表達(dá)載體從而構(gòu)建用于表達(dá)人嵌合抗體的載體，然后將所述載體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞以表達(dá)所述抗體。對(duì)于人嵌合抗體的CH來(lái)說(shuō)，可以使用任何CH，只要它屬于人免疫球蛋白(以下稱為“hlg”)即可，并優(yōu)選屬于hlgG類別的CH，并可以使用屬于hlgG類別的任一亞類，例如hIgGl、hIgG2、hIgG3jPhIgG4。對(duì)于人嵌合抗體的CL來(lái)說(shuō)，可以使用任何CL，只要它屬于hlg類別即可，可以使用屬于K類或λ類的CL。本發(fā)明的人嵌合抗體的例子包括`:其中抗體的VH包含SEQ ID NO: 19表示的氨基酸序列而抗體的VL包含SEQ ID NO: 21表示的氨基酸序列的人嵌合抗體；其中抗體的VH包含SEQ ID NO: 23表示的氨基酸序列而抗體的VL包含SEQ ID NO: 25表示的氨基酸序列的人嵌合抗體；其中抗體的VH包含SEQ ID Ν0:46表示的氨基酸序列而抗體的VL包含SEQ IDNO:48表示的氨基酸序列的人嵌合抗體等。具體的例子包括人嵌合抗體cKM4008、cKM4012、CKM4018 等。人源化抗體是其中源自非人動(dòng)物抗體的VH和VL的CDR的氨基酸序列被移植到人類抗體的VH和VL的適當(dāng)位置中的抗體，也被稱為人⑶R移植抗體、重構(gòu)抗體(reshaped-antibody)等。本發(fā)明的人源化抗體可以如下產(chǎn)生:構(gòu)建編碼抗體可變區(qū)(以下稱為“V區(qū)”)的cDNA，其中源自于非人動(dòng)物的、由生產(chǎn)特異性識(shí)別ASCT2的三維結(jié)構(gòu)并與所述細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤產(chǎn)生的抗體的VH和VL的CDR的氨基酸序列，被移植到合適的人類抗體的VH和VL的構(gòu)架中(在后文中稱為“FR”)；將cDNA分別插入到用于動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的、含有人類抗體的CH和CL的編碼基因的載體中，從而構(gòu)建人源化抗體表達(dá)載體；以及將所述載體導(dǎo)入到動(dòng)物細(xì)胞中以表達(dá)和生產(chǎn)人源化抗體。對(duì)于人源化抗的VH和VL的FR的氨基酸序列來(lái)說(shuō)，可以使用任何氨基酸序列，只要它們分別是源自于人類抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列即可。例子包括在數(shù)據(jù)庫(kù)例如蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank)中登記的人類抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列、在例如美國(guó)衛(wèi)生與人類服務(wù)部(Dept.Health and Human Services)的《免疫學(xué)重要的蛋白序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest) (1991)中描述的人類抗體的VH和VL的每個(gè)亞組FR的共有氨基酸序列，等等。對(duì)于人源化抗體的CH來(lái)說(shuō)，可以使用任何CH，只要它屬于hlg類別即可，優(yōu)選的是hlgG類別的，并可以使用屬于hlgG類別的任何一個(gè)亞類，例如hlgGl、hIgG2、hIgG3和hIgG4。對(duì)于人源化抗體的CL來(lái)說(shuō)，可以使用任何CL，只要它屬于hlg類別即可，并可以使用屬于K類別或λ類別的CL。本發(fā)明的人源化抗體的具體例子包括下面的人源化抗體:其中抗體的VH包含SEQID NO:71表示的氨基酸序列，或其中在SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列中選自第2位Val、第9位Ser、第20位Val、第30位Ser、第38位Arg、第46位Glu、第86位Leu、第93位Val、第95位Tyr和第116位Val的至少一個(gè)氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列，和/或其中抗體的VL包含SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列，或其中選自SEQ ID N0:72表示的氨基酸序列中第8位Pro、第15位Val、第38位Gin、第43位Ala、第44位Pro、71位Phe和第87位Tyr的至少一個(gè)氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列；等等。在這方面，導(dǎo)入的修飾數(shù)量沒(méi)有限制。抗體的VH的氨基酸序列的例子優(yōu)選包括:包含的氨基酸序列中SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列的第9位Ser、第20位Val、第38位Arg、第46位Glu、第93位Val、第95位Tyr和第116位Val被其它氨基酸殘基取代的人源化抗體；包含的氨基酸序列中SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列的第20位Val、第46位Glu、第95位Tyr和第116位Val被其它氨基酸殘基取代的人源化抗體；或包含的氨基酸序列中SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列的第46位Glu和第95位Tyr被其它氨基酸殘基取代的人源化抗體。通過(guò)上述氨基酸修飾得到的抗體的VH的氨基酸序列可包括，例如，其中在SEQ IDNO:71表示的氨基酸序列中引入選自Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸修飾中的至少一個(gè)修飾的氨基酸序列。導(dǎo)入十個(gè)修飾的氨基酸序列的具體例子包括其中在SEQ ID N0:71表示的氨基酸序列中導(dǎo)入Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列。在SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列中導(dǎo)入九個(gè)修飾的VH的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位 Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位Arg、 Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，和Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列。其中在SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列中導(dǎo)入八個(gè)修飾的VH的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val.Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位L eu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val.1le取代第20位Val.Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val.1le取代第20位Val.Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val.1le取代第20位Val.Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位SeiN Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr,iP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr,iP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg>Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，`Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr,iP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg>Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr,iP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位Arg、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser>Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser>Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser>Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，和Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser>Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列。其中在SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列中導(dǎo)入七個(gè)修飾的VH的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位 Leu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列。其中在SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列中導(dǎo)入六個(gè)修飾的VH的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取 代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列。
其中在SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列中導(dǎo)入五個(gè)修飾的VH的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列。其中在SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列中導(dǎo)入四個(gè)修飾的VH的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列， Pro取代第9位Ser、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列等。其中在SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列中導(dǎo)入三個(gè)修飾的VH的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、和Lys取代第38位Arg的氨基酸序列，
Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Lys取代第38位Arg、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Lys取代第38位Arg、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Lys取代第38位Arg、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Lys取代第38位Arg、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Lys取代第46位Glu、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Lys取代第46位Glu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Lys取代第46位Glu、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，
Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，
Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Thr取代第93位Val和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列。其中在SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列中導(dǎo)入兩個(gè)修飾的VH的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Ile取代第2位Val、和Pro取代第9位Ser的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、和Ile取代第20位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、和Thr取代第30位Ser的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、和Lys取代第38位Arg的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、和Val取代第86位Leu的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，
Ile取代第2位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、和Ile取代第20位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、和Thr取代第30位Ser的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、和Lys取代第38位Arg的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、和Val取代第86位Leu的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、和Thr取代第30位Ser的氨基酸序列，

Ile取代第20位Val、和Lys取代第38位Arg的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、和Val取代第86位Leu的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Thr取代第30位Ser、和Lys取代第38位Arg的氨基酸序列，Thr取代第30位Ser、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，Thr取代第30位Ser、和Val取代第86位Leu的氨基酸序列，Thr取代第30位Ser、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Thr取代第30位Ser、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第30位Ser、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、和Val取代第86位Leu的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Lys取代第46位Glu、和Val取代第86位Leu的氨基酸序列，Lys取代第46位Glu、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Lys取代第46位Glu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Lys取代第46位Glu、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Val取代第86位Leu、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Val取代第86位Leu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Val取代第86位Leu、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，和Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列。在SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列中導(dǎo)入一個(gè)修飾的VH的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Ile取代第2位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser的氨基酸序列，Ile取代第20位Val的氨基酸序列，Thr取代第30位Ser的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg的氨基酸序列，Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，Val取代第86位Leu的氨基酸序列， Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Phe取代第95位Tyr 的氨基酸序列，和Leu取代第116位Val的氨基酸序列。關(guān)于抗體的VL，優(yōu)選的例子包括:包含SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列中第15位Val、第43位Ala、第44位Pro、第71位Phe、和第87位Tyr被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列的人源化抗體包含SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列中第15位Val、第71位Phe和第87位Tyr被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列的人源化抗體，等等。通過(guò)上述氨基酸修飾得到的抗體的VL的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列中導(dǎo)入選自Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin,Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸修飾中的至少一個(gè)修飾的氨基酸序列。導(dǎo)入七個(gè)修飾的VL的氨基酸序列的具體例子包括:在SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列中導(dǎo)入Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列。在SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列中導(dǎo)入六個(gè)修飾的VL的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Tyr取代第71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，和Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列。在SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列中導(dǎo)入五個(gè)修飾的VL的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Arg取代第38位GlruThr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Arg取代第38位GlruVal取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Arg取代第38位Gin、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，
`
Thr取代第8位Pro、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Val取代第44位Pro和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Val取代第44位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，
Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，和Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、和Val取代第44位Pro的氨基酸序列。在SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列中導(dǎo)入四個(gè)修飾的VL的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Leu取代第15位Val、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、Tyr取代第71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Tyr取代第71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Tyr取代第71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，等等。在SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列中導(dǎo)入三個(gè)修飾的VL的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Thr取代 第8位Pro、Leu取代第15位Val、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Tyr取代第71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Val取代第44位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Val取代第44位Pro、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Tyr取代第71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Arg取代第38位Gin、Tyr取代第71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第43位Ala、Tyr取代第71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序
歹IN等等。在SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列中導(dǎo)入兩個(gè)修飾的VL的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Thr取代第8位Pro、和Leu取代第15位Val的氨基酸序列，Thr·取代第8位Pro、和Arg取代第38位Gln的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、和Thr取代第43位Ala的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、和Val取代第44位Pro的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、和Arg取代第38位Gln的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、和Thr取代第43位Ala的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、和Val取代第44位Pro的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Arg取代第38位Gin、和Thr取代第43位Ala的氨基酸序列，Arg取代第38位Gin、和Val取代第44位Pro的氨基酸序列，Arg取代第38位Gin、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Arg取代第38位Gin、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第43位Ala、和Val取代第44位Pro的氨基酸序列，Thr取代第43位Ala、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Thr取代第43位Ala、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Val取代第44位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Val取代第44位Pro、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Tyr取代71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列。在SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列中導(dǎo)入一個(gè)修飾的VL的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Thr取代第8位Pro的氨基酸序列，Leu取代第15位Val的氨基酸序列，Arg取代第38位Gln的氨基酸序列，Thr取代第43位Ala的氨基酸序列，Val取代第44位Pro的氨基酸序列，Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列。另外，本發(fā)明的人源化抗體的具體例子還包括:抗體的VH包含SEQ ID N0:71表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列的人源化抗體；抗體的VH包含SEQ ID NO: 76表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列的人源化抗體；抗體的VH包含SEQ ID NO: 78表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID N0:72表示的氨基酸序列的人源化抗體；抗體的VH包含SEQ ID N0:80表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列的人源化抗體；抗體的VH包含SEQ ID NO:82表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID N0:72表示的氨基酸序列的人源化抗體；抗體的VH包含SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID N0:84表示的氨基酸序列的人源化抗體；抗體的VH包含SEQ ID N0:76表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO: 84表示的氨基酸序列的人源化抗體；抗體的VH包含SEQ ID NO: 78表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO:84表示的氨基酸序列的人源化抗體；抗體的VH包含SEQ ID NO:80表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID N0:84表示的氨基酸序列的人源化抗體；抗體的VH包含SEQ ID NO:82表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID N0:84表示的氨基酸序列的人源化抗體等等。人類抗體本來(lái)是人體中天然存在的抗體，它還包括從人類抗體噬菌體文庫(kù)或產(chǎn)生人類抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物得到的抗體，所述噬菌體文庫(kù)或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是基于遺傳工程、細(xì)胞工程和發(fā)育工程的新進(jìn)展技術(shù)制備的。舉例而言，人體中存在的抗體可以如下制備:分離人外周血淋巴細(xì)胞，用EB病毒等感染使其永生化，然后將其克隆從而得到能夠生產(chǎn)所述抗體的淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)這樣得到的淋巴細(xì)胞，和從培養(yǎng)物的上清液提純所述抗體。人類抗體噬菌體文庫(kù)是通過(guò)將從人類B細(xì)胞制備的編碼抗體的基因插入到噬菌體基因中，而在噬菌體表面上表達(dá)抗體片段例如Fab和scFv的文庫(kù)。表達(dá)具有所需抗原結(jié)合活性的抗體片段的噬菌體，可以利用它與固定有抗原的基質(zhì)的結(jié)合活性作為指標(biāo)，從文庫(kù)中回收。抗體片段可以通過(guò)遺傳工程技術(shù)進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)楹袃蓷l完整的H鏈和兩條完整的L鏈的人類抗體分子。產(chǎn)生人類抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是細(xì)胞中整合了人類抗體基因的動(dòng)物。具體來(lái)說(shuō)，產(chǎn)生人類抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可 以如下制備:將編碼人類抗體的基因?qū)氲叫∈驟S細(xì)胞中，將ES細(xì)胞移植到另一只小鼠的早期胚胎中，然后使其發(fā)育。人類抗體可以從產(chǎn)生人類抗體的轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物如下制備:通過(guò)通常在非人類哺乳動(dòng)物中進(jìn)行的雜交瘤制備方法獲得產(chǎn)生人類抗體的雜交瘤，將獲得的雜交瘤進(jìn)行培養(yǎng)，并在培養(yǎng)上清液中形成和積累人類抗體。在構(gòu)成上述的抗體或抗體片段的氨基酸序列中，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺失、取代、插入或添加、但仍與上述抗體或其抗體片段具有相似活性的抗體或其抗體片段，也包括在本發(fā)明的抗體或抗體片段中。被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸數(shù)量是一個(gè)或多個(gè)，沒(méi)有具體的限制，但是它在通過(guò)已知方法例如位點(diǎn)定向誘變位點(diǎn)有可能進(jìn)行缺失、取代或添加的范圍內(nèi)，所述方法定向誘變描述在[Molecular Cloning, Second Edition (分子克隆，第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989);Current Protocols in MolecularBiology (現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù))，John Wiley&Sons (1987-1997) ; Nucleic AcidsResearch, 106487 (1982) Proc.Natl.Acad Sci USA, 796409 (1982) ; Gene, M315 (1985)，NucIeic Acids Research, 13, 4431(1985) ; Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 82, 488(1985)]等中。例如，數(shù)量為I到幾十個(gè)，優(yōu)選為I到20個(gè)，更優(yōu)選為I到10個(gè)，最優(yōu)選為I到5個(gè)。
上述抗體的氨基酸序列中“一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被缺失、取代、插入或添加”的表述意義如下。即，它意味著在同一序列和一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列中的任選位置上，存在著一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、取代、插入或添加。此外，缺失、取代、插入或添加可以同時(shí)發(fā)生，被取代、插入或添加的氨基酸可以是天然類型或非天然類型的。天然類型的氨基酸包括L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、L-半胱氨酸等。可互相取代的氨基酸的優(yōu)選例子顯示在下面。同樣組中的氨基酸可以互相取代。A組:亮氨酸，異亮氨酸，正亮氨酸，纈氨酸，正纈氨酸，丙氨酸，2-氨基丁酸，甲硫氨酸，O-甲基絲氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，環(huán)己基丙氨酸B組:天冬氨酸，谷氨酸，異天冬氨酸，異谷氨酸，2-氨基己二酸，2-氨基辛二酸C組:天冬酰胺，谷氨酰胺D組:賴氨酸，精氨酸，鳥(niǎo)氨酸，2，4- 二氨基丁酸，2，3_ 二氨基丙酸E組:脯氨酸，3-羥基脯氨酸，4-羥基脯氨酸F組:絲氨酸，蘇氨酸，高絲氨酸G組:苯丙氨酸，酪氨酸本發(fā)明的抗體片段包括Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、雙抗體、dsFv、包含CDR的肽等。Fab是具有大約50，000的分子量并具有抗原結(jié)合活性的抗體片段，其中在蛋白酶一木瓜蛋白酶(在H鏈的224位切開(kāi)氨基酸殘基)處理IgG抗體分子獲得的片段中，H鏈的大約一半N-端側(cè)和整個(gè)L鏈通過(guò)二硫鍵結(jié)合在一起。本發(fā)明的Fab可以通過(guò)用木瓜蛋白酶處理特異性識(shí)別ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)并與所述細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合的單克隆抗體而產(chǎn)生。此外，F(xiàn)ab也可以通過(guò)將編碼抗體的Fab的DNA插入到原核生物表達(dá)載體或真核生物表達(dá)載體中，并將載體導(dǎo)入到原核生物或真核生物中以表達(dá)Fab來(lái)生產(chǎn)。F(ab’)2是具有大約100，000分子量并具有抗原結(jié)合活性的抗體片段，并包含通過(guò)用酶一胃蛋白酶消化IgG的絞鏈區(qū)中兩個(gè)二硫鍵的下半部而得到的、在所述鉸鏈位置中結(jié)合的兩個(gè)Fab區(qū)。本發(fā)明的F(ab’)2可以通過(guò)用胃蛋白酶處理特異性識(shí)別ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)并與所述細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合的單克隆抗體而產(chǎn)生。F(ab’)2還可以通過(guò)硫醚鍵或二硫鍵結(jié)合下述的Fab’而制備。Fab’是具有大約50，000分子量和抗原結(jié)合活性的抗體片段，是通過(guò)切開(kāi)上述卩(&13’)2的鉸鏈區(qū)中的二硫鍵得到的。本發(fā)明的Fab’可以通過(guò)用還原劑例如二硫蘇糖醇處理特異性識(shí)別ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)并與所述細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合的F (ab’)2來(lái)生產(chǎn)。此外，F(xiàn)ab’也可以通過(guò)將編碼抗體的Fab’片段的DNA插入到原核生物表達(dá)載體或真核生物表達(dá)載體中、并將載體導(dǎo)入到原核 生物或真核生物中以表達(dá)Fab’來(lái)生產(chǎn)。scFv是其中一條VH鏈和一條VL鏈?zhǔn)褂眠m當(dāng)?shù)碾慕宇^(在后文中稱為“P”)連接在一起的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，并且是具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。本發(fā)明的scFv可以如下生產(chǎn):獲得特異性識(shí)別ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)并與所述細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合的單克隆抗體的VH和VL的編碼cDNA，構(gòu)建編碼scFv的DNA，將所述DNA插入到原核生物表達(dá)載體或真核生物表達(dá)載體中，然后將表達(dá)載體導(dǎo)入到原核生物或真核生物中以表達(dá)scFv。雙抗體是其中scFvs被二聚體化的抗體片段，是具有二價(jià)抗原結(jié)合活性的抗體片段。兩個(gè)抗原在二價(jià)抗原結(jié)合活性方面可以相同或不同的。本發(fā)明的雙抗體可以如下生產(chǎn):獲得特異性識(shí)別ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)并與所述細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合的單克隆抗體的VH和VL的編碼cDNA，構(gòu)建編碼scFv的DNA使得蛋白接頭的氨基酸序列長(zhǎng)度是8個(gè)殘基以下，將所述DNA插入到原核生物表達(dá)載體或真核生物表達(dá)載體中，然后將表達(dá)載體導(dǎo)入到原核生物或真核生物中以表達(dá)雙抗體。dsFv是通過(guò)將VH和VL的各一個(gè)氨基酸殘基被半胱氨酸殘基取代的多肽經(jīng)半胱氨酸殘基之間的二硫鍵連接在一起而獲得的。用半胱氨酸殘基取代的氨基酸殘基，可以按照已知的方法(Protein Engineering, 7, 697-704(1994)),根據(jù)抗體的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)進(jìn)行選擇。本發(fā)明的dsFv可以如下生產(chǎn):獲得特異性識(shí)別ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)并與所述細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合的單克隆抗體的VH和VL的編碼cDNA，構(gòu)建編碼dsFv的DNA，將所述DNA插入到原核生物表達(dá)載體或真核生物表達(dá)載體中，然后將表達(dá)載體導(dǎo)入到原核生物或真核生物中以表達(dá)dsFv。包含⑶R的肽通過(guò)包含VH或VL的一個(gè)或多個(gè)⑶R而構(gòu)成。包含多個(gè)⑶R的肽可以直接或通過(guò)適當(dāng)?shù)碾慕宇^結(jié)合。本發(fā)明的含有CDR的肽，可以如下生產(chǎn):構(gòu)建特異性識(shí)別ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)并與所述細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合的單克隆抗體的VH和VL的CDR的編碼DNA，將所述DNA插入到原核生物表達(dá)載體或真核生物表達(dá)載體中，然后將表達(dá)載體導(dǎo)入到原核生物或真核生物中以表達(dá)肽。含有CDR的肽也可以通過(guò)化學(xué)合成方法例如Fmoc法或tBoc法來(lái)生產(chǎn)。本發(fā)明的單克隆抗體包括抗體結(jié)合物，其中特異性識(shí)別ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)并與所述細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合的單克隆抗體或其抗體片段與放射性同位素、低分子藥齊U、高分子量藥劑、蛋白質(zhì)、治療抗體等用化學(xué)或遺傳學(xué)手段進(jìn)行結(jié)合。本發(fā)明的抗體結(jié)合物可以如下產(chǎn)生:用化學(xué)手段將放射性同位素、低分子藥劑、高分子量藥劑、蛋白質(zhì)、治療抗體等與本發(fā)明的特異性識(shí)別ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)并與所述細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合的單克隆抗體或其抗體片段的H鏈或L鏈的N末端側(cè)或C末端側(cè)、所述抗體或抗體片段的適當(dāng)?shù)娜〈騻?cè)鏈、所述抗體或抗體片段中的糖鏈等結(jié)合[抗體工學(xué)入門(mén)，地人書(shū)館(1994)]。所述抗體結(jié)合物還可以通過(guò)遺傳學(xué)手段產(chǎn)生:將本發(fā)明中特異性識(shí)別ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)并與所述細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合的單克隆抗體或其抗體片段的編碼DNA與待結(jié)合的另一種編碼蛋白質(zhì)或治療抗體的DNA連接，將所述DNA插入表達(dá)載體，并將所述表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。放射性同位素包括1311、1251、9°Y、64CU、199Tc、77LU、211At等。放射性同位素可以通過(guò)氯胺-T方法等與所述抗體結(jié)合。螯合放射性同位素的物質(zhì)還可以與抗體結(jié)合。螯合劑包括1-異硫氰酸基并苯甲基-3-甲基二亞乙基-三胺五乙酸(MX-DTPA)等等。低分子藥劑包括:抗腫瘤劑例如烷基化劑，亞硝基脲劑，代謝拮抗劑，抗生素物質(zhì)，來(lái)源于植物的生物堿，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，激素療法藥劑，激素拮抗劑，芳香化酶抑制劑，P糖蛋白抑制劑，鉬復(fù)合物衍生物，M期抑制劑和激酶抑制劑[臨床腫瘤學(xué)，癌癥化學(xué)療法社(1996)]，類固醇劑例如氫化可的松和潑尼松龍，非類固醇藥劑例如阿司匹林和吲哚美辛，免疫調(diào)節(jié)劑例如金硫代蘋(píng)果酸鹽，青霉胺，免疫抑制劑例如環(huán)磷酰胺和硫唑嘌呤，抗炎劑例如抗組胺劑，例如馬來(lái)酸氯苯那敏和氯馬斯汀[炎癥和抗炎癥療法，醫(yī)齒藥出版株式會(huì)社(1982)]等。抗腫瘤劑的例子包括阿米福汀(Ethyol)、順鉬、達(dá)卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、氮芥(氮芥子氣)、鏈脲佐菌素、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(亞德里亞霉素)、表柔比星、吉西他濱(Gemsal)、柔紅霉素、丙卡巴肼、絲裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿、博來(lái)霉素、道諾霉素、培洛霉素、雌氮芥、紫杉醇(泰素)、多烯紫衫醇(泰素帝)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡鉬、奧沙利鉬、奈達(dá)鉬、克拉曲濱、喜樹(shù)堿、10-羥基-7-乙基喜樹(shù)堿(SN38)、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、羥基脲、異環(huán)磷酰胺、伊達(dá)比星、美司那、伊立替康(CPT-11)、鹽酸拓?fù)涮婵怠⒚淄休祯⑼負(fù)涮婵怠⒘帘鹆帧⒓椎卦型⒚婪▉觥€基嘌呤、輕基脲(hydroxycarbamide)、普卡霉素、米托坦、培門(mén)冬酶、戊制菌素、哌泊溴烷、鏈脲霉素、他莫昔芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林、氟他胺、替尼泊苷、睪內(nèi)酯、硫鳥(niǎo)嘌呤、硫替哌、尿嘧啶氮芥、長(zhǎng)春瑞賓、苯丁酸氦芥、氫化可的松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、長(zhǎng)春地辛、尼莫司汀、司莫司汀、卡培他濱、雷替曲塞、氮胞苷、UFT、奧沙利鉬、吉非替尼(易瑞沙)、伊馬替尼(STI571)、埃羅替尼、FMS-樣酪氨酸激酶3 (Flt3)抑制劑、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)抑制劑、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)抑制劑、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑例如易瑞沙和特羅凱、根赤殼菌素、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格爾德霉素、雷帕霉素、安丫唆、全反式視黃酸、沙利度胺、來(lái)那度胺、阿那曲唑、法曲唑、來(lái)曲唑、依西美坦、硫代蘋(píng)果酸金、D-青霉胺、布西拉明、硫唑嘌呤、咪唑立賓、環(huán)孢霉素、雷帕霉素、氫化可的松、蓓薩羅丁 (塔革雷汀)、他莫昔芬、地塞米松、孕激素物質(zhì)、雌激素物質(zhì)、阿那曲唑(瑞寧得)、來(lái)普隆、阿司匹林、Π引哚美辛、塞來(lái)考昔、硫唑嘌呤、青霉胺、硫代蘋(píng)果酸金、馬來(lái)酸氯苯那敏、氯苯那敏、氯馬斯汀、維A酸、蓓薩羅丁、砷、voltezomib、別嘌呤醇、加里剎霉素、替伊莫單抗、塔革雷汀、奧唑米星、克拉霉素、甲酰四氫葉酸、異環(huán)磷酰胺、酮康唑、氨 魯米特、蘇拉明、氨甲蝶呤、美登醇及其衍生物等。
將低分子藥劑與抗體結(jié)合的方法包括:所述藥劑與抗體的氨基通過(guò)戊二醛結(jié)合的方法，所述藥劑的氨基與抗體的羧基通過(guò)水溶性碳二亞胺連接的方法，等等。
高分子藥劑包括聚乙二醇(以下稱為“PEG”)、白蛋白、葡聚糖、聚氧乙烯、苯乙烯-馬來(lái)酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、羥丙基甲基丙烯酰胺等等。通過(guò)將這些高分子化合物與抗體或抗體片段結(jié)合，預(yù)期有下列作用:(I)提高對(duì)各種化學(xué)、物理或生物因子的穩(wěn)定性；(2)顯著延長(zhǎng)血液半衰期；(3)免疫原性消失，抑制抗體產(chǎn)生；等等[生物結(jié)合物藥物，廣川書(shū)店(1993)]。例如，將PEG與抗體結(jié)合的方法包括使抗體與PEG修飾試劑反應(yīng)[生物結(jié)合物藥物，廣川書(shū)店(1993)]。PEG修飾試劑包括賴氨酸的ε-氨基的修飾劑(特開(kāi)昭61-178926)、天冬氨酸和谷氨酸的羧基的修飾劑(特開(kāi)昭56-23587)、精氨酸的胍基的修飾劑(特開(kāi)平2-117920)等。
免疫刺激劑可以是任何被稱為免疫佐劑的天然產(chǎn)物。增強(qiáng)免疫原的藥劑的例子包括β (I — 3)葡聚糖(香菇多糖，裂裥菌素)、α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺(KRN7000)等。
蛋白質(zhì)包括激活免疫活性細(xì)胞例如NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或中性粒細(xì)胞的細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子；毒性蛋白等等。
細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子的例子包括干擾素(在后文中稱為“INF”)-α、INF-β、INF- y、白介素(后文稱為“IL”)-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)等。毒性蛋白包括篦麻毒素、白喉毒素、ONTAK等，還包括在蛋白中導(dǎo)入突變以便控制毒性的毒性蛋白。
治療性抗體包括針對(duì)通過(guò)結(jié)合抗體誘導(dǎo)凋亡的抗原的抗體、針對(duì)參與腫瘤的病態(tài)形成的抗原的抗體、調(diào)節(jié)免疫功能的抗體、以及與病變部位中血管生成有關(guān)的抗體。
與抗體的結(jié)合誘導(dǎo)凋亡的抗原包括分化簇(在后文中稱為“⑶”)19、⑶20、⑶21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80 (B7.l)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86 (B7.2)、II 類人類白細(xì)胞抗原(HLA)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)，等等。
參與腫瘤病態(tài)形成的抗原或調(diào)節(jié)免疫功能的抗體的抗原包括⑶4、⑶40、⑶40配體、B7 家族分子(CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3、B7-H4)、B7 家族分子的配體(CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1、BTLA )、0X-40、0X-40 配體、CD 137、腫瘤壞死因子(TNF )受體家族分子(DR4、DR5、TNFRU TNFR2)、誘導(dǎo)TNF相關(guān)的凋亡的配體受體(TRAIL)家族分子、TRAIL家族分子的受體家族(TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4)、核因子 κ B 配體(RANK)的受體激活劑、RANK配體、CD25、葉酸受體4、細(xì)胞因子[IL_la、IL-1 β、IL_4、IL_5、IL-6、IL-10、IL-13、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF) β ,TNFa，等等]、這些細(xì)胞因子的受體、趨化因子(SLC、ELC、1-309、TARC、MDC、CTACK等)以及這些趨化因子的受體。
在病變部位抑制血管生成的抗體的抗原包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、促血管生成素、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、EGF、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(16 )、促紅細(xì)胞生成素化 0)、了6 0、幾-83 11丨1丨11、50 -1、它們的受體，等等。
帶有蛋白質(zhì)或治療抗體的融合抗體可以如下生產(chǎn):將編碼單克隆抗體或抗體片段的cDNA與編碼蛋白質(zhì)的cDNA連接，構(gòu)建編碼融合抗體的DNA，將所述DNA插入原核生物或真核生物的表達(dá)載體，然后將所述表達(dá)載體導(dǎo)入原核生物或真核生物以表達(dá)融合抗體。
在上述抗體結(jié)合物在本發(fā)明中用于檢測(cè)方法、定量測(cè)定方法、檢測(cè)試劑、定量測(cè)定試劑或診斷試劑的情況下，特異性識(shí)別ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)并與所述細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合的單克隆抗體或其抗體片段所結(jié)合的藥劑的例子包括用于常規(guī)免疫檢測(cè)或測(cè)量方法的標(biāo)記物。所述標(biāo)記物包括酶例如堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶和熒光素酶，發(fā)光物質(zhì)例如吖啶酯和洛芬堿，熒光物質(zhì)例如異硫氰酸熒光素(FITC)和四甲基若丹明異硫氰酸酯(RITC)，坐坐寸寸ο
此外，本發(fā)明包括抑制由`ASCT2細(xì)胞內(nèi)攝取氨基酸的單克隆抗體，和其抗體片段。
本發(fā)明的抗體或其抗體片段對(duì)由ASCT2介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)攝取氨基酸的抑制活性的評(píng)價(jià)方法的例子包括:使抗體或其抗體片段與表達(dá)ASCT2的正常或癌細(xì)胞反應(yīng)，然后利用活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑等評(píng)價(jià)谷氨酰胺依賴性增殖的抑制[J.Surgical Research, 90, 149 (2000)]；使抗體或其抗體片段與表達(dá)ASCT2的正常或癌細(xì)胞反應(yīng)，然后利用適當(dāng)?shù)脑O(shè)備例如閃爍計(jì)數(shù)器評(píng)價(jià)氨基酸例如放射性物質(zhì)標(biāo)記的丙氨酸的攝取的抑制[J.BioIChem.，271, 14883 (1996)]，等等。
另外，本發(fā)明包括具有細(xì)胞毒性例如補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性或抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC活性)的單克隆抗體和其抗體片段。
本發(fā)明的抗體或其抗體片段對(duì)抗原陽(yáng)性細(xì)胞系的CDC活性或ADCC活性可以通過(guò)已知的測(cè)定法進(jìn)行評(píng)價(jià)[Cancer Tmmunol Immunother, 36, 373 (1993) I。
此外，本發(fā)明包括具有凋亡誘導(dǎo)活性的單克隆抗體，和其抗體片段。
此外，本發(fā)明包括不與小鼠ASCT2結(jié)合、但是與人ASCT2結(jié)合的單克隆抗體，和其抗體片段。
此外，本發(fā)明包括與人ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域中至少EL2區(qū)域結(jié)合的單克隆抗體和其抗體片段，例如，與選自SEQ ID N0:2表示的氨基酸序列中154、159至160、163至171、173至174、177、188、204至205,207,210至212、和214至223處的氨基酸中的至少任何一個(gè)氨基酸結(jié)合的單克隆抗體和其抗體片段。
本發(fā)明的抗體或其抗體片段的結(jié)合特異性可以通過(guò)已知的表位分析法評(píng)價(jià)，例如根據(jù)氨基酸序列信息，測(cè)量與其中適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)被小鼠ASCT2的序列置換的人/小鼠嵌合ASCT2的結(jié)合活性。
本發(fā)明還涉及與ASCT2有關(guān)的疾病的治療藥，其包含特異性識(shí)別ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)并與所述細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合的單克隆抗體或其抗體片段作為活性成分。
與ASCT2有關(guān)的疾病沒(méi)有限制，只要它是與表達(dá)ASCT2的細(xì)胞有關(guān)的疾病即可，例如癌癥。
癌癥包括血液癌、乳腺癌、子宮癌、大腸癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、腎癌、直腸癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前列腺癌和胰腺癌。優(yōu)選的癌癥例子包括血液癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌和前列腺癌。血液癌的例子包括骨髓性白血病、淋巴細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、霍奇金氏(Hodgkin’ s)淋巴瘤和非霍奇氏金淋巴瘤。
本發(fā)明的治療藥 包括包含本發(fā)明的上述單克隆抗體或抗體片段作為活性成分的治療藥。
包含本發(fā)明的抗體或其抗體片段、或其結(jié)合物的治療藥可以只包含所述抗體或其抗體片段、或其結(jié)合物作為活性成分。通常優(yōu)選治療藥制備成通過(guò)在制藥技術(shù)領(lǐng)域中眾所周知的適當(dāng)方法并通過(guò)將其與一種或多種藥用可接受的載體混合而生產(chǎn)的藥物制劑。
優(yōu)選通過(guò)治療最有效的途徑施用所述治療藥。實(shí)例包括經(jīng)口給藥和腸胃外給藥，例如經(jīng)頰、氣管、直腸、皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥，優(yōu)選靜脈內(nèi)給藥。
治療藥可以是噴霧劑、膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏、帶劑(tape)等的形式。
雖然給藥劑量或頻率根據(jù)目標(biāo)治療效果、給藥方法、治療時(shí)間、年齡、體重等而異，但通常是成人每天10 μ g/kg至8mg/kg。
此外，本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測(cè)或測(cè)量ASCT2的方法、免疫學(xué)檢測(cè)或測(cè)量ASCT2的試齊U、免疫學(xué)檢測(cè)或測(cè)量表達(dá)ASCT2的細(xì)胞的方法和診斷與ASCT2有關(guān)的疾病的診斷試劑，它們包含特異性識(shí)別ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的天然三維結(jié)構(gòu)并與所述細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合的單克隆抗體或其抗體片段作為活性成分。
在本發(fā)明中，檢測(cè)或測(cè)量ASCT2量的方法可以是任何已知的方法。例如，包括免疫檢測(cè)或測(cè)量方法。
免疫學(xué)檢測(cè)或測(cè)量方法是利用標(biāo)記抗原或抗體來(lái)檢測(cè)或確定抗體量或抗原量的方法。免疫學(xué)檢測(cè)或測(cè)量方法的實(shí)例包括放射性物質(zhì)標(biāo)記的免疫抗體法(RIA)、酶免疫分析(EIA或ELISA)、熒光免疫分析(FIA)、發(fā)光免疫分析、Western印跡法、物理化學(xué)方法等。
與ASCT2有關(guān)的上述疾病可以通過(guò)利用本發(fā)明的單克隆抗體或抗體片段來(lái)檢測(cè)或測(cè)量表達(dá)ASCT2的細(xì)胞進(jìn)行診斷。
至于檢測(cè)表達(dá)ASCT2的細(xì)胞，可以使用已知的免疫學(xué)檢測(cè)方法，并優(yōu)選使用免測(cè)沉淀法、熒光細(xì)胞染色法、免疫組織染色法等。利用FMAT8100HTS系統(tǒng)(AppliedBiosystem)的突光抗體染色法等也可以使用。
在本發(fā)明中，用于檢測(cè)或測(cè)量ASCT2的生物體樣品沒(méi)有特別的限制，只要它可能含有表達(dá)ASCT2的細(xì)胞即可，所述樣品例如組織細(xì)胞、血液、血漿、血清、胰液、尿、糞便、組織液或培養(yǎng)液。
含有單克隆抗體或其抗體片段、或其結(jié)合物的診斷試劑還可以根據(jù)目的診斷法包含用于執(zhí)行抗原-抗體反應(yīng)的試劑或用于檢測(cè)所述反應(yīng)的試劑。執(zhí)行抗原-抗體反應(yīng)的試劑包括緩沖液、鹽等等。檢測(cè)試劑包括通常用于免疫學(xué)檢測(cè)或測(cè)量方法的試劑，例如識(shí)別所述單克隆抗體、其抗體片段、或結(jié)合物的標(biāo)記第二抗體和與所述標(biāo)記對(duì)應(yīng)的底物。
本發(fā)明可提供單克隆抗體或其抗體片段，所述單克隆抗體特異性識(shí)別系統(tǒng)ASC氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(以下稱為“ASCT2”)的細(xì)胞外區(qū)域的天然三維結(jié)構(gòu)并與該細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合；產(chǎn)生所述抗體的雜交瘤；編碼所述抗體的DNA ;包含所述DNA的載體；可通過(guò)導(dǎo)入所述載體獲得的轉(zhuǎn)化體；利用所述雜交瘤或轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生抗體或其抗體片段的方法；和利用所述抗體或其抗體片段的治療藥，以及利用所述抗體或其抗體片段的診斷試劑。。
下面具體描述本發(fā)明抗體的生產(chǎn)方法、疾病治療方法和疾病診斷方法。
1.單克隆抗體的制備方法
(I)抗原的制備
ASCT2或表達(dá)ASCT2作為抗原的細(xì)胞可通過(guò)將包含編碼全長(zhǎng)ASCT2或其部分長(zhǎng)度的cDNA的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌(Escherichia coli)、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞等中而得到。另外，ASCT2可從表達(dá)大量ASCT2的各種各樣的人類腫瘤細(xì)胞系、人類組織等中提純。可將該腫瘤細(xì)胞系和組織用作抗原。此外，具有ASCT2的部分序列的合成肽可通過(guò)化學(xué)合成方法例如Fmoc法或tBoc法制備并用作抗原。
本發(fā)明所用的ASCT2可例如通過(guò)在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼ASCT2的DNA進(jìn)行生產(chǎn)，利用在 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版)、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols inMolecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù))、John Wiley&Sons (1987-1997)等中記載的方法如下進(jìn)行。
首先，通過(guò)將包含 ASCT2編碼區(qū)的全長(zhǎng)cDNA插入到適合的表達(dá)載體的啟動(dòng)子下游而制備重組載體。這時(shí)，如果需要，具有適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度、含有基于全長(zhǎng)cDNA的多肽的編碼區(qū)域的DNA片段，該DNA片段可以代替上述的全長(zhǎng)cDNA使用。接下來(lái)，通過(guò)將重組載體導(dǎo)入適合表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，可以獲得產(chǎn)生ASCT2的轉(zhuǎn)化體。
表達(dá)載體可以是任何表達(dá)載體，只要它能夠在供使用的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制或者它能夠整合到含有適當(dāng)啟動(dòng)子的染色體中使得編碼所述多肽的DNA能夠被轉(zhuǎn)錄的位置即可。
宿主細(xì)胞可以是任何細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)目的基因即可。例子包括屬于大腸桿菌屬的微生物、例如大腸桿菌，酵母，昆蟲(chóng)細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)胞等。
當(dāng)使用原核生物例如大腸桿菌作為宿主細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選本發(fā)明中使用的重組載體在原核生物中可以自主復(fù)制，并含有啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合序列、編碼ASCT2的DNA以及轉(zhuǎn)錄終止序列。重組載體不必需具有轉(zhuǎn)錄終止序列，但是轉(zhuǎn)錄終止序列優(yōu)選設(shè)置在緊接結(jié)構(gòu)基因之后。重組載體還可以含有調(diào)控啟動(dòng)子的基因。
上述重組載體還優(yōu)選是其中核糖體結(jié)合序列Shine-Dalgamo序列與起始密碼子之間的間距調(diào)整到適當(dāng)?shù)木嚯x(例如6至18個(gè)核苷酸)的質(zhì)粒。
此外，編碼ASCT2的DNA的核苷酸序列可以用其它堿基取代，以便成為在宿主細(xì)胞中表達(dá)的適當(dāng)密碼子，從而改善目的ASCT2的生產(chǎn)率。
任何表達(dá)載體都可以使用，只要它能夠在所用的宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能即可。表達(dá)載體的例子包括pBTrp2、pBTacl、pBTac2 (都由Roche Diagnostics制造)、pKK233_2 (Pharmacia 制造)、pSE280 (Invitrogen 制造)、pGEMEX-1 (Promega 制造)、pQE-8 (QIAGEN 制造)、pKYPIO (特開(kāi)昭 58-110600)、pKYP200[Agricultural BiologicalChemistry, 48, 669(1984) ]、pLSAl[Agric.Biol.Chem.，53, 277(1989)]、pGELl [Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 82, 4306 (1985) 1、pBluescript II SK (-) (Stratagene 制造)、pTrs30 [從大腸桿菌 JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)制備]、pTrs32 [從大腸桿菌 JM109/pTrS32 (FERMBP-5408)制備]、pGHA2 [從大腸桿菌 IGHA2 (FERM BP-400)制備，特開(kāi)昭 60-221091]、pGKA2[從大腸桿菌 IGKA2(FERM BP-6798)制備，特開(kāi)昭 60-221091]、pTerm2 (US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUBllO、pTP5、pC194、pEG400 [J.Bacteriol., 172,2392 (1990) ]、pGEX (Pharmacia 制造)、pET 系統(tǒng)(Novagen 制造)、pME18SFL3，等等。
任何啟動(dòng)子都可以使用，只要它能夠在所使用的宿主細(xì)胞中起作用即可。例子包括源自于大腸桿菌、噬菌體等的啟動(dòng)子，例如trp啟動(dòng)子(Ptrp)、lac啟動(dòng)子、PL啟動(dòng)子、PR啟動(dòng)子和T7啟動(dòng)子。此外，人工設(shè)計(jì)和修飾的啟動(dòng)子也可以使用，例如其中兩個(gè)Ptrp串聯(lián)連接的啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、lacT7啟動(dòng)子和IetI啟動(dòng)子。
宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌XLl-Blue、大腸桿菌XL2_Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌N0.49、大腸桿菌胃3110、大腸桿菌階49、大腸桿菌0冊(cè)0，等等。
任何導(dǎo)入重組載體的方法都可以使用，只要它是將DNA導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中的方法即可，例子包括在 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 69, 2110(1972)、Gene, 17, 107(1982)和Molecular&General Genetics, 168, 111(1979)中記載的使用I丐離子的方法，等等。
當(dāng)動(dòng)物細(xì)胞被用作宿主細(xì)胞時(shí)，可以使用任何表達(dá)載體，只要它能夠在動(dòng)物細(xì)胞中起作用即可。例子包括pcDNA1、pcDM8 (Funakoshi制造)、pAGE107[特開(kāi)平 3-22979 ;Cytotechnology，I 133 (1990) ]、pAS3-3 (特開(kāi)平 2-227075)、pCDM8 [Nature, 329, 840, (1987) ]、pcDNAI/Amp (Invitrogen 制造)、pcDNA3.1 (Invitrogen制造)、pREP4 (Invitrogen 制造)、pAGE103 [J.Biochemistry, 101, 1307 (1987) ]、pAGE210、PME18SFL3、pKANTEX93 (W097/10354)，等等。
任何啟動(dòng)子都可以使用，只要它能夠在動(dòng)物細(xì)胞中起作用即可。例子包括細(xì)胞肥大病毒(CMV)的立即早期(IE)基因的啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子、SRa啟動(dòng)子等、莫洛尼鼠白血病病毒啟動(dòng)子或增強(qiáng)子等。此夕卜，人類CMV的IE基因的增強(qiáng)子可以與啟動(dòng)子一起使用。
宿主細(xì)胞包括人類N amalwa細(xì)胞、猴COS細(xì)胞、中華倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、HST5637(特開(kāi)昭63-000299)等。
任何導(dǎo)入重組載體的方法都可以使用，只要它是用于將DNA導(dǎo)入到動(dòng)物細(xì)胞中的方法即可，例子包括電穿孔[Cytotechnology, 3, 133 (1990)]、磷酸I丐法(特開(kāi)平2-227075)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法[Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, Μ, 7413 (1987)]，等等。
將來(lái)源于微生物、動(dòng)物細(xì)胞等并具有包含ASCT2編碼DNA的重組載體的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以在培養(yǎng)物中形成和累積ASCT2，并從培養(yǎng)物中回收ASCT2，從而能夠生產(chǎn)ASCT2。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的方法根據(jù)用于宿主培養(yǎng)的一般方法執(zhí)行。
當(dāng)在來(lái)源于真核生物的細(xì)胞中表達(dá)ASCT2時(shí)，能夠得到結(jié)合了糖或糖鏈的ASCT2。
當(dāng)用含有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的重組載體轉(zhuǎn)化的微生物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，如果需要，可以在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑。例如，當(dāng)對(duì)使用Iac啟動(dòng)子的重組載體轉(zhuǎn)化的微生物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以在培養(yǎng)基中加入異丙基_β-D-硫代半乳糖苷等，或者當(dāng)對(duì)使用trp啟動(dòng)子的重組載體轉(zhuǎn)化的微生物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以在其中加入吲哚丙烯酸等。
當(dāng)使用動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基包括常用的RPMI1640 培養(yǎng)基[The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967) 1、Eagle’s MEM 培養(yǎng)基[Science, d 501 (1952) ]、Dulbecco 改良的 MEM 培養(yǎng)基[Virology, 8, 396 (1959)]以及 199 培養(yǎng)基[Proceeding of the Society for the BiologyMedicine, 73, I (1950)]、Iscoove改良的Dulbecco培養(yǎng)基(MDM)、添加了胎牛血清等的培養(yǎng)基，等等。培養(yǎng)一般在存在5%C02的情況下，在pH6到至8和30至40°C下進(jìn)行I到7天。如果必要，在培養(yǎng)·過(guò)程中可以向培養(yǎng)基添加抗生素例如卡那霉素或青霉素。
對(duì)于ASCT2編碼基因的表達(dá)方法來(lái)說(shuō)，除了直接表達(dá)之外，還可以按照MolecularCloning, A Laboratory Manual, Second Edition (分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版)，ColdSpring Harbor Laboratory Press (1989)中描述的方法進(jìn)行分泌生產(chǎn)、融合蛋白表達(dá)等
生產(chǎn)ASCT2的方法包括在宿主細(xì)胞中進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方法、從宿主細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞外分泌的方法、在宿主細(xì)胞膜外被膜上生產(chǎn)的方法等。適合的方法可以通過(guò)改變所使用的宿主細(xì)胞和所產(chǎn)生的ASCT2的結(jié)構(gòu)來(lái)選擇。
當(dāng)在宿主細(xì)胞中或宿主細(xì)胞膜外被膜上生產(chǎn)ASCT2時(shí)，按照Paulson等的方法[J.Biol.Chem., 264, 17619 (1989) ] > Lowe 等的方法[Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 86, 8227 (1989)，Genes Develop.，4, 1288 (1990)]、特開(kāi)平 05-336963 和 W094/23021 中描述的方法等，可以將ASCT2主動(dòng)分泌到細(xì)胞外。
此外，按照特開(kāi)平2-27075中描述的方法，利用使用二氫葉酸還原酶基因的基因擴(kuò)增系統(tǒng)，能夠增加ASCT2的生產(chǎn)量。
所得的ASCT2可以例如如下進(jìn)行分離和純化。
當(dāng)ASCT2以溶解狀態(tài)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，細(xì)胞在培養(yǎng)后通過(guò)離心回收，懸浮在水性緩沖液中，然后使用超聲波破碎器、French壓力器、Manton Gaulin勻衆(zhòng)器、戴諾磨等進(jìn)行破碎，以獲得無(wú)細(xì)胞的提取液。將無(wú)細(xì)胞的提取液進(jìn)行離心以獲得上清液，并通過(guò)對(duì)上清液進(jìn)行通用的蛋白分離和純化技術(shù)來(lái)獲得純化的制備物，這些技術(shù)例如溶劑抽提，使用硫酸銨等進(jìn)行鹽析，脫鹽，用有機(jī)溶劑沉淀，使用樹(shù)脂例如二乙氨基乙基(DEAE)-瓊脂糖凝膠、DIAION HPA-75 (三菱化學(xué)社制造)進(jìn)行陰離子交換層析，使用樹(shù)脂例如S-瓊脂糖凝膠FF(Pharmacia制造)進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析，使用樹(shù)脂例如丁基_瓊脂糖凝膠或苯基_瓊脂糖凝膠進(jìn)行疏水層析，使用分子篩進(jìn)行凝膠過(guò)濾，親和層析，層析聚焦，電泳例如等電點(diǎn)聚焦，等等，它們可以單獨(dú)或組合使用。
當(dāng)ASCT2通過(guò)形成包含體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，將細(xì)胞以同樣的方式回收、破碎和離心，ASCT2的包含體作為沉淀級(jí)分被回收。將回收的蛋白包含體用蛋白變性劑進(jìn)行增溶。通過(guò)對(duì)增溶的溶液進(jìn)行稀釋或透析，使蛋白成為正常的三維結(jié)構(gòu)，然后通過(guò)與上述相同的分離純化方法獲得ASCT2的純化制品。
當(dāng)ASCT2或衍生物例如糖基化產(chǎn)物被分泌到細(xì)胞外時(shí)，可以從培養(yǎng)上清液中回收ASCT2或衍生物例如糖基化產(chǎn)物。即,通過(guò)例如離心的方法、以與上述相同的方式來(lái)處理培養(yǎng)物，從培養(yǎng)上清液中通過(guò)與上述相同的分離純化方法，可以獲得ASCT2的純化制品。
此外，在本發(fā)明中使用的ASCT2可以通過(guò)化學(xué)合成法來(lái)生產(chǎn)，例如Fmoc法或tBoc法。此夕卜，可以使用由 Advanced ChemTech>Perkin-Elmer>Pharmacia>Protein TechnologyInstrument、Synthecell-Vega、PerSeptive、島津制作所等制造的肽合成儀對(duì)其進(jìn)行化學(xué)合成。
(2)動(dòng)物的免疫和融合用抗體產(chǎn)生細(xì)胞的制備
使用上面(I)中制備的抗原免疫3到20周齡的小鼠、大鼠或倉(cāng)鼠，從動(dòng)物的脾臟、淋巴結(jié)或外周血收集抗體產(chǎn)生細(xì)胞。此外，當(dāng)在上述動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)由于免疫原性低而導(dǎo)致充分的滴度上升時(shí)，可以使用ASCT2敲除小鼠作為供免疫的動(dòng)物。
免疫通過(guò)給動(dòng)物皮下、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射施用抗原連同適合的佐劑(例如完全弗氏佐劑，氫氧化鋁凝膠與百日咳菌苗的組合等)來(lái)進(jìn)行。當(dāng)抗原是部分肽時(shí)，用載體蛋白例如BSA (牛血清白蛋白)、KLH (匙孔血藍(lán)蛋白)等產(chǎn)生結(jié)合物，將其用作抗原。
在第一次施用后，每一周或每?jī)芍芤淮问┯每乖M(jìn)行5到10次。在每次施用后的第三到第七天，從眼底靜脈叢采集血液樣品，通過(guò)例如酶免疫分析[Antibodies-ALaboratory Manual (抗體-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]等測(cè)試血清與抗原的反應(yīng)性。在其血清中顯示出針對(duì)免疫用抗原的充分抗體滴度的動(dòng)物，被用作融合用抗體產(chǎn)生細(xì)胞的供應(yīng)源。
在最后施用抗原后的三到七天，從免疫動(dòng)物摘出含有抗體產(chǎn)生細(xì)胞的組織例如脾臟，以收集抗體產(chǎn)生細(xì)胞。當(dāng)使用脾臟細(xì)胞時(shí),將脾臟切下并打散,然后離心。除去紅細(xì)胞得到融合用抗體產(chǎn)生細(xì)胞。
(3)骨髓瘤細(xì)胞的制備
從小鼠獲得的已建立的細(xì)胞系被用作骨髓瘤細(xì)胞。例子包括8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤抗性小鼠(源自于BALB/c小鼠)的骨髓瘤細(xì)胞系P3-X63Ag8-Ul (P3-U1) [CurrentTopics in Microbi ology and Immunology, 18,I(1978) 1、P3-NS1/l~Ag41(NS-1)[European J.1mmunology,6511 (1976)], SP2/0_Agl4(SP-2)「Nature, 276.269(1978)1、P3-X63-Ag8653 (653) [J.1mmunology, 123.1548 (1979)]、P3-X6 3_Ag8 (X63)[Nature, 256, 495 (1975)]，等等。
所述骨髓瘤細(xì)胞在正常培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)[在RPM1-1640培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺、2-巰基乙醇、慶大霉素、FCS和8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤的培養(yǎng)基]，并且在細(xì)胞融合之前將它們?cè)谡Ｅ囵B(yǎng)基中傳代培養(yǎng)3或4天，以確保在進(jìn)行融合的當(dāng)天細(xì)胞數(shù)量為2X IO7個(gè)以上。
(4)細(xì)胞融合和制備生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤
將通過(guò)上述(2)得到的融合用抗體產(chǎn)生細(xì)胞和通過(guò)上述(3)得到的骨髓瘤細(xì)胞用最低必需培養(yǎng)基(MEM)或PBS (1.83g磷酸氫二鈉，0.21g磷酸二氫鉀，7.65g氯化鈉，I升蒸餾水，pH7.2)進(jìn)行充分清洗和混合，使抗體產(chǎn)生細(xì)胞:骨髓瘤細(xì)胞的比率=5-10:1，然后離心。然后丟棄上清液。將沉淀的細(xì)胞群充分打散。在打散沉淀的細(xì)胞后，在37°C、攪拌下向細(xì)胞中加入聚乙二醇-1000 (PEG-1000)、MEM和二甲亞砜的混合物。另外，每隔I或2分鐘加入I到2mL MEM培養(yǎng)基數(shù)次，并加入MEM使得總量為50mL。離心后，將上清液丟棄。輕輕地將細(xì)胞打散后，將細(xì)胞輕柔地懸浮在HAT培養(yǎng)基中[在正常培養(yǎng)基中添加了次黃嘌呤、胸腺嘧啶和氨基蝶呤的培養(yǎng)基]。將懸浮液在5%C02的培養(yǎng)箱中在37°C培養(yǎng)7到14天。
培養(yǎng)后，取部分培養(yǎng)上清液作為樣品，通過(guò)下面描述的結(jié)合分析法選擇對(duì)含ASCT2抗原有反應(yīng)性而對(duì)不含ASCT2抗原沒(méi)有反應(yīng)性的骨髓瘤。然后，通過(guò)有限稀釋方法進(jìn)行兩次克隆[第一次使用HT培養(yǎng)基(除去了氨基蝶呤的HAT培養(yǎng)基)，第二次使用正常培養(yǎng)基]，選擇顯示出穩(wěn)定的高抗體滴度的雜交瘤作為生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤。
(5)純化的單克隆抗體的制備
將在上面(4)中獲得的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，通過(guò)腹膜內(nèi)注射施用于8到10周齡的降植烷處理過(guò)的小鼠或裸鼠中(2，6，10，14-四甲基十五烷(降植烷)腹膜內(nèi)給藥，然后飼養(yǎng)2周)。雜交瘤在10到21天內(nèi)發(fā)展出腹水腫瘤。從小鼠收集腹水液，離心除去固形成分，用40至50%硫酸銨進(jìn)行鹽析，然后用辛酸沉淀，通過(guò)DEAE-瓊脂糖凝膠柱、蛋白A柱或凝膠過(guò)濾柱,收集IgG或IgM級(jí)分作為純化的單克隆抗體。
此外，將通過(guò)上述(4)得到的生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤在含有10%FBS等的RFMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并離心除去上清液。將沉淀的細(xì)胞懸浮在含有5%DIG0 GF21的雜交瘤SFM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3至7天。將得到的細(xì)胞懸液離心，繼而將所得上清液用蛋白A柱或蛋白G柱純化，收集IgG級(jí)分。
抗體的亞類可以使用亞類分型試劑盒通過(guò)酶免疫分析法來(lái)確定。蛋白的量可以通過(guò)Lowry法或從280nm處的吸光度來(lái)測(cè)定。
(6)單克隆抗體的選擇
通過(guò)下面的結(jié)合分析法，利用酶免疫分析法和氨基酸細(xì)胞內(nèi)攝取的抑制分析，進(jìn)行單克隆抗體的選擇。
(6-a)結(jié)合分析法
將通過(guò)將(I)中得到的含有ASCT2編碼cDNA的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞等得到的基因?qū)爰?xì)胞或重組蛋白質(zhì)，或從人類組織得到的純化多肽或部分肽，用作抗原。當(dāng)抗原是部分肽`時(shí)，用載體蛋白例如BSA或KLH制備結(jié)合物并使用。
在將這些抗原通過(guò)分配到96孔板中使之固相化之后，在其中分配雜交瘤的培養(yǎng)上清液或純化的單克隆抗體作為第一抗體，并進(jìn)行反應(yīng)。在用PBS、PBS-TWeen徹底清洗后，向其中分配用生物素、酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、放射性化合物等標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體作為第二抗體，并進(jìn)行反應(yīng)。在用PBS-Tween徹底清洗后，根據(jù)第二抗體中的標(biāo)記物進(jìn)行反應(yīng)，以選擇與所述抗原特異性反應(yīng)的單克隆抗體。
(6-b)氨基酸細(xì)胞內(nèi)攝取的抑制分析
可以使用其中包含ASCT2編碼cDNA的表達(dá)載體被導(dǎo)入上面(I)得到的細(xì)胞例如動(dòng)物細(xì)胞中的基因?qū)爰?xì)胞、或表達(dá)ASCT2的正常或癌細(xì)胞，作為分析細(xì)胞。
本發(fā)明的單克隆抗體或其抗體片段抑制由ASCT2介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)攝取氨基酸的活性利用下面的方法來(lái)評(píng)價(jià)，包括:將單克隆抗體或其抗體片段與表達(dá)ASCT2的正常或癌細(xì)胞反應(yīng)，然后利用活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑等評(píng)價(jià)谷氨酰胺依賴性增殖的抑制的方法[J，SurgicalResearch, 90, 149(2000)];將單克隆抗體或其抗體片段與表達(dá)ASCT2的正常或癌細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)，然后利用適當(dāng)?shù)脑O(shè)備例如閃爍計(jì)數(shù)器評(píng)價(jià)氨基酸例如放射性物質(zhì)標(biāo)記的丙氨酸的攝取抑制的方法[J.Biol Chem..271.14883(1996)]等。
2.重組抗體的制備
在下面顯示的生產(chǎn)人嵌合抗體和人源化抗體的方法，作為重組抗體的生產(chǎn)實(shí)例。
(I)表達(dá)重組抗體的載體的構(gòu)建
表達(dá)重組抗體的載體是用于動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體，其中插入了編碼人類抗體的CH和CL的DNA，所述載體通過(guò)將編碼人類抗體的CH和CL的DNA克隆到動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體中來(lái)構(gòu)建。
人類抗體的C區(qū)可以是任何人類抗體的CH和CL。例子包括屬于Y I亞類的CH、屬于K類的CL等。對(duì)于編碼人類抗體的CH和CL的DNA來(lái)說(shuō)，通常可以使用cDNA并還可以使用含有外顯子和內(nèi)含子的染色體DNA。對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體來(lái)說(shuō)，可以使用任何表達(dá)載體，只要能夠在其中插入并在其中表達(dá)編碼人類抗體的C區(qū)的基因即可。例子包括 pAGE107 [Cytotechnol.，3, 133 (1990) ]、pAGE103 [J.Biochem.，101, 1307 (1987)]、pHSG274[Gene, 27, 223 (1984) ]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 78, 1527 (1981)]、pSGlbd2-4[Cytotechnol.,4,173(1990)]、 pSElUKlSedl-3[Cytotechnol,13,79(1993)]等等。用于動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的例子包括SV40早期啟動(dòng)子[J.Biochem., 101.1307 (1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒 LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.，149, 960 (1987)]、免疫球蛋白 H 鏈啟動(dòng)子[Cell, 41, 479 (1985)]和增強(qiáng)子[Cell, 33, 717 (1983)]，等等。
用于表達(dá)重組抗體的載體可以是編碼抗體H鏈的基因和編碼抗體L鏈的基因在分開(kāi)的載體上的類型，或這兩種基因在同一個(gè)載體上的類型(串聯(lián)類型)。對(duì)于構(gòu)建用于表達(dá)重組抗體的載體的容易度、導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的容易度、以及動(dòng)物細(xì)胞中抗體H鏈和L鏈的表達(dá)量之間的平衡來(lái)說(shuō)，串聯(lián)類型的表達(dá)重組抗體的載體是更優(yōu)選的[J.1mmunol.Methods, 167, 271 (1994)]。串聯(lián)類型的表達(dá)重組抗體的載體的例子包括pKANTEX93(W097/10354)、pEE18 [Hybridoma, 17, 559 (1998)]，等等。
(2)非人類動(dòng)物來(lái)源的抗體V區(qū)的編碼cDNA的獲得和氨基酸序列分析
編碼非人類動(dòng)物抗體的VH和VL的cDNA和氨基酸序列分析可以按照下面的方式獲得。
從來(lái)源于非人類動(dòng)物的抗體產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞提取mRNA用于合成cDNA。將合成的cDNA克隆到載體例如噬菌體或質(zhì)粒中以制備cDNA文庫(kù)。使用編碼小鼠抗體的一部分C區(qū)和V區(qū)的DNA作為探針，從文庫(kù)中分離各個(gè)含有編碼VH或VL的cDNA的重組噬菌體或重組質(zhì)粒。測(cè)定了重組噬菌體或重組質(zhì)粒上目的小鼠抗體的VH和VL的全長(zhǎng)核苷酸序列，并從該核苷酸序列分別推導(dǎo)出VH和VL的全長(zhǎng)氨基酸序列。
用來(lái)制備產(chǎn)生非人類抗體的雜交瘤細(xì)胞的非人類動(dòng)物的實(shí)例包括小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠和兔子等。可以使用任何動(dòng)物，只要能夠從其制備雜交瘤細(xì)胞即可。
從雜交瘤細(xì)胞制備總RNA的方法的實(shí)例包括利用試劑盒例如RNA簡(jiǎn)易試劑盒(Qiagen 制造)等的硫氰酸胍 _ 三氟乙酸銫法[Methods in Enzymology, 154, 3 (1987)]。
從總RNA制備mRNA的方法的例子包括:寡聚(dT)固定化的纖維素柱方法[[Molecular Cloning, ALaboratory Manual, Second Edition (分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)],利用試劑盒例如寡聚-dT30〈Super>mRNA純化試劑盒(Takara Bio制造)的方法等。用于從雜交瘤細(xì)胞制備mRNA的試劑盒的例子還包括Fast Track mRNA分離試劑盒(Invitrogen制造)和QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia制造)等。
用于合成cDNA和制備cDNA文庫(kù)的方法的例子包括已知的方法[MolecularCloning, A Laboratory Manual (分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring Harbor Lab.Press (1989) ；Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù))，附錄1，John Wiley&Sons (1987-1997)];使用試劑盒例如用于cDNA合成和質(zhì)粒克隆的SuperScript質(zhì)粒系統(tǒng)(GIBCO BRL制造)、ZAP-cDNA試劑盒(Stratagene制造)等的方法；等等。
插入了利用從雜交瘤細(xì)胞提取的mRNA作為模板合成的cDNA、供制備cDNA文庫(kù)用的載體可以是任何載體，只要所述cDNA可以插入即可。例子包括ZAP Express[Strategies,5,58 (1992)]> pBluescript 11 SK (+) [Nucleic AcidsResearch, Γ7, 9494 (1989) ] > λ zap II( Stratagene 制造)、λ gtlO 和 Agtll[DNA Cloning: APractical Approach (D NA 克隆:實(shí)用方法)，I, 49 (1985) ]、Lambda BlueMid (Clontech制造)、AExCell 和 pT7T3 18U (Pharmacia 制造)、pcD2[MoI Cell.Biol, 3, 280(1983)],pUC18[Gene, 33, 103(1985)]等。
可以使用導(dǎo)入由曬菌體或質(zhì)粒載體構(gòu)建的cDNA文庫(kù)的任何大腸桿菌，只要該cDNA文庫(kù)可以被導(dǎo)入、表達(dá)和維持即可。例子包括XLl-BlueMRF，[Strategies,5, 81 (1992)], C600 [Genetics,處，177 (1954)]、Y1088 和Y1090[Science,幽，778(1983)]、匪522[J.Mol Β οΙ,ΙΜ, 1 (1983)], K802[J.MolBiol, 16, 118(1966)], JM105 [Gene 38, 275(1985)]等。
利用同位素或熒光標(biāo)記的探針進(jìn)行菌落雜交或噬斑雜交方法，可以用于從cDNA文庫(kù)中挑選編碼非人類動(dòng)物抗體等的VH和VL的cDNA克隆[Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Second Edition (分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版)，Cold SpringHarbor Laboratory Press (1989)]。也可以通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(在后文中稱為“PCR”)[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ；Current Protocols in MolecularBiology (現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù))，附錄1，John Wiley&Sons (1987-1997)]制備引物并使用從mRNA制備的cDNA或者cDNA文庫(kù)作為模板，來(lái)制備編碼VH和VL的cDNA。
cDNA的核苷酸序列可以如下確定:用適合的限制性酶等消化選出的cDNA，將片段克隆到質(zhì)粒例如pBluescript SK(-) (Stratagene制造)中，在雙脫氧法[[Proc.NatlAcad.ScL USA, 74, 5463 (1977)]之后，通過(guò)常規(guī)使用的核苷酸分析法例如使用核苷酸序列自動(dòng)分析儀例如A.L.F.DNA測(cè)序儀(Pharmaci制造)分析序列從而進(jìn)行反應(yīng)。
從測(cè)定的核苷酸序列推導(dǎo)出VH和VL的全長(zhǎng)氨基酸序列，并將它們與已知抗體的VH和 VL 的全長(zhǎng)氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫重要的蛋白序列)，美國(guó)衛(wèi)生與人類服務(wù)部(US Dept, Health and Human Services) (1991)]進(jìn)行比較，由此可以證實(shí)獲得的cDNA是否編碼含有分泌信號(hào)序列的抗體的VH和VL的完整氨基酸序列。將含有分泌信號(hào)序列的抗體的VH和VL的全長(zhǎng)氨基酸序列與已知抗體的VH和 VL 的全長(zhǎng)氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫重要的蛋白序列)，美國(guó)衛(wèi)生與人類服務(wù)部(US Dept, Health and Human Services) (1991)]進(jìn)行比較，推導(dǎo)出分泌信號(hào)序列和N-末端氨基酸序列的長(zhǎng)度，并且還可以知道它們所屬的亞類。此外，VH和VL的每個(gè)⑶R的氨基酸序列可以通過(guò)將所得的氨基酸序列與已知抗體的 VH 和 VL 的氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫重要的蛋白序列)，美國(guó)衛(wèi)生與人類服務(wù)部(US Dept, Health and Human Services) (1991)]進(jìn)行比較來(lái)發(fā)現(xiàn)。
此外，通過(guò)使用得到的VH和VL的全長(zhǎng)氨基酸序列，與任何數(shù)據(jù)庫(kù)例如SffISS-PROT, PIR-Protein等中的序列進(jìn)行同源性搜索，例如按照BLAST方法[J.MolBiol, 215, 403 (1990)]等，可以研究VH和VL的全長(zhǎng)氨基酸序列的新穎性。
(3)人嵌合抗體表達(dá)載體的構(gòu)建
將編碼非人類動(dòng)物抗體的VH和VL的cDNA，分別克隆到上面(I)中所述的重組抗體表達(dá)載體中編碼人類抗體的CH和CL的基因上游，從而構(gòu)建了人嵌合抗體的表達(dá)載體。例如，為了連接含有非人類動(dòng)物抗體的VH和VL的3’ -末端的核苷酸序列和人類抗體的CH和CL的5’ -末端的核苷酸序列的cDNA，將每個(gè)編碼非人類動(dòng)物的抗體的VH和VL的cDNA制備成編碼由連接部分的核苷酸序列編碼的適當(dāng)氨基酸并設(shè)計(jì)成具有限制性酶的適當(dāng)識(shí)別序列。將得到的編碼抗體的VH和VL的cDNA分別克隆，使得它們各自在上面(I)中所述的人源化抗體表達(dá)載體中編碼人類抗體的CH和CL的基因上游以合適的形式表達(dá)，從而構(gòu)建了人嵌合抗體的表達(dá)載體。
另外，編碼非人類動(dòng)物的VH或VL的cDNA利用在兩端具有適當(dāng)?shù)南拗菩悦缸R(shí)別序列的合成DNA，通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，它們各被克隆到上面(I)中得到的重組抗體表達(dá)載體中。
(4)編碼人源化抗體V區(qū)的cDNA的構(gòu)建
編碼人源化抗體的VH或VL的cDNA可以如下獲得。首先，分別選擇人類抗體的VH或VL中構(gòu)架區(qū)(后文稱為“FR”)的氨基酸序列，所述序列中移植了非人類動(dòng)物來(lái)源的抗體的VH或VL中CDR的氨基酸序列。人類抗體的FR的任何氨基酸序列均可以使用，只要它們?cè)醋杂谌祟惣纯伞＠影ㄔ跀?shù)據(jù) 庫(kù)例如蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank)等中登記的人類抗體的FR的氨基酸序列、人類抗體的FR亞類共有的氨基酸序列[Sequences of Proteinsof Immunological Interest (免疫重要的蛋白序列)，美國(guó)衛(wèi)生與人類服務(wù)部(1991)],等等。為了抑制抗體結(jié)合活性降低，選擇與原始抗體的VH或VL中FR的氨基酸序列具有高度同源性(至少60%以上)的氨基酸序列。
然后，將原始抗體的CDR的氨基酸序列分別移植到人類抗體的VH或VL中FR的選定氨基酸序列中，以設(shè)計(jì)人源化抗體的VH或VL的每個(gè)氨基酸序列。通過(guò)考慮在抗體基因的核苷酸序列中發(fā)現(xiàn)的密碼子使用頻率[Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest (免疫重要的蛋白序列)，美國(guó)衛(wèi)生與人類服務(wù)部(1991)]，將設(shè)計(jì)的氨基酸序列變換成DNA序列，并設(shè)計(jì)編碼人源化抗體的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列。
根據(jù)設(shè)計(jì)的核苷酸序列，合成幾個(gè)長(zhǎng)度大約100個(gè)核苷酸的合成DNA，使用它們進(jìn)行PCR。在這種情況下，鑒于PCR反應(yīng)的效率和可以合成的DNA的長(zhǎng)度，優(yōu)選對(duì)于H和L鏈各設(shè)計(jì)6個(gè)合成DNA。
此外，通過(guò)在兩端上存在的合成DNA的5’端導(dǎo)入適當(dāng)?shù)南拗菩悦傅淖R(shí)別序列，可以將編碼人源化抗體的VH或VL的cDNA容易地克隆到在(I)中構(gòu)建的人源化抗體表達(dá)載體中。
在PCR后,將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒例如pBluescript SK(-) (Stratagene制造)等中，按照與(2)中描述的方法相類似的方法測(cè)定核苷酸序列，獲得了具有所需人源化抗體的VH或VL的氨基酸序列的編碼DNA序列的質(zhì)粒。
(5)人源化抗體的V區(qū)的氨基酸序列的修飾
已經(jīng)知道，當(dāng)通過(guò)僅僅將非人類動(dòng)物來(lái)源的抗體的VH和VL中的⑶R簡(jiǎn)單地移植到人類抗體的VH和VL的FR中來(lái)生產(chǎn)人源化抗體時(shí)，它的抗原結(jié)合活性低于來(lái)自非人類動(dòng)物的原始抗體[B10/TECHN0L0GY，9，266(1991)]。在人源化抗體中，在人類抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列當(dāng)中，鑒定與抗原結(jié)合直接相關(guān)的氨基酸殘基、與CDR中的氨基酸殘基相互作用的氨基酸殘基、和維持抗體的三維結(jié)構(gòu)并間接地與結(jié)合抗原相關(guān)的氨基酸殘基，并將其修飾成在非人類動(dòng)物的原始抗體中發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基，從而使已經(jīng)降低的抗原結(jié)合活性增加。
為了鑒定FR中與抗原結(jié)合活性有關(guān)的氨基酸殘基，通過(guò)X-射線晶體學(xué)[J，MolBiol, 112, 535 (1977)]、計(jì)算機(jī)模擬[Protein Engineering, 7, 1501 (1994)]等構(gòu)建并分析抗體的三維結(jié)構(gòu)。另外，現(xiàn)在必須需要進(jìn)行各種不同的嘗試，例如，生產(chǎn)每種抗體的幾種修飾的抗體，并檢驗(yàn)各個(gè)修飾的抗體與其抗體結(jié)合活性之間的相關(guān)性。
人類抗體的VH和VL中FR的氨基酸序列的修飾可以使用用于修飾的各種合成DNA，按照(4)中描述的PCR來(lái)進(jìn)行。至于通過(guò)PCR獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，按照(2)中描述的方法測(cè)定核苷酸序列，以便確認(rèn)是否已經(jīng)發(fā)生目的修飾。
(6)人源化抗體表達(dá)載體的 構(gòu)建
通過(guò)將構(gòu)建的重組抗體的VH或VL的每個(gè)編碼cDNA克隆到在(I)中描述的重組抗體表達(dá)載體中編碼人類抗體的CH或CL的每個(gè)基因的上游中，可以構(gòu)建人源化抗體的表達(dá)載體。
例如，在(4)和(5)中構(gòu)建人源化抗體的VH或VL使用的合成DNA當(dāng)中，當(dāng)兩端位置的合成DNA的5’-末端中引入適當(dāng)?shù)南拗菩悦傅淖R(shí)別序列時(shí)，克隆能夠進(jìn)行，以便它們能在上面(I)中描述的人源化抗體表達(dá)載體中，在編碼人類抗體的CH或CL的每個(gè)基因的上游以適當(dāng)?shù)男问奖磉_(dá)。
(7)重組抗體的一過(guò)性表達(dá)
為了有效評(píng)估產(chǎn)生的各種人源化抗體的抗原結(jié)合活性，可以使用在(3)和(6)中描述的重組抗體表達(dá)載體或其修飾的表達(dá)載體一過(guò)性表達(dá)所述重組抗體。
任何細(xì)胞都可以用作宿主細(xì)胞，只要該宿主細(xì)胞能夠表達(dá)重組抗體即可。一般來(lái)說(shuō)使用 C0S-7 細(xì)胞(ATCC CRL1651) [Methods in Nucleic Acids Res., CRCPress, 283 (1991)]。將表達(dá)載體導(dǎo)入C0S-7細(xì)胞的方法的例子包括DEAE-葡聚糖法[Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283 (1991)]、脂轉(zhuǎn)染法[Proc.Natl.Acad.Sci USA, M，7413 (1987)]，等等。
導(dǎo)入表達(dá)載體之后，在培養(yǎng)上清液中重組抗體的表達(dá)量和抗原結(jié)合活性可以通過(guò)酶免疫分析[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition (單克隆抗體-原理和實(shí)踐，第三版)，Academic Press (1996), Antibodies-A LaboratoryManual (抗體-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring Harbor Laboratory (1988), MonoclonalAntibody Experiment Manual (單克隆抗體試驗(yàn)手冊(cè))，Kodansha Scientif ic (1987)]等來(lái)測(cè)定。
(8)獲得穩(wěn)定表達(dá)重組抗體的轉(zhuǎn)化體和制備重組抗體
將(3)和￠)中描述的重組抗體表達(dá)載體導(dǎo)入到適合的宿主細(xì)胞，可以獲得穩(wěn)定表達(dá)重組抗體的轉(zhuǎn)化體。
將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法的例子包括電穿孔[特開(kāi)平2-257891，Cytotechnology, 3, 133 (1990)]等。
至于導(dǎo)入重組抗體表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，可以使用任何細(xì)胞，只要它是能夠產(chǎn)生重組抗體的宿主細(xì)胞即可。例子包括小鼠SP2/0-Agl4細(xì)胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653細(xì)胞(ATCC CRL1580)、二氫葉酸還原酶基因(在后文中稱為〃dhfr〃)缺陷的CHO 細(xì)胞[Proc.Natl.Aca.Sc1.U.S.A., 77, 4216 (1980) ]、lection 抗性獲得 Lecl3 [SomaticCell and Molecular genetics.12.55 (1986) 1、a I, 6_ 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因缺陷的 CHO 細(xì)胞(TO 2005/35586, WO 02/31140)、大鼠 YB2/3HL.Ρ2.Gil.16Ag.20 細(xì)胞(ATCC CRL1662)坐寸ο
另外，還可以使用下列宿主細(xì)胞:其中所導(dǎo)入的諸如與合成細(xì)胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖有關(guān)的酶的蛋白、諸如與其中在復(fù)合型N-葡萄糖苷-連接的糖鏈中1-位巖藻糖與還原端的6-位N-乙酰葡糖胺通過(guò)a -鍵結(jié)合的糖鏈的修飾有關(guān)的酶的蛋白、或與細(xì)胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖運(yùn)輸?shù)礁郀柣w有關(guān)的蛋白，它們的活性被降低或缺失的宿主細(xì)胞，優(yōu)選WO 05/35586,WO 02/31140等所述的a 1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因缺陷的CHO細(xì)胞。
在導(dǎo)入表達(dá)載體之后，通過(guò)在含有藥劑例如G418硫酸鹽(在后文中稱為G418 )等的用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，來(lái)選擇穩(wěn)定表達(dá)重組抗體的轉(zhuǎn)化體(特開(kāi)平2-57891)。
培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基的例子包括RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen制造)、GIT培養(yǎng)基(日本制藥社制造)、EX-CELL301培養(yǎng)基(JRH制造)、MDM培養(yǎng)基(Invitrogen制造)、雜交瘤-SFM培養(yǎng)基(InvitiOgen制造)、在這些培養(yǎng)基中加入各種添加劑例如胎牛血清(后文稱為“FCS”)而獲得的培養(yǎng)基等。通過(guò)將選出的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，可以在培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生并累積重組抗體。培養(yǎng)上清液中重組抗體的表達(dá)量和抗原結(jié)合活性可以通過(guò)ELISA等測(cè)量。此外，在轉(zhuǎn)化體中，可以按照特開(kāi)平2-57891中公開(kāi)的方法，通過(guò)使用DHFR擴(kuò)增系統(tǒng)等來(lái)增加重組抗體的表達(dá)量。
通過(guò)使用蛋白A柱,可以從轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)上清液中純化重組抗體[MonoclonalAntibodies-Principles and practice, Third edition (單克隆抗體-原理和實(shí)踐，第三版).Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual (抗體-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，ColdSpring Harbor Laboratory (1988)]。例如，可以通過(guò)凝膠過(guò)濾、離子交換層析、超濾等的組合來(lái)純化重組抗體。純化的重組抗體的H鏈或L鏈或完整抗體分子的分子量通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(在后文中稱為〃SDS-PAGE〃)[Nature, 227, 680 (1970) ], Western印跡法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition (單克隆抗體-原理和實(shí)踐，第三版)，Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual (抗體-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]等來(lái)測(cè)定。
3.單克隆抗體或抗體片段活性的評(píng)價(jià)
本發(fā)明的純化的單克隆抗體或抗體片段的活性可以下面的方式進(jìn)行評(píng)價(jià)。
與ASCT2-表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合活性通過(guò)上面I (6a)記載的結(jié)合分析來(lái)評(píng)價(jià)。此外，它可以通過(guò)突光抗體技術(shù)[Cancer Immunol.1mmunother., 36, 373 (1993)]、利用諸如 BIAcore系統(tǒng)的表面等離子體共振法等來(lái)測(cè)量。
ASCT對(duì)細(xì)胞內(nèi)攝取氨基酸的抑制活性可以通過(guò)上面l_(6b)記載的方法來(lái)評(píng)價(jià)。
另外，對(duì)抗原陽(yáng)性細(xì)胞系的⑶C活性或ADCC活性通過(guò)已知的方法評(píng)價(jià)[CancerTmmunol Immunother., 36, 373(1993)]。
4.利用本發(fā)明的抗ASCT2單克隆抗體或抗體片段治療疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的特異性識(shí)別ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的天然三維結(jié)構(gòu)并與該細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合的單克隆抗體或其抗體片段，可以用于治療與ASCT2有關(guān)的疾病。
包含本發(fā)明的單克隆抗體或抗體片段或其衍生物的治療藥可以只將該抗體或抗體片段或其衍生物作為活性成分，并優(yōu)選提供為通過(guò)制藥學(xué)技術(shù)領(lǐng)域中公知的適當(dāng)方法，將其與一種或多種藥物可接受的載體混合而制造的藥物制劑。
給藥途徑的例子包括經(jīng)口給藥和腸胃外給藥，例如經(jīng)頰、氣管、直腸、皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥。劑型的例子包括噴霧劑、膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏、帶劑等。
適合于經(jīng)口給藥·的藥物制劑包括乳劑、糖漿劑、膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑等。
液體制劑例如乳劑和糖漿劑可以使用下述作為添加劑來(lái)生產(chǎn):7jC，糖例如蔗糖、山梨糖醇和果糖，二醇例如聚乙二醇和丙二醇，油例如芝麻油、橄欖油和大豆油，防腐劑例如對(duì)羥基苯甲酸酯，香料例如草莓香料和胡椒薄荷，等等。
膠囊、片劑、散劑、顆粒劑等可以使用下述作為添加劑來(lái)生產(chǎn):賦形劑例如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露糖醇，崩解劑例如淀粉和藻酸鈉，潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂和滑石粉，粘合劑例如聚乙烯醇、羥丙基纖維素和明膠，表面活性劑例如脂肪酸酯，增塑劑例如甘油，等等。
適合腸胃外給藥的藥物制劑包括注射劑、栓劑、噴霧劑等。
注射劑可以使用載體例如鹽溶液、葡萄糖溶液或其二者的混合物來(lái)制備。
栓劑可以使用載體例如可可脂、氫化脂肪或羧酸來(lái)制備。
噴霧劑可以使用抗體或抗體片段本身、或?qū)⑵渑c不刺激患者的口腔或氣道粘膜并能通過(guò)將化合物分散成細(xì)小粒子而促進(jìn)其吸收的載體一起使用來(lái)制備。載體包括乳糖、甘油等。可以生產(chǎn)藥物制劑例如氣溶膠或干粉。
此外，經(jīng)口制劑的添加劑所例舉的成分，也可以添加到腸胃外制劑中。
5.利用本發(fā)明的抗ASCT2單克隆抗體或抗體片段診斷疾病的方法
與ASCT2有關(guān)的疾病可以通過(guò)利用本發(fā)明的單克隆抗體或抗體片段來(lái)檢測(cè)或測(cè)定ASCT2或表達(dá)ASCT2的細(xì)胞進(jìn)行診斷。
癌是與ASCT2有關(guān)的疾病之一，其診斷可以通過(guò)例如如下的檢測(cè)或測(cè)量ASCT2來(lái)進(jìn)行。
首先，從兩個(gè)以上健康人生物體采集活體樣品，利用本發(fā)明的單克隆抗體或抗體片段或其衍生物，通過(guò)以下免疫學(xué)手段進(jìn)行ASCT2的檢測(cè)或測(cè)量，來(lái)確認(rèn)健康人活體樣品中ASCT2的表達(dá)量。通過(guò)以同樣方式也檢查待測(cè)人活體樣品中ASCT2的量，將該量與健康人的量相比較。當(dāng)待測(cè)人的多肽量與健康人相比增加時(shí)，可以診斷癌癥陽(yáng)性。
免疫學(xué)方法是利用標(biāo)記抗原或抗體檢測(cè)或測(cè)定抗體量或抗原量的方法。免疫學(xué)方法的例子包括放射性物質(zhì)標(biāo)記免疫抗體法、酶免疫分析、熒光免疫分析、發(fā)光免疫分析、Western印跡法、物理-化學(xué)方法等。
放射性物質(zhì)標(biāo)記免疫抗體法的例子包括這樣的方法:使本發(fā)明的抗體或抗體片段與抗原或表達(dá)抗原的細(xì)胞反應(yīng)，然后將抗免疫球蛋白抗體進(jìn)行放射性標(biāo)記，使其結(jié)合片段等等與其反應(yīng)，繼而利用閃爍計(jì)數(shù)器等測(cè)定。
酶免疫分析的例子包括這樣的方法:使本發(fā)明的抗體或抗體片段與抗原或表達(dá)抗原的細(xì)胞等反應(yīng)，然后使進(jìn)行過(guò)抗體標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體或其結(jié)合片段與其反應(yīng)，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)量發(fā)色的色素；并且可以使用例如夾心ELISA。至于酶免疫分析中使用的標(biāo)記物，可以使用任何已知的酶標(biāo)記物[酵素免疫測(cè)定法，醫(yī)學(xué)書(shū)院(1987)]。實(shí)例包括堿性磷酸酶標(biāo)記、過(guò)氧化物酶標(biāo)記、熒光素酶標(biāo)記、生物素標(biāo)記等。
夾心ELISA是抗體與固相結(jié)合起來(lái)的方法，待檢測(cè)或測(cè)量的抗原被俘獲，用另一種抗體與被俘獲的抗原反應(yīng)。在該ELISA中，制備兩種識(shí)別待檢測(cè)或測(cè)量的抗原的抗體或其抗體片段，但它們的抗原識(shí)別位點(diǎn)不同，一種抗體或抗體片段被預(yù)先吸附在板(例如96-孔板)上，而另一種抗體或抗體片段用熒光物質(zhì)例如FITC、酶例如過(guò)氧化物酶或生物素標(biāo)記。使吸附了上述抗體的板與從活體分離的細(xì)胞或其細(xì)胞破碎懸液、組織或其破碎液、培養(yǎng)細(xì)胞、血清、胸膜積液、腹水、眼液等反應(yīng)，然后使其與標(biāo)記的單克隆抗體或抗體片段反應(yīng)，并進(jìn)行該標(biāo)記物質(zhì)的相應(yīng)檢測(cè)反應(yīng)。當(dāng)通過(guò)該方法測(cè)量待測(cè)樣品中的抗原濃度時(shí)，可以從通過(guò)逐步稀釋已知濃度的抗原制備的校準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算待測(cè)樣品中的抗原濃度。至于夾心ELISA使用的抗體,可以使用任何多克隆抗體和單克隆抗體,或者可以使用抗體片段例如Fab、Fab’和F(ab)2。至于夾心ELISA中使用的兩種抗體的組合,可以使用識(shí)別不同表位的單克隆抗體或抗體片段的組合，或者可以使用多克隆抗體與單克隆抗體或抗體片段的組口 ο
熒光免疫分析包括記載在下面文獻(xiàn)中的方法等[MonoclonalAntibodies-Principles and practice, Third Edition (單克隆抗體-原理和實(shí)踐，第三版)，單克隆抗體試驗(yàn)手冊(cè)，Kodansha Scientific (1987) ] 0至于突光免疫分析的標(biāo)記物，可以使用已經(jīng)記載的任何已知的突光標(biāo)記物(突光抗體法，Soft Science, (1983))。例子包括 FITC、RITC 等。
可以利用在文獻(xiàn)[生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光，臨床檢查42，廣川書(shū)店(1998)]等中記載的方法，進(jìn)行發(fā)光免疫分析。至于發(fā)光免疫分析使用的標(biāo)記物，可以包括任何已知的發(fā)光標(biāo)記物。可以使用的例子包括吖啶酯、洛芬堿等。
Western印跡法是被抗原或表達(dá)抗原的細(xì)胞通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分級(jí)的方法[Antibodies-A Laboratory Manual (抗體-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(Cold Spring HarborLaboratory, 1988)],該凝膠被點(diǎn)在PVDF膜或硝化纖維素膜上,使該膜與識(shí)別抗原的抗體或抗體片段反應(yīng)，進(jìn)一步使其與用熒光物質(zhì)例如FITC、酶標(biāo)記物例如過(guò)氧化物酶、生物素標(biāo)記等標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體或抗體片段反應(yīng)，使該標(biāo)記物可視化來(lái)確認(rèn)反應(yīng)。其例子描述如下。將表達(dá)具有SEQ ID N0:2表示的氨基酸序列的多肽的細(xì)胞或組織溶解在溶液中，在還原條件下將每道0.1至30 μ g的蛋白量通過(guò)SDS-PAGE法進(jìn)行電泳。電泳過(guò)的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，使其與含有I至10%BSA的PBS (以下稱為“BSA-PBS” )在室溫下反應(yīng)30分鐘，進(jìn)行封阻。此時(shí)，使本發(fā)明的單克隆抗體與其反應(yīng)，用含有0.05至0.l%Tween20的PBS (以下稱為“Tween-PBS”)洗滌，并使得與用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。用Tween-PBS洗漆并利用ECL Western印跡檢測(cè)試劑(Amersham制造)等檢測(cè)單克隆抗體結(jié)合條帶，從而檢測(cè)具有SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的多肽。至于Western印跡法中供檢測(cè)所用的抗體，使用的是能夠與不具有天然型三維結(jié)構(gòu)的多肽結(jié)合的抗體。
物理化學(xué)方法具體通過(guò)將ASCT2作為抗原與本發(fā)明的抗體或抗體片段反應(yīng)以形成凝集體，并檢測(cè)該凝集體進(jìn)行。物理化學(xué)方法的其它例子包括毛細(xì)管法、一維免疫擴(kuò)散法、免疫比濁法、乳膠免疫比濁法[臨床檢查法提要，金原出版(1988)]等。例如，在乳膠免疫擴(kuò)散法中，可以使用載體，例如粒徑約0.1至I μ m用抗體或抗原致敏的聚苯乙烯乳膠，并且當(dāng)利用該相應(yīng)的抗原或抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)溶液中的散射光增加而透射光減少。當(dāng)作為吸光度或積分球濁度檢測(cè)到這樣的改變時(shí)，就可以在待測(cè)樣品中測(cè)量抗原濃度坐寸ο
另一方面，為了檢測(cè)或測(cè)量表達(dá)ASCT2的細(xì)胞，可以使用已知的免疫學(xué)檢測(cè)方法，優(yōu)選使用免疫沉淀法、免疫細(xì)胞染色法、免疫組織染色法、熒光抗體染色法等。
免測(cè)沉淀法是使表達(dá)ASCT2的細(xì)胞與本發(fā)明的單克隆抗體或抗體片段反應(yīng)，然后添加與免疫球蛋白例如蛋白G-瓊脂糖具有特異性結(jié)合能力的載體，以便抗原-抗體復(fù)合體沉淀的方法。也可以進(jìn)行以下方法。本發(fā)明的單克隆抗體或抗體片段在用于ELISA的96-孔板上是固相化的，然后用BSA-PBS封阻。當(dāng)抗體是未純化的狀態(tài)例如雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液時(shí)，抗小鼠免疫球蛋白或大鼠免疫球蛋白或蛋白A或G等預(yù)先吸附在用于ELISA的96-孔板上，并用BSA-PBS封阻，在其中分配雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液進(jìn)行結(jié)合。在棄去BSA-PBS并用PBS充分洗滌殘余物之后，用表達(dá)ASCT2的細(xì)胞或組織的溶解溶液進(jìn)行反應(yīng)。從用SDS-PAGE用樣品緩沖液充分洗滌的板提取免疫沉淀物，并通過(guò)上述Western印跡法檢測(cè)。
免疫細(xì)胞染色法和免疫組織染色法是這樣的方法:將表達(dá)抗原的細(xì)胞或組織在有必要的情況下用表面活性劑、甲醇等處理，使得抗體容易的透入細(xì)胞或組織，然后使本發(fā)明的單克隆抗體與其反應(yīng)，然后進(jìn)一步使其與受過(guò)熒光標(biāo)記例如FITC、酶標(biāo)記例如過(guò)氧化物酶或生物素標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體或其結(jié)合片段反應(yīng)，并使標(biāo)記物可視化和在顯微鏡下觀察。檢測(cè)也可以通過(guò)突光抗體染色法進(jìn)行[Monoclonal Antibodies-Principlesand practice, Third Edition (單克隆抗體_原理和實(shí)踐，第三版),AcademicPress (1996), Manual for Experimentspf Monoclonal Antibodies (單克隆抗體試驗(yàn)手冊(cè))，Kodansha Scientif ic (1987)],其中使細(xì)胞與突光標(biāo)記抗體反應(yīng)并通過(guò)流式細(xì)胞儀分析。特別是，因?yàn)楸景l(fā)明的單克隆抗體或抗體片段與ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合，所以它可以優(yōu)選被用來(lái)通過(guò)熒光抗體染色法檢測(cè)表達(dá)保持天然型三維結(jié)構(gòu)的這種多肽的細(xì)胞。
另外，在熒光抗體染色法中使用FMAT8100HTS系統(tǒng)(Applied Biosystems制造)等的情況下，不用將形成的抗體-抗原復(fù)合體與未參與形成抗體-抗原復(fù)合體的游離抗體或抗原分離，就可以測(cè)量抗原量或抗體量。
下面通過(guò)實(shí)施例描述本發(fā)明；但是，本發(fā)明不局限于以下實(shí)施例。
實(shí)施例1:各種細(xì)胞系、異種移植物和正常組織中ASCT2基因表達(dá)的分析
(I)SCID小鼠皮下移植癌細(xì)胞系來(lái)構(gòu)建異種移植物和制備腫瘤塊
依照以下方法，在SCID小鼠中皮下移植人類癌細(xì)胞系，從而構(gòu)建異種移植物。從所產(chǎn)生的異種移植物摘出和制備腫瘤塊
來(lái)源于人類胰腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞[ASPC-1(ATCC編號(hào):CRL_1682)、CaPan-1 (ATCC編號(hào):HTB_79)、PANC-1 (ATCC編號(hào):CRL_1469)]、和人類結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系[Colo205 (Riken (理研院)細(xì)胞庫(kù)編號(hào):RCB2127)、HT_29 (ATCC 編號(hào):HTB_38)、LS180 (ATCC編號(hào)刃(^-187)、5胃1116(六了0:編號(hào):CCL-233)和WiDr (ATCC編號(hào):CCL_218)]以細(xì)胞密度約IxlO8細(xì)胞/mL懸浮在PBS中。在每組4只Fox CHASE C.B-17/Icr-scidJcl小鼠(雄性，5周齡，購(gòu)自日本CLEA社)的腹側(cè)皮下移植各細(xì)胞懸液100 μ L/動(dòng)物。
各種細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱中37° C下在含有10%失活的胎牛血清(Invitrogen制造)的RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen制造)中懸浮和傳代培養(yǎng)，用于移植。
得到的異種移植物分別命名為xASPCl、xCaPanl、xPANCl、xColo205、xHT29、xLS180、xSW1116 和 XffiDr0
腫瘤移植之后，腫瘤塊的直徑天天使用游標(biāo)卡尺測(cè)量。腫瘤的主軸達(dá)到大約Icm的動(dòng)物依次在麻醉下放血處死，然后摘出每個(gè)腫瘤塊。每個(gè)腫瘤塊切成4份，用液氮迅速冷凍，然后儲(chǔ)存在_80°C的冷凍器中。
(2)總RNA的提取和poly A (+) RNA的純化
從細(xì)胞系和上面(I)制備的異種移植物的腫瘤塊中，依照以下程序提取總RNA和純化 poly A (+) RNA。
至于細(xì)胞系，使用血液癌來(lái)源的細(xì)胞系{KG-1 (ATCC編號(hào):CCL_246)，THP-1 (ATCC編號(hào):TIB-202)，HL-60(ATCC編號(hào):CCL_240)[以上均為急性骨髓性白血病(AML)來(lái)源的細(xì)胞系];CCRF-CEM (ATCC 編號(hào):CCL-119)，CCRF-SB (ATCC 編號(hào):CCL-120)，Jurkat (ATCC 編號(hào):TIB-152)，HSB-2(ATCC 編號(hào):CCL_120)，HPB-ALL (理研院細(xì)胞庫(kù)編號(hào):RCB1935)[以上均為急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)來(lái)源的細(xì)胞系];K-562(ATCC編號(hào):CCL_243)，KU812(ATCC編號(hào):CRL-2099)[以上均為慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)來(lái)源的細(xì)胞系];KMS_11 (HSRRB編號(hào) JCRBl 179)，ARH-77(ATCC 編號(hào):CRL_1621)，頂-9 (ATCC 編號(hào):CCL_159)，RPMI8226 (HSRRB編號(hào) JCRB0034)，U266B1 (ATCC 編號(hào):TIB-196)，MC/CAR(ATCC 編號(hào):CRL_8083)[以上均為多發(fā)性骨髓瘤(MM)來(lái)源的細(xì)胞系]；HS-Su I tan (ATCC編號(hào)=CRL-1484)，Daudi (ATCC編號(hào):CCL-213)，Raji (ATCC 編號(hào):CCL_86)，Ramos (ATCC 編號(hào):CRL_1596)[以上均為Burkitt 淋巴瘤(BL)來(lái)源的細(xì)胞系];U-937(ATCC 編號(hào):CRL_1593.2)，ML_1(DSMZ 編號(hào):ACC464)[均為組織細(xì)胞淋巴瘤(HS)來(lái)源的細(xì)胞系]};肺癌來(lái)源的細(xì)胞系[PC-14理研院細(xì)胞庫(kù)編號(hào):RCB0446)，PC-7(免疫生物研究所社，產(chǎn)品編號(hào):37011)，PC_9(免疫生物研究所社，產(chǎn)品編號(hào):37012)，PC-1 (免疫生物研究所社，產(chǎn)品編號(hào):37008)(以上均為非小細(xì)胞肺癌)；Lu-139(理研院細(xì)胞庫(kù)編號(hào):RCB0469), NC1-H69 (ATCC編號(hào)=HTB-119),RERF-LC-MA(HSRRB 編號(hào) JCRBQ812)，SBC-5 (HSRRB 編號(hào) JCRB0819)(以上均為小細(xì)胞肺癌)];胃癌來(lái)源的細(xì)胞系[Kato III (理 研院細(xì)胞庫(kù)編號(hào):RCB2088)，MKN-74 (HSRRB編號(hào):JCRBG255)，NUGC-4(理研院細(xì)胞庫(kù)編號(hào):RCB1939)，AZ-521 (HSRRB 編號(hào) JCRB0061)];結(jié)腸直腸癌來(lái)源的細(xì)胞系{Colo205(理研院細(xì)胞庫(kù)編號(hào):RCB2127)、HT-29(ATCC編號(hào):HTB_38)、LS174T[European Collection of Cell Cultures (歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)(ECACC)編號(hào)=87060401], LS180(ATCC 編號(hào):CCL187)，SWl116 (ATCC 編號(hào):CCL_233)};胰腺癌來(lái)源的細(xì)胞系[ASPC-1 (ATCC 編號(hào):CRL-1682)，BXPC-3 (ATCC 編號(hào):CRL_1687)，CaPan-1 (ATCC編號(hào):HTB-79)];惡性黑色素瘤(黑色素瘤)來(lái)源的細(xì)胞系[G-361(ATCC編號(hào):CRL_1424)，HMV-1 (理研院細(xì)胞庫(kù)編號(hào):RCB0004)，SK-MEL-28(ATCC編號(hào):HTB_72)];和正常人類肺成纖維細(xì)胞[MRC-5 (ATCC 編號(hào):CCL-171)]。
從細(xì)胞系提取總RNA如下進(jìn)行。在粘著細(xì)胞系的情況下，培養(yǎng)之后使用抽吸器除去培養(yǎng)基，用適量的PBS洗滌，并使用有機(jī)硅制成的刮片回收細(xì)胞。將細(xì)胞充分懸浮并通過(guò)每種細(xì)胞對(duì)應(yīng)于IOcm2培養(yǎng)面積添加ImL TRIzol試劑(Invitrogen制造)進(jìn)行裂解。另夕卜，得到的細(xì)胞裂解液10次通過(guò)18-號(hào)注射針頭，將基因組DNA斷裂成片。在漂浮細(xì)胞系的情況下，使用冷凍離心機(jī)(日立工機(jī)社制造，Himac CF15R，轉(zhuǎn)頭:T11A21)，將細(xì)胞培養(yǎng)物以1，500rpm離心5分鐘，通過(guò)傾析除去培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸浮在PBS中。細(xì)胞懸浮液再次用冷凍離心機(jī)(日立工機(jī)社制造，Himac CF15R，轉(zhuǎn)頭:T11A21)以1500rpm離心5分鐘，并回收細(xì)胞。向IxlO7個(gè)回收細(xì)胞中，添加ImL TRIzol試劑(Invitrogen制造)，并充分懸浮使得細(xì)胞裂解。將細(xì)胞裂解液10次通過(guò)18-號(hào)注射針頭，將基因組DNA斷裂成片。
如下進(jìn)行(I)中制備的異種移植物腫瘤塊的裂解和總RNA的提取。將凍結(jié)的腫瘤塊投入IOmL TRIzol試劑(Invitrogen制造)中，并立即使用Polytron勻衆(zhòng)器(PT2100,Kinematica制造)以30，OOOrpm裂解15秒，得到細(xì)胞裂解液。每個(gè)細(xì)胞裂解液使用冷凍離心機(jī)(日立工機(jī)社制造，Himac CF15R，轉(zhuǎn)頭:T11A21)以11，OOOrpm離心10分鐘，并將各上清液小心轉(zhuǎn)移到新鮮試管，免得帶出沉淀物。向上清液添加2mL氯仿并劇烈攪拌15秒，混合物在室溫下靜置2至3分鐘，并使用冷凍離心機(jī)(日立工機(jī)社制造，Himac CF7D2，轉(zhuǎn)頭:RT3S3)在4°C下以3，OOOrpm離心90分鐘。將各上清液轉(zhuǎn)移至新鮮的試管，向其添加5mL異丙醇，然后輕柔混合。將混合物在室溫下靜置10分鐘，并使用冷凍離心機(jī)(日立工機(jī)社制造，Himac CF15R，轉(zhuǎn)頭:T11A21)以11，OOOrpm離心10分鐘去除上清液之后，向其中添加10mL75%乙醇水溶液，然后使用冷凍離心機(jī)(日立工機(jī)社制造，Himac CF15R，轉(zhuǎn)頭:T11A21)以11，OOOrpm混合和離心5分鐘,得到沉淀物。沉淀物溶解在適量的無(wú)RNase的水中，以制備總RNA樣品。總RNA樣品的濃度通過(guò)吸光光度計(jì)測(cè)量，并確認(rèn)A260/A280的比率是1.7以上。當(dāng)A260/A280的比率小于1.7時(shí)`，使用RNeasy試劑盒(Qiagen制造)進(jìn)行進(jìn)一步純化。
從上面制備的400 μ g總RNA樣品中，使用Micro Poly(A)純化試劑盒(Ambion制造)，按照其中附帶的說(shuō)明書(shū)，純化poly A(+)RNA。
(3)cDNA 的合成
使用供RT-PCR用的Superscript第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen制造)，從(2)中得到的poly A(+)RNA或市售的組織來(lái)源的mRNA合成cDNA。
至于來(lái)源于人類正常組織(肝臟、肺、全腦、心臟、胃、脾、脊髓、小腸、骨骼肌、子宮、呼吸道、甲狀腺、胸腺、精巢、唾液腺、前列腺、胎盤(pán)、淋巴結(jié)、胰腺、大腸、血液或腎臟)的mRNA,使用市售的mRNA (Clontech制造)。來(lái)源于人類臨床癌組織(肺癌、胃癌、直腸結(jié)腸癌、腎癌、肝癌、子宮癌、乳腺癌或食道癌)的mRNA，也使用市售的RNA(BioChain制造)。
向⑵中得到的I μ g poly A (+) RNA或市售的組織來(lái)源的mRNA中，添加I μ L10mmol/L dNTP 和 I μ L0.5 μ g/ μ L Oligo (dT) 12_18，然后向其中添加 DEPC 水至總量7 μ L0將反應(yīng)溶液在65°C加熱5分鐘變性，在冰上驟冷，并使其靜置I分鐘以上。向mRNA溶液中，添加 IOx RT 緩沖液(2 μ L)、氯化鎂(4 μ L, 25mmol/L) ,0.lmol/LDTT (2 μ L)和RNase OUT重組核糖核酸酶抑制劑(I μ L)，并將溫度保持在42 V 2分鐘。向其中再加入SuperscriptII RT(IyL)以在42°C進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)50分鐘。在70°C加熱15分鐘使酶失活。然后，向反應(yīng)溶液中加入IuL大腸桿菌RNase H并在37°C反應(yīng)20分鐘。向所得到的溶液中添加DEPC /K，以達(dá)到總量ImL。
以下，是采用以上制備的溶液的五倍稀釋液10 μ L進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR的反應(yīng)體系。
(4)通過(guò)實(shí)時(shí)PCR法(定量PCR法或Q-PCR法)定量測(cè)定細(xì)胞系、異種移植物腫瘤塊和正常組織中ASCT2基因的mRNA的表達(dá)水平
向(3)中制備的各cDNAlOy L(對(duì)應(yīng)于2ng的poly A(+)RNA)中，加入用于檢測(cè)ASCT2基因的cDNA的正向引物(Fw#l)和用于檢測(cè)ASCT2基因的cDNA的反向引物(Rv#l)，達(dá)到它們各自300nmol/L的終濃度，其中正向引物包含從SEQ ID N0:1設(shè)計(jì)的SEQ ID NO: 3表示的核苷酸序列，反向引物包含SEQ ID N0:4表示的核苷酸序列(均由Proligo制造)。此夕卜，向得到的溶液中，加入IOx R-PCR緩沖液(無(wú)Mg2+，Takara Bio制造，2 μ L)、250mmol/L Mg2+溶液(0.2μ L)、dNTPs(10mmol/L，0.6μ L)、Ex Taq R-PCR (Takara Bio 制造，0.2 μ L)和SYBR Green I (BMA制造；產(chǎn)品原液稀釋2，500倍，I μ L)。向其中添加DEPC水，至總量20 μ L0
PCR在以下反應(yīng)條件下進(jìn)行:最初在94°C激活Taq DNA聚合酶和變性模板DNA5分鐘，然后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，每個(gè)由三個(gè)過(guò)程組成:94°C變性30秒、65°C退火30秒和72°C DNA延長(zhǎng)30秒。由插入到擴(kuò)增產(chǎn)物的SYBR Green I產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度通過(guò)PRISM7700 (AppliedBiosystems制造)測(cè)量,數(shù)據(jù)根據(jù)儀器PRISM7700附帶的軟件Sequence Detectorl.7a版進(jìn)行分析。以上實(shí)時(shí)PCR得到的信號(hào)是否是目的擴(kuò)增片段，通過(guò)在反應(yīng)完成之后將反應(yīng)溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳得到的主要擴(kuò)增片段的大小來(lái)判斷。以上實(shí)時(shí)PCR使用96-孔PCR板進(jìn)行。除了以上含有cDNA的反應(yīng)溶液以外，陰性對(duì)照(無(wú)菌水)和使用通過(guò)Qiagen質(zhì)粒Midi試劑盒(Qiagen制造)純化的編碼ASCT2的部分片段的質(zhì)粒HCH0N2001712 (人類CDNAFLJ43232 fis,日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(DDBJ)編號(hào):AK125222)制備的用于制作校準(zhǔn)曲線(1x10至IxlO6拷貝/ 孔)的樣品，以PCR板的每個(gè)孔中一種樣品進(jìn)行安排，并進(jìn)行PCR。
圖1 (I)至I (4)顯示作為ASCT2的標(biāo)準(zhǔn)序列的NM005628的全長(zhǎng)序列(SEQID NO:1, GenBank編號(hào):NM_005628)的比對(duì)，和用作模板用于制作校準(zhǔn)曲線的質(zhì)粒HCH0N2001712的全長(zhǎng)序列的比對(duì)。在NM_005628和HCH0N2001712的全長(zhǎng)序列之間有不一樣的位點(diǎn)。因此，供檢測(cè)包含SEQ ID N0:3表示的核苷酸序列的cDNA用的正向引物(Fw#l)和供檢測(cè)包含SEQ ID N0:4表示的核苷酸序列的cDNA用的反向引物(Rv#l)，二者用于測(cè)量ASCT2表達(dá)水平，它們使用在NM_005628和HCH0N2001712序列之間完全同樣的區(qū)域來(lái)設(shè)計(jì)。
在每個(gè)這樣得到的細(xì)胞系、異種移植物腫瘤塊和正常組織中ASCT2基因的mRNA的表達(dá)水平的結(jié)果顯示在圖2(1)至2 (2)中。mRNA表達(dá)水平顯示為每2ng的poly A(+)RNA表達(dá)的ASCT2分子數(shù)與規(guī)定為I的顯示出正常組織最高表達(dá)的氣道中ASCT2基因表達(dá)水平的相對(duì)比。與正常氣道相比較，發(fā)現(xiàn)了表達(dá)水平提高，亦即，下列細(xì)胞系的表達(dá)提高了 10-倍以上:血液癌來(lái)源的細(xì)胞系KG-UAML-來(lái)源的細(xì)胞系)，HSB-2(ALL-來(lái)源的細(xì)胞系)，K-562 (CML-來(lái)源的細(xì)胞系)，和KMS-1l和ARH-77 ( 二者均為MM-來(lái)源的細(xì)胞系);下列細(xì)胞系的表達(dá)提高了 5-倍以上:Jurkat (ALL-來(lái)源的細(xì)胞系)，頂_9，RPMI8226 ( 二者均為MM-來(lái)源的細(xì)胞系)，HS-Sultan (BL-來(lái)源的細(xì)胞系)和ML-1 (HL-來(lái)源的細(xì)胞系)；下列細(xì)胞系的表達(dá)提高了 2-倍以上:THP-1 (AML-來(lái)源的細(xì)胞系)，CCRF-CEM(ALL-來(lái)源的細(xì)胞系)，KU812 (CML-來(lái)源的細(xì)胞系)，Raji (BL-來(lái)源的細(xì)胞系)，U-937 (HS-來(lái)源的細(xì)胞系)，胃癌組織和食道癌組織。
實(shí)施例2:導(dǎo)入人類ASCT2-myC/His基因的CHO細(xì)胞系的構(gòu)建
按照以下方法，得到包含SEQ ID NO:5表示的核苷酸序列和SEQ ID N0:6表示的氨基酸序列的質(zhì)粒PCR4-SLC1 A5-myc/Hiso使用這種質(zhì)粒，得到了導(dǎo)入人類ASCT2_myc/His基因的CHO細(xì)胞系。
向包含SEQ ID NO:7-10的各個(gè)核苷酸序列的相應(yīng)引物(10 μ mol/μ L，各1L)中，加入 IOx Ex Taq 緩沖液(10 μ L)、dNTP (2mmol/L, 10 μ L)和 Ex Taq 聚合酶(I μ L,以上均由Takara Bio制造)，并向其中進(jìn)一步加入無(wú)菌水至總量100 μ L。以類似于實(shí)施例1 (3)中記載的方法，在以下反應(yīng)條件 下進(jìn)行PCR:在96° C反應(yīng)2分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)由三個(gè)過(guò)程組成:96° C反應(yīng)I分鐘、60° C反應(yīng)I分鐘和72° C反應(yīng)I分鐘。結(jié)果，當(dāng)人類ASCT2基因翻譯起始點(diǎn)的核苷酸被定為I位時(shí)，合成了對(duì)應(yīng)于I至370位核苷酸序列的核苷酸序列(以下稱為“N-SLC1A5”)。反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離。所得到的大約0.4-kb的擴(kuò)增片段使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen制造)進(jìn)行提取，然后使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen制造)克隆到pCR4T0P0載體中(以下，所得到的質(zhì)粒稱為“PCR4-N-SLC1A5”)。
接下來(lái)，向IOng包含人類ASCT2基因作為模板的質(zhì)粒HCH0N2001712 (DDBJ編號(hào):AK125222)中，加入包含SEQ ID NOs: 11和12表示的核苷酸序列的各個(gè)引物(10 μ mol/L，各Iμ L)、IOx Ex Taq 緩沖液(10μ L)、dNTP(2mmol/L，10μ L)和 Ex Taq 聚合酶(I μ L，以上均由Takara Bio制造)，并向其中進(jìn)一步加入無(wú)菌水至總量100 μ L。在與上面描述的相同反應(yīng)條件下，進(jìn)行PCR以合成編碼融合蛋白的核苷酸序列(以下稱為“C-SLClA5-myc/His”)，所述融合蛋白在對(duì)應(yīng)于人類ASCT2基因365至1623位核苷酸序列的核苷酸序列的C-端附加了 myc/His。反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離。所得到的大約1.2_kb擴(kuò)增片段使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen制造)進(jìn)行提取。向所得到的作為模板的提取片段中，加入包含SEQ ID N0s:ll和13表示的核苷酸序列的各個(gè)引物(ΙΟμπιοΙ/L，各lyL)、10xEx Taq 緩沖液(10 μ L)、dNTP (2mmol/L, 10 μ L)和 Ex Taq 聚合酶(I μ L,以上均由 TakaraBio制造)，并向其中進(jìn)一步加入無(wú)菌水至總量100 μ L0在與上面描述的相同反應(yīng)條件下，進(jìn)行PCR以向C-SLClA5-myc/His的C端添加Notl和Spel限制酶位點(diǎn)。所得到的反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離。所得到的大約1.2-kb的擴(kuò)增片段使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen制造)進(jìn)行提取,然后使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen制造)克隆到PCR4T0P0載體中(以下，將所得到的質(zhì)粒稱為“pCR4-C-SLClA5-myc/His”)。盡管當(dāng)SEQ IDNO:1表示的序列的翻譯起始點(diǎn)處的核苷酸被規(guī)定為I位時(shí)，1455位的T被C取代，但所得到的基因序列沒(méi)有顯示出氨基酸變異。
得到的pCR4-N-SLClA5用BssHII (Takara Bio 制造)和 SpeI (Takara Bio 制造)消化，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離。得到的大約4.4-kb的基因片段使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen制造)進(jìn)行提取。同樣地,得到的pCR4-C-SLClA5_myc/His用BssHII (TakaraBio制造)和SpeI (Takara Bio制造)消化，并提取大約1.4_kb的基因片段。每個(gè)提取片段使用Ligation high(東洋紡織社制造)連接，然后按照Cohen等的方法[Proc NatlAcad-Sci USA盤(pán)2110 (1972)]，用得到的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (東洋紡織社制造)。使用自動(dòng)化質(zhì)粒分離系統(tǒng)P1-50 (Kurabo制造)，從得到的轉(zhuǎn)化體提取質(zhì)粒，得到包含SEQ IDΝ0:5表示的核苷酸序列和SEQ ID Ν0:6表示的氨基酸序列的質(zhì)粒pCR4-SLClA5myc/His。
將得到的pCR4_SLClA5myc/His 用 EcoRI (Takara Bio 制造)和 KpnI (Takara Bio制造)消化，并以上面同樣的方式，提取基因片段，得到包含編碼融合蛋白的核苷酸序列(以下稱為“SLClA5-myC/His”)的片段，所述融合蛋白在人類ASCT2基因的C-端添加了myc/Hisο
將得到的含有SLClA5_myc/His的片段連接到預(yù)先用EcoRI (Takara Bio制造)和KpnI (Takara Bio制造)消化的pKANTEX93載體中(W097/10354)。用與上述同樣的方式，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci (東洋紡織社制造)。得到轉(zhuǎn)化體之后，使用質(zhì)粒分離試劑盒(Qiagen 制造)得到表達(dá)質(zhì)粒 pKANTEX-SLClA5_myc/His。
依照電穿孔法[Cytotechnology,3, 133 (1990)],將 pKANTEX-SLClA5_myc/His 以下述方式導(dǎo)入 CH0/DG44細(xì)胞[Somatic Cell and Molecular Genetics.12.555 (1986) I。在此使用的細(xì)胞是在含有10%FBS(Life Technologies制造)和慶大霉素(50 μ g/mL，NacalaiTesque制造)的IMDM (Invitrogen制造)中添加IxHT補(bǔ)充劑(Invitrogen制造)的培養(yǎng)基(以下稱為“A3培養(yǎng)基”)中傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。CH0/DG44細(xì)胞懸浮在含有氯化鉀(137nmol/U、氯化鈉(2.7nmol/L)、磷酸氫二鈉(8.lmmol/L)、磷酸二氫鈉(1.5nmol/L)和氯化鎂(4mmol/L)的緩沖液(以下稱為“Κ-PBS”)中，至細(xì)胞密度為8xl06細(xì)胞/mL，并將得到的細(xì)胞懸液(200 μ L，細(xì)胞計(jì)數(shù)為1.6χ106細(xì)胞)與表達(dá)質(zhì)粒pKANTEX-SLClA5-myc/His (10 μ g)混合。將混合物轉(zhuǎn)移到小池(電極間距:2mm)中，使用GenePulser II (Bio-Rad制造)在0.35kV的脈沖電壓和250 μ F的電容下進(jìn)行基因?qū)搿⑿〕卦诒响o置后，將小池中的細(xì)胞懸液懸浮在含有A3培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)容器中，在5%C02培養(yǎng)箱中37°C下培養(yǎng)。培養(yǎng)四天之后，用含有G418的A3培養(yǎng)基(Nacalai Tesque制造；0.5mg/mL)更換培養(yǎng)基，繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)期間進(jìn)行培養(yǎng)基更換和傳代培養(yǎng)，在基因?qū)胫蟠蠹s兩周，得到對(duì)G418有抗性的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
將得到的G418-抗性轉(zhuǎn)化細(xì)胞在含有0.5mg/L G418的A3培養(yǎng)基中(NacalaiTesque制造)稀釋到細(xì)胞密度為5個(gè)細(xì)胞/10mL，并將稀釋的細(xì)胞懸液以100 μ L/孔分配到96-孔板中，然后在逐步增加的氨甲喋呤濃度中生長(zhǎng)。以這種方式，選擇顯示出ASCT2-myc/His的高表達(dá)水平的克隆，然后從中得到導(dǎo)入了人類ASCT2-myC/His基因的CHO細(xì)胞系。
得到的人類ASCT2_myc/His基因?qū)氲腃HO細(xì)胞(Ixl05-5xl05cells)懸浮在70%乙醇-PBS(ImL)中并在冰溫下固定30分鐘。在以IxlO6至5xl06細(xì)胞/孔分配到96-孔U形底板并隨后在1，500rpm離心5分鐘之后，棄去上清液，然后用1%BSA_PBS在冰溫下封阻30分鐘。離心除去上清液后，抗-myc抗體PL14(醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所制造)、抗-His抗體(Qiagen制造)和小鼠IgGl同種型對(duì)照(Dako制造)作為第一抗體分別用1%BSA_PBS稀釋至終濃度為1.0、0.1和0.lyg/mL，并以100 μ L/孔分配，在冰溫下反應(yīng)60分鐘。在板用1%BSA-PBS洗滌一次之后，添加100 μ L/孔用1%BSA_PBS稀釋50倍的FITC-標(biāo)記的抗小鼠免疫球蛋白G(H+L) (DAK0制造)作為第二抗體，并在遮光和冰溫下反應(yīng)30分鐘。在用1%BSA-PBS再次洗滌一次之后，將細(xì)胞懸浮在PBS中，并通過(guò)流式細(xì)胞儀CytomicsFC500MPL,Beckman Coulter制造)測(cè)量熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示在圖3中。根據(jù)檢測(cè)到抗_myc抗體和抗-His抗體高反應(yīng)性的事實(shí)，確認(rèn)構(gòu)建了導(dǎo)入人類ASCT2-myC/His基因的目的CHO細(xì)胞系。
實(shí)施例3:對(duì)抗ASCT2的N-端部分肽的單克隆抗體的構(gòu)建
(I)制備免疫原
為了與載體蛋白結(jié)合,使用自動(dòng)化合成機(jī)(PSSM-8,島津制作所社制造)合成SEQID NO: 14表示的C-端附加了 Cys的人類ASCT2基因的N-端部分肽(從N-端起2至16位氣基酸殘基)。
為了提高免疫原性，如下制備與KLH(和光純藥社制造)的結(jié)合物，并用作免疫原。亦即，將KLH溶解在PBS中至濃度為10mg/mL，然后將1/10體積的N_(間-馬來(lái)酰亞胺苯甲酰氧基)琥拍酰亞胺(MBS, Nacalai Tesque制造,25mg/mL)逐滴添加到其中，然后在攪拌下反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)溶液通過(guò)預(yù)先用PBS平衡的凝膠過(guò)濾柱(Sephadex G-25柱，GEHealthcare制造)，除去未反應(yīng)的MBS，得到KLH-MBS。附加了 Cys的人類ASCT2的N-端部分肽(Img)溶解在磷酸鈉緩沖液(0.lmol/L, pH7.0)中，向其中添加2.5mg KLH-MBS，然后在攪拌下于室溫中反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)完成之后，反應(yīng)溶液對(duì)PBS透析，從而獲得人類ASCT2N端肽-KLH結(jié)合物作為免疫原。
(2)動(dòng)物的免疫和抗體產(chǎn)生細(xì)胞的制備
將上面(I)得到的人類ASCT2N端肽-KLH結(jié)合物(100 μ g)與2mg鋁凝膠和IxlO9細(xì)胞的百日咳疫苗(千葉縣血清研究所制造)一起施用至4-周齡雌性SD大鼠(日本SLC出產(chǎn))。第一次給藥之后兩周，將結(jié)合物(IOOyg)每周一次再施用于所述大鼠，總計(jì)四次。從大鼠的尾靜脈收集血液，其與人類ASCT2部分肽的反應(yīng)性通過(guò)以下的酶免疫分析調(diào)查。最后免疫的三天之后，從顯示出足夠抗體滴度的大鼠摘出脾臟。
脾臟在MEM(日水制藥社制造)中細(xì)細(xì)切碎，用鑷子分散，在l，200rpm下離心5分鐘(CR5B，日立制作所制造)。向得到的沉淀級(jí)分中添加Tris-氯化銨緩沖液(pH7.65)，反應(yīng)I至2分鐘，以除去紅血球。作為沉淀級(jí)分得到的細(xì)胞級(jí)分用MEM洗三次，從而制備抗體產(chǎn)生細(xì)胞。
(3)酶免疫分析
根據(jù)以下方法，將SEQ ID NO: 14表示的人類ASCT2的附加Cys的N-端部分肽制備成與甲狀腺球蛋白(以下稱為“THY”)的結(jié)合物的形式。結(jié)合物的構(gòu)建方法與⑴相同，但是使用4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基]-環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯代替MBS。
得到的人類ASCT2N 端肽-THY結(jié)合物(10 μ g/mL, 50 μ L/孔)分配到96-孔EIA板(Greiner制造)中，在4° C靜置過(guò)夜以便吸附。洗掉未吸附的結(jié)合物之后，向板添加l%BSA-PBS(100yL/孔)，然后在室溫反應(yīng)I小時(shí)，封阻剩余的活性基團(tuán)。洗掉未反應(yīng)的BSA-PBS之后，將50 μ L/孔的被測(cè)物質(zhì)例如抗血清或培養(yǎng)上清液作為第一抗體分配到板中，然后反應(yīng)2小時(shí)。將板用0.05%Tween-PBS洗滌，并將50 μ L/孔稀釋的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗大鼠免疫球蛋白(Dako制造)作為第二抗體加到板中，然后在室溫反應(yīng)I小時(shí)。在板用0.05%Tween-PBS洗滌之后，在孔中添加2，2-連氮雙(3-乙基苯并噻唑啉_6_磺酸)銨(ABTS)底物溶液[ABTS (和光純藥社制造，lmmol/L)，檸檬酸鹽緩沖液(0.lmol/L, pH4.2)，和Η202 (0.1%)]，然后顯色。在樣品波長(zhǎng)415nm和參考波長(zhǎng)490nm下的吸光度(0D415-0D490)使用讀板器(Emax微板讀板器，Molecular Devices)測(cè)量。
(4)小鼠骨髓瘤細(xì)胞的制備
8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤-抗性小鼠骨髓瘤細(xì)胞系P3-U1 [P3X63Ag8U.1, ATCC編號(hào):CRL-1597, European Journal of Immunology, 511 (1976)]培養(yǎng)在于 RPMI1640 培養(yǎng)基(Invitrogen制造)中添加了谷氨酰胺(1.5mmol/L)、2_巰基乙醇(5xlO_5mol/L)、慶大霉素(10 μ.g/mL)和FBS(10%)的培養(yǎng)基(以下稱為“正常培養(yǎng)基”)中以確保細(xì)胞融合必要的2xl07個(gè)以上的細(xì)胞計(jì)數(shù)，并在細(xì)胞融合中作為親本細(xì)胞提供。
(5)雜交瘤的制備
在⑵中得到的抗體產(chǎn)生細(xì)胞和⑷中得到的骨髓瘤細(xì)胞以10:1的比例混合，并將得到的細(xì)胞以1，200rpm離心5分鐘(CR5B，日立制作所制造)。棄去上清液并充分分散沉淀的細(xì)胞。在37° C和攪拌下，每IxlO8個(gè)抗體產(chǎn)生細(xì)胞加入PEGlOOO(Ig)、MEM(Invitrogen制造，ImL)和二甲基亞砜(0.35mL)的混合物0.5mL,并數(shù)次每隔I至2分鐘向懸液添加MEM(ImL)，然后添加MEM至總量為50mL。900rpm下離心5分鐘之后(CR5B，日立制作所制造)，棄去上清液并緩慢打散沉淀的細(xì)胞。然后，通過(guò)輕柔地上下吹吸，將細(xì)胞懸浮在IOOmL添加了 HAT培養(yǎng)基補(bǔ)充劑(Invitrogen制造)的正常培養(yǎng)基(以下稱為“HAT培養(yǎng)基”)中。
在96-孔培養(yǎng)板中，分配200uL/孔得到的懸液，并在5%C02培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)10至14天。
培養(yǎng)之后，培養(yǎng)上清液通過(guò)(3)中記載的酶免疫分析進(jìn)行檢查，選擇特異性與人類ASCT2的N-端部分肽反應(yīng)的孔。選擇的孔中包含的細(xì)胞通過(guò)有限稀釋法克隆兩次，得到產(chǎn)生對(duì)抗ASCT2的N端部分肽的單克隆抗體的雜交瘤KM3842。使用亞類分型試劑盒(ABTSarotech制造)，KM3842的抗體亞類被確定為是大鼠IgG2a(圖4)。
(6)獲得純化的單克隆抗體
(5)中得到的雜交瘤(5x106-20x106細(xì)胞/動(dòng)物)腹膜內(nèi)注射到降植烷處理的8周齡雌性裸鼠(Balb/c，日本SLC出產(chǎn))中。10至21天之后，雜交瘤變成腹水癌。從產(chǎn)生腹水的小鼠收集腹水(l_8mL/動(dòng)物)。然后，將腹水以3，OOOrpm離心5分鐘(CR5B，日立制作所制造)，以除去固形成分。得到的溶液通過(guò)辛酸沉淀法[Antibodies-A LaboratoryManual (抗體-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)),Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]純化,獲得純化的KM3842 抗體。
實(shí)施例4:ASCT2的N端部分肽與純化的單克隆抗體的反應(yīng)性調(diào)查
根據(jù)實(shí)施例3 (3)中記載的酶免疫分析法，考察單克隆抗體KM3842與ASCT2的N端部分肽的反應(yīng)性。實(shí)施例3(6)中得到的純化的抗體KM3842用1%BSA_PBS分別稀釋至10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001 μ g/mL的濃度，并用作一級(jí)抗體。測(cè)量結(jié)果如圖4所示，抗體KM3842顯示出與ASCT2的N端部分肽的特異反應(yīng)性。
實(shí)施例5:對(duì)抗ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的單克隆抗體的構(gòu)建
(I)制備免疫原
實(shí)施例2得到的導(dǎo)入人類ASCT2-myc/His基因的CHO細(xì)胞系培養(yǎng)在含有10%FBS的IMDM(Invitrogen制造)中2至3天，并使用0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(NacalaiTesque制造)剝離。細(xì)胞懸浮在PBS中，達(dá)到每個(gè)免疫動(dòng)物為6χ106-1χ107個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)。
(2)動(dòng)物的免疫和抗體產(chǎn)生細(xì)胞的制備
(I)中得到的細(xì)胞懸液與IxlO9個(gè)細(xì)胞的百日咳疫苗(千葉縣血清血清研究所制造)一起，施用于6-周齡雄性BXSB小鼠(η=3/組，日本SLC出產(chǎn))或4-周齡雌性SD大鼠(η=3/組，日本SLC出產(chǎn))。給藥一周之后，所述細(xì)胞懸液每周一次施用于所述動(dòng)物，總計(jì)四次。此后，從小鼠的眼底或大鼠的尾靜脈收集血液。血液中其抗體滴度使用以下細(xì)胞基分析系統(tǒng)(ΑΒΙ8200細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng),Applied Biosystems制造)或流式細(xì)胞儀(CytomicsFC500MPL,Beckman Coulter制造)，通過(guò)熒光細(xì)胞染色法測(cè)量。最后免疫的三天之后，從顯示出足夠抗體滴度的小鼠或大鼠摘出脾臟。
用和實(shí)施例3(2) —樣的方法，從得到的脾臟制備抗體產(chǎn)生細(xì)胞。
(3)熒光細(xì)胞染色法-1 (細(xì)胞基分析系統(tǒng))
實(shí)施例2中得到的導(dǎo)入ASCT2-myc/His基因的CHO細(xì)胞系和導(dǎo)入載體的CHO細(xì)胞用作分析細(xì)胞。每種細(xì)胞在含有10%FBS的MDM(Invitrogen制造)中培養(yǎng)2至3天，并用懸浮在相同培養(yǎng)基中的胰蛋白酶-EDTA溶液(InvitiOgen制造)剝離，以IxlO4細(xì)胞/100 μ L培養(yǎng)基/孔的細(xì)胞密度接種在ΑΒΙ8200黑色96-孔板中，并培養(yǎng)過(guò)夜。將被測(cè)物質(zhì)例如抗血清或培養(yǎng)上清液(IOyL/孔)分配至板中作為第一抗體，然后添加IOOyL/孔的ALEXA647-標(biāo)記的抗小鼠免疫球蛋白G (H+L)或ALEXA647-標(biāo)記的抗大鼠免疫球蛋白G(H+L)(以上均由Invitrogen制造)作為第二抗體，然后遮光下靜置4小時(shí)。用激光器(633nm He/Ne)激發(fā)的650至685nm的熒光通過(guò)ABI8200細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)(AppliedBiosystems制造)進(jìn)行測(cè)量。
(4)熒光細(xì)胞染色法-2 (流式細(xì)胞儀)
實(shí)施例2得到的導(dǎo)入人類ASCT2-myC/His基因的CHO細(xì)胞系和導(dǎo)入載體的CHO細(xì)胞用作分析細(xì)胞。每種細(xì)胞在含有10%FBS的MDM(Invitrogen制造)中培養(yǎng)2至3天并用0.0296EDTA溶液(Nacalai Tesque制造)剝離，將它們用PBS洗滌，并使用1%BSA_PBS在冰溫下封阻20分鐘，以避免非特異性抗體吸附。得到的細(xì)胞以5x10s細(xì)胞/50 μ L/孔的細(xì)胞密度接種在96-孔U形底板中，然后以l，800rpm離心2分鐘(05PR-22，日立工機(jī)社制造)，然后除去上清液。分配被測(cè)物質(zhì)(50 μ L/孔)例如抗血清或培養(yǎng)上清液作為第一抗體，然后在冰溫下反應(yīng)30分鐘。使用PBS通過(guò)離心法洗滌3次，并添加50 μ L/孔的ALEXA488標(biāo)記的抗小鼠免疫球蛋白G(G+L)或ALEXA488標(biāo)記的抗大鼠免疫球蛋白G(G+L)(均由Invitrogen制造)作為第二抗體，然后遮光下在冰溫下反應(yīng)30分鐘。細(xì)胞再次使用PBS通過(guò)離心洗滌三次之后，將細(xì)胞懸浮在PBS中，用488nm Ar激光器激發(fā)的510至530nm的熒光通過(guò)流式細(xì)胞儀(Cytomics FC500MPL, Beckman Coulter 制造)測(cè)量。
(5)雜交瘤的構(gòu)建
用和實(shí)施例3(5) —樣的方法，在(2)中得到的抗體產(chǎn)生細(xì)胞和實(shí)施例3(4)得到的骨髓瘤細(xì)胞之間進(jìn)行細(xì)胞融合。
接著，將細(xì)胞融合得到的細(xì)胞懸浮在HAT培養(yǎng)基中。將得到的細(xì)胞懸液以200uL/孔分配到96-孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞在5%C02培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)8至10天。
培養(yǎng)后的上清液的反應(yīng)性通過(guò)上面(3)和(4)記載的熒光細(xì)胞染色法確認(rèn)，并選擇與導(dǎo)入人類ASCT2-myC/His基因的CHO細(xì)胞系起反應(yīng)而不與導(dǎo)入載體的CHO細(xì)胞起反應(yīng)的孔。然后，將選出的孔中包含的細(xì)胞通過(guò)有限稀釋法克隆兩次，以得到產(chǎn)生對(duì)抗ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的單克隆抗體的雜交瘤KM3998、KM4000、KM4001、KM4008、KM4012和KM4018。
在得到的雜交瘤當(dāng)中，按照以下方法測(cè)定小鼠單克隆抗體的亞類。
將抗小鼠免疫球蛋白兔多克隆抗體(Dako制造,10 μ g/mL, 50 μ L/孔)分配到96-孔EIA板(Greiner制造)中，并在4° C靜置過(guò)夜進(jìn)行吸附。洗掉未吸附的結(jié)合物之后，向板添加l%BSA-PBS100y L/孔，然后在室溫反應(yīng)I小時(shí)，以封阻剩余的活性基團(tuán)。洗掉未反應(yīng)的BSA-PBS之后，將50 μ L/孔的被測(cè)物質(zhì)分配到板中，然后反應(yīng)2小時(shí)。將板用0.05%Tween-PBS洗滌，并將稀釋的亞類特異性過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠免疫球蛋白(Invitrogen制造,50 μ L/孔)作為第二抗體加到板中，然后在室溫反應(yīng)I小時(shí)。將板用0.05%Tween-PBS洗滌，并添加實(shí)施例3 (3)使用的ABTS底物溶液進(jìn)行顯色。然后，在樣品波長(zhǎng)415nm和參考波長(zhǎng)490nm下的吸光度(0D415-0D490)使用讀板器(Emax微板讀板器，Molecular Devices)測(cè)量。所屬亞類不能通過(guò)以上提到的方法確定的小鼠單克隆抗體的亞類使用小鼠大鼠單克隆同種型分型試劑盒(大日本住友制藥社制造)測(cè)定。此外，大鼠單克隆抗體的亞類使用大鼠單克隆同種型分型試劑盒(大日本住友制藥社制造)測(cè)定。
表I示出動(dòng)物物種和來(lái)源于各個(gè)雜交瘤的抗體一覽表。
表I
權(quán)利要求
1.單克隆抗體或其抗體片段，所述單克隆抗體特異性識(shí)別系統(tǒng)ASC氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2ASCT2的細(xì)胞外區(qū)域的天然三維結(jié)構(gòu)并與該細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合，其中: (C)抗體的VH的CDRl、CDR2和CDR3分別由SEQ ID NO:49、50和51表示的氨基酸序列組成，和抗體的VL的CDR1、CDR2和CDR3分別由SEQ ID NO: 52、53和54表示的氨基酸序列組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其抗體片段，其抑制通過(guò)ASCT2細(xì)胞內(nèi)攝取氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體或其抗體片段，其具有細(xì)胞毒性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單克隆抗體或其抗體片段，其中所述細(xì)胞毒性是抗體依賴性細(xì)胞毒性ADCC活性或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性CDC活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體或其抗體片段，其與人類ASCT2結(jié)合而不與小鼠ASCT2結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的單克隆抗體或其抗體片段，其與人類ASCT2的至少EL2區(qū)域彡口口
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體片段，其中所述抗體片段是選自Fab、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體scFv、二聚體化V區(qū)雙抗體、二硫鍵穩(wěn)定的V區(qū)dsFv和包含⑶R的肽的抗體片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體或其抗體片段，其中所述單克隆抗體是重組抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組抗體或其抗體片段，其中所述重組抗體是選自人嵌合抗體、人源化抗體和人類抗體的重組抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組抗體或其抗體片段，其包括權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL的互補(bǔ)決定區(qū)CDR。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的人嵌合抗體或其抗體片段，其包含權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的單克隆抗體的VH和VL。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的人嵌合抗體或其抗體片段，其選自其中抗體的VH包含SEQID NO:46表示的氨基酸序列和抗體的VL包含SEQ ID N0:48表示的氨基酸序列的人嵌合抗體。
13.DNA，其編碼權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)所述的抗體或其抗體片段。
14.重組載體，其包含權(quán)利要求13所述的DNA。
15.轉(zhuǎn)化體，其能通過(guò)將權(quán)利要求14所述的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞獲得。
16.生產(chǎn)權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)所述的抗體或其抗體片段的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)化體以在培養(yǎng)物中形成和累積權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)所述的抗體或其抗體片段，和從所述培養(yǎng)物收集所述抗體或其抗體片段。
17.ASCT2相關(guān)疾病的治療藥，其包含權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)所述的抗體或其抗體片段作為活性成分。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的治療藥，其中與ASCT2相關(guān)的疾病是癌癥。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的治療藥，其中癌癥是血液癌、食道癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌、肝癌或前列腺癌。
20.免疫學(xué)檢測(cè)或測(cè)量ASCT2的試劑，其利用權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)所述的抗體或其抗體片段。
21.ASCT2相關(guān)疾病的診斷試劑，其利用權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)所述的抗體或其抗體片段。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的診斷試劑，其中與ASCT2相關(guān)的疾病是癌癥。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的診斷試劑，其中癌癥是血液癌、食道癌、胃癌、直腸結(jié)腸癌、肝癌或前列腺癌。
24.免疫學(xué)檢測(cè)或測(cè)量ASCT2的方法，其利用權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)所述的抗體或其抗體片段。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中免疫學(xué)測(cè)量方法是免疫沉淀法。
26.免疫學(xué)檢測(cè)或測(cè)量表達(dá)ASCT2的細(xì)胞的方法，其利用權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)所述的抗體或其抗體片段。
27.根據(jù)權(quán) 利要求26所述的方法，其中免疫學(xué)檢測(cè)方法是熒光細(xì)胞染色法。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了單克隆抗體或其抗體片段，所述單克隆抗體特異性識(shí)別ASC氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2系統(tǒng)(ASCT2)的細(xì)胞外區(qū)域的天然結(jié)構(gòu)并與該細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合；能夠產(chǎn)生所述抗體的雜交瘤；編碼所述抗體的DNA；攜帶所述DNA的載體；通過(guò)導(dǎo)入所述載體產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體；利用所述雜交瘤或轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)抗體或其抗體片段的方法；和包含所述抗體或其抗體片段的治療藥，以及包含所述抗體或其抗體片段的診斷試劑。
文檔編號(hào)C12N5/20GK103145835SQ20131005093
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2009年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月17日
發(fā)明者白石紀(jì)彥, 古谷安希子, 土岐浩惠, 安藤博司, 鈴木昌代, 久保田麗夫 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會(huì)社