專利名稱：一種等溫擴增核酸片段的方法
技術領域：
本發明涉及一種等溫擴增核酸片段的方法，特別是用與靶序列三個區域互補的一對引物通過鏈替代反應擴增核酸片段，該方法可作為特異基因片段的快速擴增檢測手段。
背景技術：
隨著現代分子生物學和分子技術的發展，研究開發了許多核酸擴增技術。其中核酸環介導等溫擴增技術(專利ZL 00818262.0, ZL01810370.7，ZL01812204.3，ZL02815992.6，ZL200610080379.7)，由于其具有特異性強、靈敏度高、反應速度快的特點，在核酸特異性擴增和檢測領域具有取代PCR的趨勢，成為生命科學領域研究的熱點之一。核酸環介導等溫擴增的主要原理是基于對靶序列的6個區域設計2對特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase),在65°C左右的等溫條件下保溫約60分鐘，即可完成核酸擴增反應，存在環引物的情況下，擴增時間可進一步縮短為40分鐘，同時具備不需要熱循環、擴增效率更高、不需要特殊儀器等優點。然而環介導等溫擴增技術需要針對核酸片段的6-8個區域設計引物，其中至少核酸片段的6個區域(F3C、F2C、F1、B1、B2C和B3C)與2對引物(實質是3對引物:F3, F1C_F2、B1C-B2、B3)完全匹配才能進行擴增，如果加上環引物(LF、LB)，需要設計4對引物，引物二聚體的產生很難避免，引物二聚體引起的假陽性問題也很難避免，限制了該技術的推廣應用。

發明內容
本發明的目的在于，提供一種采用一對引物等溫擴增核酸片段的方法，該方法可作為特異基因片段的快速擴增檢測手段。上述目的是通過如下技術方案實現的:
一對引物，其特征在于，針對核酸片段，采用PrimerPremier5.0等引物設計軟件，設計兩對類似于巢式？0 的又不具有重疊序列的引物？1、？2、1 2、1 1，其中，？2的互補序列F2C連在Fl的5’端；或R2的互補序列R2。連在Rl的5’端。引物組合，根據上述引物設計方法，四種引物組合方式分別為F2C_F1、Rl ;F1、R2C-R1 ；F2C-FUR2 ;F2、R2「R1，任何一種組合方式都可以實現核酸片段的等溫擴增。等溫擴增過程，其特征在于，DNA在65°C左右處于動態平衡狀態，任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈，本發明的整個反應過程分為核酸片段合成階段、循環擴增階段和多米諾擴增階段，下面將以F2e-Fl、Rl為例闡述等溫擴增過程，如附2、圖3和圖4。核酸片段合成階段:引物F2C-F1的Fl結合到模板DNA的Fle上，引導合成互補的DNA鏈，如附圖2 (I)和(2);雙鏈合成后，引物Rl結合到DNA的Rle上，引導合成互補的DNA鏈，如附圖2 (3)和(4);在65°C左右DNA處于動態平衡狀態，可以解離 成兩個單鏈，解離下的單鏈可作為循環擴增階段的初始模板，如附圖2 (5)。循環擴增階段:初始模板上的F2。和F2互補結合，如圖3 (6)，在具有鏈替代作用的DNA聚合酶催化作用下，由F2的3 ’端向5 ’端自發擴增，如圖3 (7 )，同時，引物F2C_F1的Fl結合初始模板的Fle上，如圖3 (6)，在具有鏈替代作用的DNA聚合酶催化作用下，由引物F2e-Fl的3’端向5’端擴增，如圖3 (7)，由初始模板與引物F2e_Fl雙向引發的擴增結果如圖3 (8)所示，隨后引物Rl結合到擴增產物的R1。上，在具有鏈替代作用的DNA聚合酶催化作用下向5’端擴增，如圖3 (9)，并替代下雙鏈部分的相應單鏈，擴增產物為I條雙鏈和I條單鏈，如圖3 (10)，分別作為模板通過兩個途徑循環擴增，途徑一，引物Rl結合到單鏈的R1。上，在具有鏈替代作用的DNA聚合酶催化作用下，由引物Rl的3’端向5’端擴增形成雙鏈，如圖3 (12)和(13)，在65°C左右DNA處于動態平衡狀態，形成的雙鏈解離成單鏈，如圖(5)，作為初始模板起始新輪擴增；途徑二，在65°C左右，擴增產物雙鏈DNA解離成單鏈，如圖3 (14)，解離的單鏈通過堿基配對形成莖環結構，如圖3 (15)，引物F2e-Fl的Fl結合到莖環結構的Fle上，如圖3 (16)，在具有鏈替代作用的DNA聚合酶催化作用下，由引物F2e-Fl的3’端向5’端擴增，替代下雙鏈部分的相應單鏈，形成具有部分單鏈結構的擴增產物，如圖3 (8)，并由此開始循環擴增。多米諾擴增階段:循環擴增階段形成的η個雙鏈結構，如圖3 (10)和圖4 (10)，在65°C左右DNA處于動態平衡狀態，解離成2η個單鏈，如圖4 (17)，解離的單鏈通過R1。和Rl的互補配對，搭接成長短不一的類似多米諾骨牌的結構，如圖4 (18)，在DNA聚合酶催化作用下，在多米諾結構上由多個Rl。的3’端向5’端擴增，形成雙鏈結構，如圖4 (19)和(20)。另外三種引物組合方式(F1、R2C-R1 ;F2C_F1、R2 ;F2、R2C_R1)等溫擴增核酸片段的過程與上述過程相似，不再贅述。催化等溫擴增反應的酶，其特征在于，本發明中催化該擴增反應的酶為Bca(eX0-)DNA聚合酶，或Bst DNA聚合酶，或Bca (exo_) DNA聚合酶與Tag DNA聚合酶的混合物，或Bst DNA聚合酶與Tag DNA聚合酶的混合物，或其他具有相似作用的酶或酶的混合物。模板，其特征在于，核酸片段為DNA或mRNA，核酸片段為mRNA時，先使用逆轉錄酶將mRNA反轉錄成cDNA。
本發明的有益的積極效果:
1.本發明所提出的一對引物等溫擴增核酸片段的方法，可作為特異基因片段的快速擴增檢測手段。2.本發明所提出的等溫擴增核酸片段的方法具有下列各項優點:
(I)特異性強，用于等溫擴增的I對引物與靶基因的3個區段完全配對才能擴增，因而具有比PCR更高的特異性。(2)靈敏度高，該等溫擴增方法能在模板DNA純度很低的情況下進行擴增，很少受培養介質和生物學物質的影響，純化步驟可以忽略。(3)速度快，該方法是等溫擴增反應，沒有PCR反應中溫度變化的耗時，在20min 60min內即可完成反應過程。(4)易推廣，該反應是一個等溫擴增過程，不用控制溫度的變化，所以只需一個簡單的等溫器，不需要昂貴的PCR儀，對操作人員的分子生物學技術要求不高。(5)引物二聚體引起的假陽性率低，環介導等溫擴增技術需要針對靶序列的6-8個區域設計引物，其中至少靶序列的6個區域(F3。、F2C、Fl、B1、B2C和B3C)與2對引物(實質是3對引物:F3，Flc-F2, Blc-B2, B3)完全匹配才能進行擴增，如果加上環引物(LF、LB),需要設計4對引物，引物二聚體引起的假陽性率高，而本發明所提出的方法，只需要設計I對引物，與靶序列的3個或4區域配對就能擴增，因此，相對而言，本發明中引物二聚體引起的假陽性率低。(6)核酸片段長度范圍寬，環介導等溫擴增引物設計軟件限制核酸序列長度最短為200bp，該發明提出的方法可以擴增短至幾十個堿基長度。該發明提出的等溫擴增核酸片段的方法，可廣泛適用于專業化驗、海關檢疫、衛生防疫、基層衛生醫療部門、食品質量監督部門和食品企業等各層次的需求，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。

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圖1:引物設計示意圖。圖2:核酸片段合成階段示意圖。圖3:循環擴增階段示意圖。圖4:多米諾擴增階段示意圖。(五)具體實施例
核酸等溫擴增的方法有很多，例如環介導等溫擴增、滾環擴增、依賴解旋酶的等溫擴增、切刻內切酶核酸等溫擴增，正如發明內容部分所敘述，本發明所提出的等溫擴增核酸片段的方法不同于現有的任何核酸等溫擴增方法，本方法可廣泛用于人致病性病原體的檢測以及人類遺傳性疾病診斷、魚貝類致病性病原體的檢測、農牧養殖業中病原體的檢測、植物病源微生物的檢測以及食品中病源微生物的檢測。實施例1:
大腸桿菌0157:H7特異基因rfm的擴增檢測 引物設計
通過查閱文獻和用BLAST軟件分析篩選出大腸桿菌0157:叫基因片段r/M，針對該片段的四個區域設計出等溫擴增引物并合成，得到如下的引物；引物設計通PrimerPremier5.0引物設計軟件完成。上游引物F2C-F1 TTCACACTTATTGGATGGTCT-CTCTCTTTCCTCTGCGGTCC 下游引物 Rl AGGTGGAATGGTTGTCACGA
反應體系(反應總體積為25μ1 )
權利要求
1.一對引物等溫擴增核酸片段的方法，其特征在于:使用與核酸片斷3個區域互補的一對引物，在DNA聚合酶的作用下通過鏈替代反應等溫擴增核酸片段。
2.根據權利要求1所述的一對引物等溫擴增核酸片段的方法，其特征在于:針對特異性革El序列，采用PrimerPremier5.0等引物設計軟件，設計兩對類似于巢式PCR又不具有重疊序列的引物F1、F2、R2、R1，其中，F2的互補序列F2C連在Fl的5’端，或R2的互補序列R2C連在Rl的5，端。
3.根據權利要求2所述的一對引物等溫擴增核酸片段的方法，其特征在于:所述的引物設計方法，引物組合方式分別為F2C-F1、R1 ；FUR2C-R1 ;任何一種組合方式都可以實現核酸片段的等溫擴增。
4.根據權利要求1所述的一對引物等溫擴增核酸片段的方法，其特征在于:該反應是在具有鏈替代作用的DNA聚合酶的催化下進行的，反應溫度為65°C左右。
5.根據權利要求4一對引物等溫擴增核酸片段的方法，其特征在于:所述的具有鏈替代作用的DNA聚合酶，為Bca (exo-)DNA聚合酶，或Bst DNA聚合酶，或Bca (exo-)DNA聚合酶與Tag DNA聚合酶的混合物，或Bst DNA聚合酶與Tag DNA聚合酶的混合物，或其他具有相似作用的酶或酶的混合物。
6.根據權利要求1所述的一對引物等溫擴增核酸片段的方法，其特征在于:核酸片段為DNA或mRNA，核 酸片段為mRNA時，先使用逆轉錄酶將mRNA反轉錄成cDNA。
全文摘要
本發明公開了一對引物等溫擴增核酸片段的方法，使用與核酸片斷3個區域互補的一對引物，在DNA聚合酶的作用下通過鏈替代反應等溫擴增核酸片段；針對特異性靶序列，采用PrimerPremier5.0等引物設計軟件，設計兩對類似于巢式PCR又不具有重疊序列的引物F1、F2、R2、R1，其中，F2的互補序列F2C連在F1的5’端，或R2的互補序列R2C連在R1的5’端。一對引物與核酸片段的3個區域互補，在DNA聚合酶的作用下通過鏈替代反應等溫擴增核酸片段。該方法可作為特異基因片段的快速擴增檢測手段。
文檔編號C12Q1/68GK103146684SQ20131006845
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月5日 優先權日2013年3月5日
發明者王德國, 曲海濤, 張文超, 張小輝, 王樹芬, 郭山鹿 申請人:許昌學院