用于生產d-對羥基苯甘氨酸的dna分子、重組質粒以及重組菌的制作方法【專利摘要】本發明公開了一種用于生產D-對羥基苯甘氨酸的DNA分子、重組質粒以及重組菌。本發明提供的DNA分子，包括PL啟動子、D-海因酶基因和N-氨甲酰水解酶基因，由所述PL啟動子啟動所述D-海因酶基因和所述N-氨甲酰水解酶基因的表達。本發明提供了一個能穩定、大量地表達D-海因酶和N-氨甲酰水解酶的DNA分子、以及基于該DNA分子的重組載體和重組菌。同時本發明還提供了應用所述重組菌或該重組菌的發酵物將DL-對羥基苯海因轉化為D-對羥基苯甘氨酸的方法，只生成D-對羥基苯甘氨酸，無需拆分分離對映體，轉化率高，整個生產過程具有條件溫和、操作簡單、對環境友好的優點。【專利說明】用于生產D-對羥基苯甘氨酸的DNA分子、重組質粒以及重組菌【
技術領域：
】[0001]本發明涉及用于生產D-對羥基苯甘氨酸的DNA分子、重組質粒以及重組菌。【
背景技術：
】[0002]D-對羥基苯甘氨酸是一種重要的醫藥中間體，用于生產內酰胺類半合成抗生素。內酰胺類半合成抗生素包括羥氨芐青霉素(阿莫西林)、頭孢羥氨芐(歐意)等。與傳統的青霉素G類抗生素相比，β-內酰胺類半合成抗生素具有抗菌譜廣、毒性低、口服效果好等優點，臨床應用廣泛，市場非常巨大。據統計，2009年全球抗生素藥物市場銷售額為280億美元，其中β-內酰胺類半合成抗生素約占65%，為182億美元。從2000到2009年，僅阿莫西林和頭孢羥氨芐產量就分別增長了614%和762%。這些藥物的大規模生產使得D-對羥基苯甘氨酸的需求大幅增加。據悉，目前全球D-對羥基苯甘氨酸的需求量近3萬噸，國內也接近2萬噸。數據顯示，每年全球D-對羥基苯甘氨酸的供應缺口約為6000噸，國內約3000噸，且供需矛盾隨著需求量的逐年增加而越發嚴重。因此，開發高效的D-對羥基苯甘氨酸的生產方法非常重要。[0003]目前，D-對羥基苯甘氨酸的生產方法主要有化學法和生物法。[0004]化學法通過先合成DL-對羥基苯甘氨酸，然后再拆分得到D-對羥基苯甘氨酸。合成DL-對羥基苯甘氨酸主要有苯甲醛法和乙醛酸法。苯甲醛法通過使用對羥基苯甲醛與氰化鈉作用生成對羥基-α-羥基苯乙腈，然后酸水解生成DL-對羥基苯甘氨酸，該法原料價格較高，且使用劇毒的氰化物，生產中存在HCN氣體及含CN-廢水的處理問題。乙醛酸法通過使用乙醛酸、苯酚等生成DL-對羥基苯甘氨酸，反應過程中需要大量酸堿，且需要高壓。將DL-對羥基苯甘氨酸拆分成D-對羥基苯甘氨酸的常用方法有化學拆分法和誘導結晶法。化學拆分法是先將DL-對羥基苯甘氨酸在甲醇中以硫酸為催化劑制成甲醛，加入拆分劑制成DL-對羥基苯甘氨酸甲酯，再將其與拆分試劑作用生成鹽，利用鹽的溶解度不同分離。該法反應周期長，單程轉化率低。誘導結晶法是將DL-對羥基苯海因與拆分劑在含有水醇溶液中加熱制成飽和溶液，然后通過降溫分離，操作繁瑣，且產物不純。綜上所述，化學法在生產D-對羥基苯甘氨酸方面存在步驟繁瑣、副反應多、收率較低的問題，給后續產物純化帶來困難。另外，化學法生產普遍需要高溫高壓，且經常使用大量酸堿，對環境污染較為嚴重。[0005]生物法是以DL-對羥基苯海因作為底物，利用微生物中特定的酶或者利用其完整細胞將其轉化為D-對羥基苯甘氨酸。單酶法主要是通過表達海因酶將DL-對羥基苯海因轉變成N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸，然后再經過化學法水解獲得D-對羥基苯甘氨酸。由于D-海因酶可以特異性地生產D-對羥基苯甘氨酸，因此該法專一性強，收率較高，但缺點是反應過程仍然需要添加大量酸，對后續處理帶來問題。【
發明內容】[0006]本發明的目的是提供用于生產D-對羥基苯甘氨酸的DNA分子、重組質粒以及重組菌。[0007]本發明提供的DNA分子，包括PL啟動子、D-海因酶基因和N-氨甲酰水解酶基因，由所述PL啟動子啟動所述D-海因酶基因和所述N-氨甲酰水解酶基因的表達；[0008]所述D-海因酶是如下(a)或(b):[0009](a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；[0010](b)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有將DL-對羥基苯海因轉化為N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸的功能的由序列I衍生的蛋白質；[0011]所述述N-氨甲酰水解酶是如下(C)或(d):[0012](c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；[0013](d)將序列3的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有將N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸轉化為D-對羥基苯甘氨酸的功能的由序列3衍生的蛋白質。[0014]所述PL啟動子為如下I)或2)或3)的DNA分子:[0015]I)序列表中序列5所示的DNA分子；[0016]2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；[0017]3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有啟動子功能的DNA分子。[0018]所述D-海因酶基因為如下4)或5)或6)的DNA分子:[0019]4)編碼區如序列表中序列2所示的DNA分子；[0020]5)在嚴格條件下與4)限定的DNA序列雜交且編碼所述D-海因酶的DNA分子；[0021]6)與4)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述D-海因酶的DNA分子；[0022]所述N-氨甲酰水解酶基因為如下7)或8)或9)的DNA分子:[0023]7)編碼區如序列表中序列4所示的DNA分子；[0024]8)在嚴格條件下與7)限定的DNA序列雜交且編碼所述N-氨甲酰水解酶的DNA分子;[0025]9)與7)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述N-氨甲酰水解酶的DNA分子。[0026]上述嚴格條件可為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC、0.1%SDS和IXSSC,0.1%SDS各洗膜一次。[0027]所述DNA分子可依次包括如下元件:所述PL啟動子、所述D-海因酶基因和所述N-氨甲酰水解酶基因。具體來說，所述DNA分子依次由如下元件組成:所述PL啟動子、限制性內切酶SalI的酶切識別序列、所述D-海因酶基因、限制性內切酶XbaI的酶切識別序列和所述N-氨甲酰水解酶基因。[0028]含有所述DNA分子的重組載體或重組菌也屬于本發明的保護范圍。[0029]所述重組載體可為在載體pUC18的多克隆位點(如HindIII和KpnI酶切位點之間)插入所述DNA分子得到的重組質粒。[0030]所述重組菌可為所述重組載體導入大腸桿菌得到的重組菌。所述大腸桿菌具體可為大腸桿菌DH5α。[0031]以上任一所述DNA分子，以上任一所述重組載體，或以上任一所述重組菌，均可用于生產D-對羥基苯甘氨酸。所述應用中，用于生產D-對羥基苯甘氨酸的底物為DL-對羥基苯海因。[0032]本發明還保護所述重組菌的發酵物。所述發酵物的制備方法可包括如下步驟:將所述重組菌進行發酵，然后收集菌體并進行超聲破碎，離心收集上清液。所述發酵的條件具體可為:將所述重組菌接種至含50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養基，37°C、200rpm、振蕩培養12小時。所述超聲破碎的條件具體可為:超聲功率為200w，處理時間為4min，每超聲3s停3s。所述離心的條件具體可為:1000Orpm離心lmin。[0033]本發明還保護一種生產D-對羥基苯甘氨酸的方法，包括如下步驟:以DL-對羥基苯海因為底物，加入所述發酵物，反應后得到D-對羥基苯甘氨酸。[0034]本發明還保護另一種生產D-對羥基苯甘氨酸的方法，包括如下步驟:以DL-對羥基苯海因為底物，加入所述重組菌，反應后得到D-對羥基苯甘氨酸。[0035]本發明提供了一個能穩定、大量地表達D-海因酶和N-氨甲酰水解酶的DNA分子、以及基于該DNA分子的重組載體和重組菌。該重組菌或該重組菌的發酵物可以高效轉化DL-對羥基苯海因生產D-對羥基苯甘氨酸，無需添加任何誘導劑。同時本發明還提供了應用所述重組菌或該重組菌的發酵物將DL-對羥基苯海因轉化為D-對羥基苯甘氨酸的方法，只生成D-對羥基苯甘氨酸，無需拆分分離對映體，轉化率高，整個生產過程具有條件溫和、操作簡單、對環境友好的優點。【專利附圖】【附圖說明】[0036]圖1為不同重組菌生產D-海因酶和N-氨甲酰水解酶的能力-電泳圖；I對應重組菌DH5a/pUC-pPL-hyd-car,2對應重組菌DH5a/pUC-pT7Al-hyd-car,3對應重組菌DH5α/pUC-pPAND-hyd-car。[0037]圖2為重組菌DH5a/pUC-pPL-hyd-car得到的上清液的HPLC圖譜。[0038]圖3為三種重組菌的D-海因酶酶活和N-氨甲酰水解酶酶活的比較。[0039]圖4為實施例4的結果。【具體實施方式】[0040]以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。[0041]來源為苜猜中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)的D-海因酶如序列表的序列I所示，其編碼基因如序列表的序列2所示。來源為假單胞菌(Pseudomonassp.)的N-氨甲酰水解酶如序列表的序列3所示，其編碼基因如序列表的序列4所示。PL啟動子(又稱pPL)如序列表的序列5所示。PAND啟動子(又稱pPAND)如序列表的序列6所示。T7A1啟動子(又稱ρΤ7Α1)如序列表的序列7所不。[0042]載體pUC18:寶生物工程(大連)有限公司。大腸桿菌DH5c1:天根生化科技(北京)有限公司。DL-對羥基苯海因(DL-對羥基苯海因標準品):梯希愛(上海)化成工業發展有限公司，產品編號H0806。D-對羥基苯甘氨酸標準品:梯希愛(上海)化成工業發展有限公司，產品編號H0758。N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸標準品:用D-海因酶水解DL-對羥基苯海因獲得(參考文獻:Dong-CheolLee,Hak-SungKim.0ptimizationofaheterogeneousreactionsystemfortheproductionofopticallyactiveD—aminoacidsusingthermostableD-hydantoinase.BiotechnologyBioengineering.1998，60(6)，729-738.)O[0043]實施例1、重組質粒的構建[0044]一、重組質粒pUC-hyd-car的構建[0045]1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。[0046]2、以步驟I合成的雙鏈DNA分子為模板,用hyd-for和hyd_rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。[0047]hyd-for:5，-TGCTTGTCGACATGAGCACTGTCATCAAGGG-3>；[0048]hyd-rev:5，-ACGAACTCTAGATCAGACGCCGCTTGCGGGAAT-3，。[0049]3、用限制性內切酶SalI和XbaI雙酶切步驟2的PCR擴增產物，回收酶切產物。[0050]4、用限制性內切酶SalI和XbaI雙酶切載體pUC18，回收載體骨架(約2680bp)。[0051]5、將步驟3的酶切產物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質粒pUC-hyd。[0052]6、合成序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子。。[0053]7、以步驟6合成的雙鏈DNA分子為模板,用car-for和car_rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。[0054]car-for:5，~TGCTTTCTAGAATGACACGCATCGTCAATGCAGCCG~3，；[0055]car-rev:5，~TGCTTGGTACCTCACTGCGGCGGCGGCACA~3，。[0056]8、用限制性內切酶XbaI和KpnI雙酶切步驟7的PCR擴增產物，回收酶切產物。[0057]9、用限制性內切酶XbaI和KpnI雙酶切重組質粒pUC_hyd，回收載體骨架(約4135bp)。[0058]10、將步驟8的酶切產物和步驟9的載體骨架連接，得到重組質粒pUC-hyd-car。[0059]根據測序結果，對重組質粒pUC-hyd-car進行結構描述如下:以載體pUC18為骨架載體，在SalI和XbaI酶切位點之間插入了序列表的序列2所示的D-海因酶基因，在XbaI和KpnI酶切位點之間插入了序列表的序列4所示的N-氨甲酰水解酶基因。[0060]二、重組質粒pUC-pPL-hyd-car的構建[0061]1、合成序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子。[0062]2、以步驟I合成的雙鏈DNA分子為模板，用pPL_F0R和pPL-REV組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。[0063]pPL-F0R:5’~TGCTTAAGCTTCATACAGATAACCATCTGCG~3J；[0064]pPL-REV:5，~TGCTTGTCGACGTGGTCAGTGCGTCCTGCTG~3，。[0065]3、用限制性內切酶HindIII和SalI雙酶切步驟2的PCR擴增產物，回收酶切產物。[0066]4、用限制性內切酶HindIII和SalI雙酶切重組質粒pUC-hyd-car，回收載體骨架(約5056bp)。[0067]5、將步驟3的酶切產物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質粒pUC-pPL-hyd-car。[0068]根據測序結果，對重組質粒pUC-pPL-hyd-car進行結構描述如下:在重組質粒pUC-hyd-car的HindIII和SalI酶切位點之間插入了序列表的序列5所示的PL啟動子。[0069]三、重組質粒pUC-pPAND-hyd-car的構建[0070]1、合成序列表的序列6所不的雙鏈DNA分子。[0071]2、以步驟I合成的雙鏈DNA分子為模板，用pPAND_F0R和pPAND-REV組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。[0072]pPAND-F0R:5’~TGCTTAAGCTTAATATTCCTTTCCTTGTC~3J；[0073]pPAND-REV:5，~TGCTTGTCGACCTGTGGTGTCCTTATGGGGG~3，。[0074]3、用限制性內切酶HindIII和SalI雙酶切步驟2的PCR擴增產物，回收酶切產物。[0075]4、用限制性內切酶HindIII和SalI雙酶切重組質粒pUC-hyd-car，回收載體骨架(約5056bp)。[0076]5、將步驟3的酶切產物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質粒pUC-pPAND-hyd-car?[0077]根據測序結果，對重組質粒pUC-pPAND-hyd-car進行結構描述如下:在重組質粒pUC-hyd-car的HindIII和SalI酶切位點之間插入了序列表的序列6所示的PAND啟動子。[0078]四、重組質粒pUC-pT7Al-hyd_car的構建[0079]1、合成序列表的序列7所示的雙鏈DNA分子。[0080]2、以步驟I合成的雙鏈DNA分子為模板，用pT7Al_F0R和pT7Al_REV組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。[0081]pT7Al-F0R:5’~GCTTAAGCTTTCTTTATTAATACAACTCAC~3J；[0082]pT7A1-REV:5，~TGCTTGTCGACCTATTCGCCGTGTCCCTCTC~3，。[0083]3、用限制性內切酶HindIII和SalI雙酶切步驟2的PCR擴增產物，回收酶切產物。[0084]4、用限制性內切酶HindIII和SalI雙酶切重組質粒pUC-hyd-car，回收載體骨架(約5056bp)。[0085]5、將步驟3的酶切產物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質粒pUC-pT7Al-hyd-car。[0086]根據測序結果，對重組質粒pUC-pT7Al-hyd_car進行結構描述如下:在重組質粒pUC-hyd-car的HindIII和SalI酶切位點之間插入了序列表的序列7所示的T7A1啟動子。[0087]實施例2、重組菌的制備[0088]將重組質粒pUC-pPL-hyd-car導入大腸桿菌DH5α感受態細胞，得到重組菌DH5a/pUC-pPL-hyd-car。[0089]將重組質粒pUC-pPAND-hyd-car導入大腸桿菌DH5α感受態細胞，得到重組菌DH5a/pUC-pPAND-hyd-car。[0090]將重組質粒pUC-pT7Al-hyd_car導入大腸桿菌DH5α感受態細胞，得到重組菌DH5a/pUC-pT7Al-hyd_car。[0091]實施例3、不同重組菌表達目的蛋白水平的比較[0092]分別將實施例2制備的各個重組菌進行如下操作:[0093]1、挑取重組菌單菌落接種于15ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養基，37°C、200rpm振蕩培養，得到OD.?=〗.8的菌液。[0094]2、取IOml步驟I得到的菌液，轉接至100mL含100μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養基，得到0D6(l(lnm=3.0的初始發酵體系，37°C、200rpm、振蕩培養12小時，得到終止發酵體系O[0095]3、取2mL終止發酵體系，1000Orpm離心lmin，收集菌體沉淀，超聲破碎(超聲功率為200w,處理時間為4min,每超聲3s停3s),然后1000Orpm離心lmin,收集上清液。[0096]4、取步驟3得到的上清液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，見圖1。[0097]D-海因酶的預期分子量為53KD，N-氨甲酰水解酶的預期分子量為35KD。三種重組菌均顯示有對應D-海因酶和N-氨甲酰水解酶的預期分子量的條帶，且重組菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car發酵產生的D-海因酶和N-氨甲酰水解酶最多，顯著高于重組菌DH5α/pUC-pT7Al-hyd-car和重組菌DH5a/pUC-pPAND-hyd-car。[0098]5、取800μL步驟3得到的上清液，加入0.02gDL-對羥基苯海因，37°C靜置反應30min,然后12000rpm離心lmin，取上清液，用雙蒸水稀釋至50倍體積后進行HPLC檢測。[0099]HPLC檢測采用Agilent色譜柱(EclipseXDB-C18,5μm,4.6X150mm),流動相為0.041g/L的乙酸鈉水溶液(pH2.7)，流速lml/min，紫外檢測波長為270nm。重組菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car步驟3得到的上清液的HPLC圖譜見圖2，DL-對羥基苯海因、N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸、D-對羥基苯甘氨酸的出峰位置分別為5.600min、3.863min、l.655min,均與DL-對羥基苯海因標準品、N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸標準品和D-對羥基苯甘氨酸標準品的出峰位置相同。重組菌DH5a/pUC-pT7Al-hyd-car步驟3得到的上清液和重組菌DH5α/pUC-pPAND-hyd-car步驟3得到的上清液的HPLC圖譜與重組菌DH5a/pUC-pPL-hyd-car得到的上清液的HPLC圖譜一致。[0100]用DL-對羥基苯海因標準品制作的標準曲線方程為:y=554x，y代表峰面積，x代表DL-對羥基苯海因濃度(單位mM)。[0101]用N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸標準品制作的標準曲線方程為:y=520.68x，y代表峰面積，X代表N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸濃度(單位mM)。[0102]用D-對羥基苯甘氨酸標準品制作的標準曲線方程為:y=577.96x,y代表峰面積，X代表D-對羥基苯甘氨酸濃度(單位mM)。[0103]每分鐘生成IμmoI產物所需要的酶量定義為一個酶活單位。計算D-海因酶酶活時，底物為DL-對羥基苯海因，產物為N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸。計算N-氨甲酰水解酶酶活時，底物為N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸，產物為D-對羥基苯甘氨酸。[0104]重組菌DH5a/pUC-pPL-hyd-car步驟3得到的上清液的D-海因酶酶活為0.6±0.02U/ml,N-氨甲酰水解酶酶活為0.8±0.02U/ml。重組菌DH5α/pUC-pT7Al-hyd-car步驟3得到的上清液的D-海因酶酶活為0.5±0.04U/ml，N_氨甲酰水解酶酶活為0.67±0.07U/ml。重組菌DH5a/pUC-pPAND-hyd-car步驟3得到的上清液的D-海因酶酶活為0.31±0.05U/ml,N-氨甲酰水解酶酶活為0.54±0.04U/ml。[0105]三種重組菌的D-海因酶酶活和N-氨甲酰水解酶酶活的比較見圖3。結果表明，重組菌DH5a/pUC-pPL-hyd-car發酵產生的D-海因酶和N-氨甲酰水解酶最多，因此其步驟3得到的上清液的D-海因酶酶活和和N-氨甲酰水解酶的酶活也最高。[0106]實施例4、采用重組菌全細胞生產D-對羥基苯甘氨酸[0107]分別將實施例2制備的各個重組菌進行如下操作:[0108]1、挑取重組菌單菌落接種于30ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養基，37°C、200rpm振蕩培養，得到OD.?=〗.6的菌液。[0109]2、取30ml步驟I得到的菌液，轉接至300ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養基，得到0D6(l(lnm=2.8的初始發酵體系，37°C、200rpm振蕩培養12小時，得到終止發酵體系O[0110]重組菌DH5a/pUC-pPL-hyd-car得到的終止發酵體系的0D6(l(lnm=2.8。重組菌DH5a/pUC-pPAND-hyd-car得到的終止發酵體系的0D6(l(lnm=2.9。重組菌DH5α/pUC-pT7Al-hyd-car得到的終止發酵體系的0D6(l(lmi=2.78。[0111]3、取整個終止發酵體系，1000Orpm離心3min,收集菌體沉淀,加入300ml30g/L的DL-對羥基苯海因水溶液，37°C、350rpm振蕩反應10小時，從加入DL-對羥基苯海因水溶液的時刻開始計時(初始時刻為O時刻)，每隔兩小時取樣，采用HPLC檢測D-對羥基苯甘氨酸的濃度(HPLC檢測方法見實施例3，將對應D-對羥基苯甘氨酸的峰面積代入實施例3中的用D-對羥基苯甘氨酸標準品制作的標準曲線方程)。[0112]結果見圖4。采用重組菌DH5a/pUC-pPL-hyd-car全細胞對DL-對羥基苯海因作用10小時后，體系中的D-對羥基苯甘氨酸濃度為14.73g/L，生產速率為1.4g/L/h。采用重組菌DH5a/pUC-pT7Al-hyd-car全細胞對DL-對羥基苯海因作用10小時后，體系中的D-對羥基苯甘氨酸濃度為12.29g/L。采用重組菌DH5a/pUC-pPAND-hyd-car全細胞對DL-對羥基苯海因作用10小時后，體系中的D-對羥基苯甘氨酸濃度為7.59g/L。【權利要求】1.一種DNA分子，包括PL啟動子、D-海因酶基因和N-氨甲酰水解酶基因，由所述PL啟動子啟動所述D-海因酶基因和所述N-氨甲酰水解酶基因的表達；所述D-海因酶是如下(a)或(b):Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有將DL-對羥基苯海因轉化為N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸的功能的由序列I衍生的蛋白質；所述述N-氨甲酰水解酶是如下(c)或(d):(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；Cd)將序列3的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有將N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸轉化為D-對羥基苯甘氨酸的功能的由序列3衍生的蛋白質。2.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于:所述PL啟動子為如下I)或2)或3)的DNA分子:1)序列表中序列5所不的DNA分子；2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有啟動子功能的DNA分子。3.如權利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于:所述D-海因酶基因為如下4)或5)或6)的DNA分子:4)編碼區如序列表中序列2所示的DNA分子；5)在嚴格條件下與4)限定的DNA序列雜交且編碼所述D-海因酶的DNA分子；6)與4)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述D-海因酶的DNA分子；所述N-氨甲酰水解酶基因為如下7)或8)或9)的DNA分子:7)編碼區如序列表中序列4所示的DNA分子；8)在嚴格條件下與7)限定的DNA序列雜交且編碼所述N-氨甲酰水解酶的DNA分子；9)與7)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述N-氨甲酰水解酶的DNA分子。4.含有權利要求1至3中任一所述DNA分子的重組載體或重組菌。5.如權利要求4所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為在載體PUC18的多克隆位點插入所述DNA分子得到的重組質粒。6.如權利要求4所述的重組菌，其特征在于:所述重組菌是將權利要求5所述重組載體導入大腸桿菌得到的重組菌。7.權利要求1至3中任一所述的DNA分子，或權利要求4所述的重組載體，或權利要求5所述的重組載體，或權利要求4所述的重組菌，或權利要求6所述的重組菌，在生產D-對羥基苯甘氨酸中的應用。8.權利要求4或6所述重組菌的發酵物。9.一種生產D-對羥基苯甘氨酸的方法，包括如下步驟:以DL-對羥基苯海因為底物，加入權利要求8所述發酵物，反應后得到D-對羥基苯甘氨酸。10.一種生產D-對羥基苯甘氨酸的方法，包括如下步驟:以DL-對羥基苯海因為底物，加入權利要求4或6所述重組菌，反應后得到D-對羥基苯甘氨酸。【文檔編號】C12N15/63GK103993010SQ201310054139【公開日】2014年8月20日申請日期:2013年2月20日優先權日:2013年2月20日【發明者】蔡真,張君麗申請人:中國科學院微生物研究所