專利名稱：一種利用Flag蛋白標簽沉淀目的蛋白的染色質免疫共沉淀技術的制作方法
技術領域：
本發明應用到一種研究DNA與蛋白質相互作用的染色質免疫共沉淀技術(Chromatin Immunoprecipitation, Ch I P),涉及到構建目的蛋白上帶有Flag蛋白標簽的表達載體并用其抗體沉淀DNA-蛋白復合物的方法。
背景技術：
染色質免疫共沉淀技術(ChIP)是一種在體內研究轉錄因子(DNA)與靶基因啟動子區域直接相互作用的方法， 可以在體內直接確定它們之間相互作用方式的動態變化，能夠得到轉錄因子結合位點的信息，確定其直接靶基因。此項技術早期多被用于研究核小體上DNA和組蛋白的相互作用以及組蛋白的修飾等方面。近年來，染色質免疫共沉淀技術(ChIP)已經得到了許多改進和完善，成為一種被用于研究體內轉錄調控因子與靶基因啟動子上特異DNA序列相互作用的廣泛使用的技術。ChIP技術已經成為在染色質水平上研究基因表達調控的最為有效的方法。值得一提的是，此項技術與DNA芯片和分子克隆技術相結合，可用于高通量測序篩選已知目的蛋白與其相互結合的靶基因在全基因組上的分布情況。這將有助于尋找出更多的轉錄因子，為研究疾病的發病機制探明道路。染色質免疫共沉淀技術(ChIP)的原理是:在生理狀態下把細胞內的DNA與蛋白質交聯在一起，通過超聲或酶處理將染色質切為小片段后，利用抗原-抗體的特異性識別反應，將與目的蛋白相結合的DNA片段沉淀下來，以富集存在組蛋白修飾或者轉錄調控的DNA片段，再通過多種下游檢測技術(定量PCR、基因芯片、高通量測序等)來檢測此富集片段的DNA序列。染色質免疫共沉淀技術(ChIP)的靈敏度最終取決于從未結合的片段背景中分離蛋白質結合的DNA片段的能力，其中抗體的質量和IP步驟是關鍵。然而，蛋白質和基因組DNA的非特異性結合會產生不同種類的背景，這些背景能被交聯捕獲且不受IP步驟改進的影響。因為較短DNA片段的非特異性結合位點較少，所以非特異性結合水平會隨著DNA片段長度的減少而降低。

發明內容
本發明要解決的技術問題是針對在染色質免疫共沉淀中出現的抗體質量差而導致的特異性低的問題而提出的一種全新的方法。本方法是首先需要構建一個目的蛋白基因帶有Flag蛋白標簽序列的真核表達載體，檢測構建成功的表達載體是否在細胞內表達；其次將構建好的表達載體轉染進特定的細胞內；最后將細胞用甲醛交聯，超聲破碎，用Flag蛋白標簽抗體(而非目的蛋白抗體)去沉淀目的蛋白與下游靶基因的復合物，后續其他步驟同傳統的染色質免疫共沉淀技術。具體地說，本方法包括如下步驟:1.構建載體:在NCBI上查找出目的蛋白的基因序列，PCR擴增出目的片段，將擴增出的目的片段克隆進一端帶有Flag序列的真核表達載體。2.檢測構建的載體是否表達:提取質粒，將其瞬時轉染進特定細胞內48小時，提總蛋白做Western Blot檢測是否表達。3.將構建好的表達載體轉染進特定細胞內:如果步驟2證明構建的表達載體可以表達，再進行此步驟。根據不同的細胞類型和表達量的不同，選用瞬時轉染或穩定轉染，將構建的表達載體轉染進特定細胞內，待其在細胞內表達量達到預計程度后再進行步驟4。4.甲醛交聯細胞:本步驟同傳統的染色質免疫共沉淀技術(ChIP)，主要是用甲醛將細胞內的蛋白質-DNA、蛋白質-蛋白質固定下來。5.超聲破碎:本步驟同傳統的染色質免疫共沉淀技術(ChIP)，主要是用超聲破碎儀將蛋白質-DNA復合物中基因組DNA打碎到一定的長度范圍內，一般情況下是200bp-lkb。6.用Flag蛋白標簽抗體(而非目的蛋白抗體)去沉淀目的蛋白與下游靶基因的復合物:本步驟是此項方法的核心步驟。傳統的染色質免疫共沉淀技術(ChIP)是用目的蛋白抗體去沉淀目的蛋白與下游靶基因的復合物，它所存在的最大問題是抗體沉淀的效率低和抗體使用量大，而且抗體非常昂貴，然而，此項方法卻是用Flag蛋白標簽抗體代替目的蛋白抗體去沉淀目的蛋白-下游靶基因復合物。由于Flag蛋白標簽抗體特異性非常好，而且抗體價格昂貴，所以本方法解決了傳統的染色質免疫共沉淀技術(ChIP)所面臨的抗體效率低和抗體使用量大且昂貴的問題，大大節省了費用。7.后續操作步驟都同傳統的染色質免疫共沉淀技術(ChIP)。本方法具有如下 的優點和效果:1.本方法首先是構建了一個過表達體系去做染色質免疫共沉淀，因為提高了目的蛋白在細胞內的表達量，所以可以用來研究細胞內低表達的目的蛋白所調控的下游靶基因位點。2.本方法用Flag蛋白標簽抗體代替目的蛋白抗體去做沉淀，一方面提高了抗體沉淀的特異性，另一方面減少了昂貴的抗體的使用量，大大節省了費用。3.本方法是將一個帶有目的蛋白的過表達體系導入細胞內，使其在細胞內穩定表達，所以較少受到細胞狀態和自身表達量低的影響。


圖1為構建的表達載體，具體為N2ICD-3XFlag-pcDNA3.0質粒，左邊是Ikb的DNA Ladder,分子量依次是 Ikb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、8kb、IOkb,目的蛋白序列 N2ICD 為
2.3kb0圖2為構建好的表達載體在細胞內的表達，具體為N2ICD-3XFlag-pcDNA3.0質粒在BxPC3細胞內的表達，目的蛋白N2I⑶大小為IlOkD,左邊的為用Flag抗體作為一抗，右邊的為用Notch-2抗體作為一抗。圖3為超聲破碎的基因組片段，具體為將基因組打碎在200-lkb范圍內，左邊的為 IOObp 的 DNA Ladder,分子量依次是 100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、lkb、1.5kb。
具體實施方式
實施實例I我們選用Notch-2基因的胞內段N2ICD作為目的蛋白，研究其下游的靶基因，其長度為2.3kb。因此，需要構建一段N2I⑶帶有Flag蛋白標簽序列(具體設計的序列為3 XFlag序列，可參考Sigma公司)的真核表達載體，命名為N2ICD_3XFlag-pcDNA3.0。我們選用胰腺癌細胞BxPC3細胞來做染色質免疫共沉淀實驗。構建載體的具體步驟可參考《分子克隆》第三版，科學出版社出版。1.從cDNA文庫中擴增出Notch-2基因的胞內段N2I⑶序列，將其克隆進帶有3 XFlag序列的pcDNA3.0質粒里，PCR擴增檢測是否成功將N2I⑶克隆成功，如圖1所示，構建成功的質粒擴增出目的片段2.3kb。2.檢測N2ICD-3XFlag_pcDNA3.0質粒是否表達。用無菌玻璃試管37度過夜培養IOml的轉化進N2ICD-3XFlag-pcDNA3.0質粒的菌液，第二天提質粒，質粒濃度最好能夠達到500ng/ul,以利于下一步的轉染。參照Roche公司的轉染試劑說明書將N2ICD-3XFlag-pcDNA3.0質粒瞬時轉染進胰腺癌細胞BxPC3中，48小時后提取總蛋白做Western Blot觀察表達情況,結果見圖2。以下步驟應用到染色質免疫共沉淀技術(ChIP):3.確定構建的載體在BxPC3細胞內表達后，再次參照Roche公司的轉染試劑說明書將N2ICD-3 X Flag-pcDNA3.0質粒瞬時轉染進胰腺癌細胞BxPC3中，48小時待其表達穩定后開始處理細胞。4.用甲醛將細胞交聯固定，用甘氨酸終止交聯，裂解細胞提取細胞核后，再用超聲破碎儀打碎基因組，控制參數將基因組打碎在200bp-lkb之間，見圖3所示。5.用Protein G蛋白珠子(公司購買)除去體系中的非特異性蛋白，再加Flag蛋白標簽抗體進行免疫沉淀(注意:此步驟是本方法的核心部分，是用Flag蛋白標簽抗體代替了 Notch-2抗體)，再用Protein G蛋白珠子將Flag蛋白標簽抗體及其連接的目的蛋白-DNA復合物拽下,最后清洗Protein G蛋白珠子,分離Protein G蛋白珠子與目的蛋白-DNA復合物，65度解交聯，釋放DNA。6.附:傳統的染色質免疫共沉淀技術(ChIP)尋找目的蛋白N2I⑶的下游調控位點。如下所示:染色質免疫共沉淀實驗(ChIP)1.37度孵箱中培養密度為每盤3 X IO7個的BxPC3細胞，血清饑餓48h。2.蛋白G瓊脂糖球珠的封閉處理:取300 μ I溶脹好的蛋白G瓊脂糖球珠，短暫離心后棄上清，加入Iml雙蒸水，在混勻器上4°C旋轉3min洗去殘留的鹽和乙醇，重復洗3次。加入雙蒸水900μ l、10mg/ml BSA100 μ 1，在混勻器上4°C旋轉孵育過夜，備用。3.到預設時間點后馬上處理細胞。向培養基中加入4%甲醛溶液，使其終濃度為I %，混勻后在室溫下靜置交聯10分鐘。再加入1.25M甘氨酸，使其終濃度為0.125M，混勻后在室溫下靜置5分鐘終止交聯反應。倒掉反應液，將培養皿至于冰上。4.用適量41: 1\ 83將每盤細胞洗2次，吸干洗液。之后每盤加1.2111141:1\ 85，用細胞刮刮下細胞，移至1.5ml EP管中。4°C 5000rpm離心5min，棄上清，得到細胞沉淀。5.在每管細胞沉淀中加入300 μ 14 V Lysis buffer、終濃度為I X的25Xcocktail和終濃度為ImM的PMSF，吹打重懸混勻，渦旋振蕩3_5次，在冰上靜置裂解IOmin0之后4°C 8000rpm離心5min,棄上清,得到細胞核沉淀。6.在每管細胞核沉淀中加入300ul4 °C細胞核裂解液、終濃度為I X的25X cocktail和終濃度為ImM的PMSF，吹打重懸混勻，渦旋振蕩3_5次，在冰上靜置裂解IOmin07.冰上超聲3次，超聲強度50，每次5s，每次間隔lmin。之后4°C 12000rpm離心I Omin,取上清。8.每管取少量等體積上清，合并于I管中作為Input樣品，總體積50 μ I即可。再加入50 μ I雙蒸水，終濃度為0.2Μ的NaCl和2 μ I RNase Α,混勻后37°C孵育30min。之后加入2μ I蛋白酶K，65°C解交聯過夜。苯酚/氯仿抽提，I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定超聲片段大小，以200-500bp為宜。9.于每管超聲上清液中加入等體積封閉好的均質蛋白G瓊脂糖球珠懸液(總用量500μ 1)，終濃度為IX的25Xcocktail，在混勻器上4°C旋轉孵育2小時進行預清洗，以除去體系中的非特異免疫球蛋白。之后4°C 5000rpm離心2min，收集上清。10.每管加入終濃度為IX的25Xcocktail，再于其中一管中加入5μ g NormalRabbit IgG非特異性抗體作為陰性對照，其他每管中各加入5μ g特異性抗體(包括陽性對照抗體)，在混勻器上4°C旋轉孵育過夜。11.將余下的另一半蛋白G瓊脂糖球珠懸液混勻后等量加入各管中，再加入終濃度為IX的25Xcocktail，在混勻器上4°C旋轉孵育2小時進行免疫沉淀。之后4°C 5000rpm離心2min，棄上清，得到結合有DNA-轉錄因子-轉錄因子抗體復合物的蛋白G瓊脂糖球珠沉淀。

12.于4°C環境下，在混勻器上將蛋白G瓊脂糖球珠沉淀分別用Iml低鹽緩沖液、高鹽緩沖液和LiCl緩沖液各洗I次，最后用TE(pH8.0)緩沖液洗兩次，每次5min，4°C 5000rpm 離心 2min,棄上清。13.配好洗脫液。在每管蛋白G瓊脂糖球珠沉淀中加入300 μ I洗脫液重懸，在加熱混勻器上65°C、1200rpm振蕩30min進行洗脫。之后常溫5000rpm離心2min,收集上清。在每管上清中加入終濃度為0.2M的NaCl和2 μ I蛋白酶K，65°C解交聯過夜，苯酚/氯仿抽提，得到純化的目的DNA。14.PCR擴增鑒定(用HES-1啟動子特異性序列作為引物)。取模板、dNTP、10 X LATaq buffer各2μ 1，上下游引物各I μ 1，雙蒸水12ul以及Pfu高保真DNA聚合酶0.2 μ 1，加入薄壁小EP管中，充分混勻，以熱啟動的方式進行PCR擴增。程序設置為94°C 5min預變性、94°C 30s變性、退火30s、72°C延伸30s，擴增30輪。
權利要求
1.此項方法是一種利用Flag蛋白標簽沉淀目的蛋白與靶基因的染色質免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)技術,其主要目的是研究轉錄因子,此方法的獨特之處在于:構建一個目的蛋白基因序列連接有Flag蛋白標簽序列的表達載體，將至轉染進特定細胞內，利用Flag蛋白標簽抗體沉淀目的蛋白與靶基因的DNA-蛋白復合物的染色質免疫共沉淀技術(ChIP)。
2.根據權利要求1所述的技術方法，其特征在于用Flag蛋白標簽抗體替代目的蛋白抗體進行染色質免疫共沉淀(ChIP)，它的特點是:a.提高了傳統ChIP的特異性；b.減少了抗體的使用。
3.根據權利要求2所述的技術方法，其特征在于包括以下步驟: (1)構建目的蛋白基因序列連接有3XFlag蛋白標簽序列的真核表達載體(質粒)； (2)將構建好的表達載體(質粒)轉染進特定的細胞系中進行表達； (3)用Flag蛋白標簽抗體沉淀目的蛋白與其靶基因的DNA-蛋白復合物，其后續操作同傳統的染色質免疫共沉淀技術(ChIP)。
4.根據權利要求3所述的技術方法，其特征在于步驟(I)構建目的蛋白基因序列連接有3 X Flag蛋白標簽序列的真核表達載體(質粒)為: 構建一個真核表達載體，其要求:目的蛋白的N端或C端連接有一小段不超過IOObp的3XFlag蛋白標簽序列，構建成功的載體表達后目的蛋白的N端或C端帶有一段很短的Flag蛋白標簽,此Flag蛋白標簽可以與Flag蛋白標簽抗體結合,將目的蛋白沉淀下來。
5.根據權利要求3所述的技術方法，其特征在于步驟(2)將構建好的表達載體(質粒)轉染進特定的細胞系中進行表達為: 選定一種要研究的細胞 系，將構建好的真核表達載體瞬時轉染或穩定轉染進細胞內進行表達。
6.根據權利要求3所述的技術方法，其特征在于步驟(3)用Flag蛋白標簽抗體沉淀目的蛋白與其靶基因的DNA-蛋白復合物為: 用甲醛將細胞交聯，其后再進行超聲打碎基因組，再用Flag蛋白標簽抗體沉淀目的基因與其靶基因的DNA-蛋白復合物，用特定珠子將復合物拽下，最后解交聯回收得到的微量核酸。
7.根據權利要求2所述的技術方法，本方法的特點在于: a.提高了傳統ChIP的特異性:由于Flag蛋白標簽抗體與蛋白標簽結合的特異性非常好，所以本方法較傳統ChIP的特異性高，能夠減少非特異的背景，提高可信度； b.減少了抗體的使用:傳統方法需要大量的目的蛋白抗體來提高特異性，此方法能夠減少抗體的使用，節省了一定的費用。
全文摘要
一種利用Flag蛋白標簽沉淀目的蛋白的染色質免疫共沉淀技術是在目的蛋白的序列上加上了一小段Flag蛋白標簽序列，構建這樣一種真核表達載體后，將其轉染進細胞內表達，在做染色質免疫共沉淀的過程中，突破傳統的方法，用Flag蛋白標簽抗體代替目的蛋白抗體進行免疫沉淀。與傳統的方法相比，此方法提高了抗體沉淀目的蛋白的特異性，減少了抗體的使用，大大降低了實驗的費用。
文檔編號C12N15/10GK103146685SQ20131007337
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月8日 優先權日2013年3月8日
發明者張玉祥, 賴瑞 申請人:首都醫科大學