Dtt處理結合chip與emsa體內外分析擬南芥hsf1三聚體形成的方法
【專利摘要】本發明公開了一種二硫蘇糖醇處理結合染色質免疫沉淀技術與電泳遷移率變動分析體內外分析擬南芥熱激轉錄因子HSF1三聚體形成的方法。在以往的研究中，關于蛋白質分子間二硫鍵的研究方法主要采用物理化學的方法結合生物信息學進行分析，本方法采用分子生物學的方法，采用二硫鍵的還原劑二硫蘇糖醇(DL-Dithiothreitol，DTT)進行處理HSF1后，再從生物學功能的角度結合染色質免疫沉淀技術(CHIP)與電泳遷移率變動分析(EMSA)體內外研究HSF1的活性狀態，從而揭示三聚體形成與二硫鍵的關系，此方法可以把結構和功能有效的結合，是研究HSF1三聚體形成的有效方法。
【專利說明】DTT處理結合CHIP與EMSA體內外分析擬南芥HSF1三聚體形成的方法

【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物【技術領域】，具體而言，涉及DTT處理結合CHIP與EMSA體內外分析擬南芥HSFl三聚體形成的方法。

【背景技術】
[0002]植物熱激因子(heat shock transcript1n factor, HSF)是真核生物熱激反應的主要轉錄調控因子，它屬于一類在真核細胞領域保守的蛋白家族。目前對植物HSF的研究主要是以模式植物擬南芥為對象，在擬南芥中存在21個HSFs的同源體，組成HSF家族。雖然目前對絕大多數同源體的功能還不了解，但研究顯示其中HSFl是與耐逆境有關的主要調控因子[7_9] JtHSFl境信號轉導機理研究顯示，與大多數HSF相似，在非逆境條件下，HSFl以非活性的單體形式存在，逆境誘導HSFl單體形成三聚體(活性)、與靶DNA啟動子區HSE (5’ -nGAAnnTTCnnGAAn-3’)特異性結合，從而調控逆境防御基因的表達。然而，不清楚AtHsfAl三聚體是如何形成而調控逆境防御基因表達，研究熱激因子三聚體形成的化學本質與機理是未來研究的發展趨勢。對哺乳動物HSFl的基因進行定點突變研究發現:HSF1由單體轉化為多聚體活化形式需要兩個較保守的半胱氨酸殘基，這兩個半胱氨酸在氧化條件下可形成二硫鍵，暗示不同逆境信號誘導熱激因子形成三聚體可能是通過半胱氨酸氧化作用。然而不清楚擬南芥HSFl感應逆境形成三聚體是否也是通過半胱氨酸氧化作用。研究顯示HSFl的寡聚域(HR-A/B)中含有I個半胱氨酸(Cys)，HSFl三聚體與二硫鍵的關系是目前研究的熱點。在以往的研究中，關于蛋白質分子間的研究方法包括生物化學、生物物理學、遺傳學和計算機等領域的方法。所涉及的尖端技術包括表面質粒共振技術、熒光共振能量轉移、熒光極化、等溫滴定量熱法、圓二色分析、蛋白質片段補充試驗、各種雙雜交系統，以及蛋白質組方法和生物信息學方法。對于二硫鍵的研究方法主要采用物理化學的方法結合生物信息學進行分析，早期確證二硫鍵配對方式，是通過HPLC肽譜比較還原性與非還原性酶解后的肽段混合物，找出并收集差異峰，通過氨基酸組成分析或N端測序來確定肽段序列，并推測二硫鍵的配對方式。該方法過程繁瑣，精確度低，成功率低，很難確定復雜蛋白質樣品的二硫鍵配對方式。后來隨著質譜的出現，應用MALD1-T0F分析還原性與非還原性酶解后的肽段混合物的質量肽譜圖，確定二硫鍵相連肽段的分子量，從而推測二硫鍵配對方式。該法找到的肽段覆蓋率較低，約為40%左右，只能找到少數的二硫鍵。另外，該法處于一級質譜水平，可信度大打折扣。目前應用更先進的液質聯用質譜技術與多酶解相結合，通過串聯質譜技術，對找到的二硫鍵鏈接的肽段進行二級質譜分析，提高了覆蓋率到90%左右，從而顯著提高了找到二硫鍵的機會，但這種研究方法僅從分子結構的角度去驗證，由于生物分子結構的復雜性，導致實驗的難度增大。本方法采用分子生物學的方法，采用二硫鍵的還原劑二硫蘇糖醇(DL-Dith1threitol，DTT)進行處理HSFl后，從熱激因子HSFl體內外的生物學功能來推測其三聚體是否形成，如何形成。體內研究HSFl的生物學功能采用染色質免疫沉淀技術，其染色質免疫沉淀技術的基本原理是在生理狀態下把細胞內的蛋白質和DNA共價交聯在一起，超聲波將其打碎為一定長度范圍內的染色質小片段，然后通過所要研究的目的蛋白質特異性抗體沉淀此復合體，用Protein-A/G-Agarose/Sepharose特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，用不含Dnase的Rnase和ProteinaseK解除交聯，純化DNA，通過對目的片斷的檢測，從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。此方法可以克服體外研究DNA-蛋白質相互作用的局限，具體表現在以下幾個方面:首先，每次分離轉錄調控蛋白結合的靶DNA片段，不僅能得到一些親和力高的DNA片段，還能富集親和力弱的靶DNA片段。其次體內蛋白質與DNA的結合可以充分反映生理條件下DNA與蛋白質相互作用的真實情況，找出在生理條件下某個DNA結合蛋白與DNA序列的結合位點，從而反映體內基因表達調控的真實情況。體外研究HSFl的生物學功能采用電泳遷移率變動分析(EMSA)又稱為凝膠阻滯分析，它是一種在體外證實目的蛋白與靶DNA直接結合的方法。在EMSA中，目的蛋白與生物素標記的靶DNA混合后，用電泳分離，如果目的蛋白結合于靶DNA，電泳帶移動將會緩慢。二硫蘇糖醇處理后，從生物學功能的角度結合染色質免疫沉淀技術(CHIP)與電泳遷移率變動分析(EMSA)體內外研究HSFl的活性狀態，從而揭示三聚體形成與二硫鍵的關系。這種方法可以把擬南芥熱激轉錄因子HSFl結構和功能有效的結合，是研究HSFl三聚體形成的有效方法。


【發明內容】

[0003]為解決上述現有技術存在的問題，本發明的目的是提供一種DTT ( 二硫蘇糖醇)處理結合CHIP (染色質免疫沉淀技術)與EMSA (電泳遷移率變動分析)體內外分析HSFl (擬南芥熱激轉錄因子)三聚體形成的方法。可以把擬南芥熱激轉錄因子HSFl結構和功能有效的結合，是研究HSFl三聚體形成的有效方法。
[0004]為達到上述目的，本發明的技術方案為:
[0005]一種DTT處理結合CHIP與EMSA體內外分析擬南芥熱激轉錄因子HSFl三聚體形成的方法，包括如下步驟:
[0006]步驟一、逆境處理擬南芥小苗和熱激因子HSFl ；
[0007]步驟二、DTT處理逆境脅迫后擬南芥小苗和純化的蛋白；
[0008]步驟三、將上述各種體內逆境處理和未處理的小苗用甲醛交聯和染色質免疫沉淀技術，獲得染色質免疫沉淀DNA ；
[0009]步驟四、利用電泳遷移率變動分析EMSA研究不同逆境在體外對HSFl的激活。
[0010]進一步的，所述步驟一中，逆境處理擬南芥小苗和熱激因子HSFl的具體步驟為:
[0011]逆境處理擬南芥小苗和熱激因子HSFl:
[0012](1.1)逆境處理擬南芥小苗:
[0013]取生長4周的小苗放入培養buffer中進行以下逆境處理:
[0014](I)熱激處理:39°C水浴中震蕩培養30min ；
[0015](2)酸脅迫:經琥珀酸調整后pH值為3.5，在真空下處理20min ；
[0016](3)堿脅迫:經Tris調整后pH值為8.0,在真空下處理20min ；
[0017](4) H2O2脅迫(氧化脅迫):加入H2O2使其終濃度為0.4mM,在真空下處理45min ；
[0018](5)鹽脅迫:加入NaCl使其終濃度為1.2M,在真空下處理45min ；
[0019](6)滲透脅迫:加入山梨醇使其終濃度為1.7M,在真空下處理45min ；
[0020](7)對照:不經過任何逆境處理；
[0021](1.2)逆境處理熱激因子HSFl:
[0022](1.2.DHSFl的非變性表達純化；
[0023](1.2.2) HSFl的體外逆境處理；
[0024](I)熱脅迫:取140 μ I純化后的HSFl重組蛋白，39°C處理30min ；
[0025](2)酸脅迫:琥珀酸 0.05M, pH 為 6.5，處理 20min ；
[0026](3)堿脅迫=Tris 濃度為 0.33M，pH 為 8.8，處理 20min ；
[0027](4) H2O2脅迫(氧化脅迫):過氧化氫濃度為0.4mM,處理45min ；
[0028](5)鹽脅迫=NaCl濃度為1M，處理Ih ；
[0029](6)滲透脅迫:山梨糖醇濃度為1M，處理Ih ；
[0030](7)對照:不經過任何逆境處理；
[0031]進一步的，所述步驟二中，DTT處理逆境脅迫后擬南芥小苗和純化的蛋白的具體步驟包括:
[0032](I) DTT處理逆境脅迫后擬南芥小苗；
[0033]將上述各種逆境處理和未處理的小苗，在室溫下浸入交聯緩沖液中，加入50mMDTT在真空下處理Ih ；
[0034](2) DTT處理逆境脅迫后純化的蛋白；
[0035]取140ul蛋白質分別用熱、酸、堿、H2O2逆境處理后，用DTT處理；將DTT加入至終濃度為5mM，25°C條件下放置30min。
[0036]進一步的，所述步驟三中，染色質免疫沉淀的具體步驟為:
[0037](I)、封閉和洗滌蛋白A瓊脂糖膠；
[0038]在1.5ml Eppendorf管中加入60 μ 150%懸浮的蛋白A瓊脂糖膠,每次以Iml裂解緩沖液 l(50mM HEPES-K0H, ρΗ7.5,140mM NaCl, ImM EDTA, 1% TritonX-100,0.1%脫氧膽酸鈉，ImM PMSF)洗滌兩次，lOOOrpm，4°C，離心lmin，收集蛋白A瓊脂糖膠，再加ImlI % BSA于上述蛋白A瓊脂糖膠中，4°C共培養6h封閉其非特異性位點；
[0039]用Iml裂解緩沖液I洗封閉后的蛋白A瓊脂糖膠，lOOOrpm, 4°C，離心lmin，收集沉淀；重復洗滌一次，離心收集沉淀；
[0040](2)、抗血清與擬南芥細胞上清液共培養；
[0041]加60 μ I抗AHSF的抗血清于上述擬南芥細胞上清液中，4°C共培養4h ;對照實驗中加等體積的PBS緩沖液；
[0042](3)、蛋白A瓊脂糖膠和抗體共溫育后的擬南芥細胞共培養；
[0043]蛋白A瓊脂糖膠沉淀轉入與抗體共溫育后的擬南芥細胞破碎液中，4°C冰浴培養30min一 Ih ; lOOOrpm, 4°C,離心 lmin,收集沉淀；
[0044](4)、洗滌蛋白A瓊脂糖膠；
[0045](5)、洗脫免疫沉淀DNA和蛋白質復合物；
[0046](6)、Klenow DNA聚合酶處理免疫沉淀DNA和蛋白質復合物；
[0047]

【權利要求】
1.一種DTT處理結合CHIP與EMSA體內外分析擬南芥熱激轉錄因子HSFl三聚體形成的方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一、逆境處理擬南芥小苗和熱激因子HSFl ； 步驟二、DTT處理逆境脅迫后擬南芥小苗和純化的蛋白； 步驟三、將上述各種體內逆境處理和未處理的小苗用甲醛交聯和染色質免疫沉淀技術，獲得染色質免疫沉淀DNA ； 步驟四、利用電泳遷移率變動分析EMSA研究不同逆境在體外對HSFl的激活。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟一中，逆境處理擬南芥小苗和熱激因子HSFl的具體步驟為: 逆境處理擬南芥小苗和熱激因子HSFl: (1.D逆境處理擬南芥小苗: 取生長4周的小苗放入培養buffer中進行以下逆境處理: (1)熱激處理:39°C水浴中震蕩培養30min； (2)酸脅迫:經琥珀酸調整后pH值為3.5，在真空下處理20min ； (3)堿脅迫:經Tris調整后pH值為8.0,在真空下處理20min ；(4)H2O2脅迫(氧化脅迫):加入H2O2使其終濃度為0.4mM,在真空下處理45min ； (5)鹽脅迫:加入NaCl使其終濃度為1.2M,在真空下處理45min ； (6)滲透脅迫:加入山梨醇使其終濃度為1.7M,在真空下處理45min ； (7)對照:不經過任何逆境處理； (1.2)逆境處理熱激因子HSFl: (1.2.DHSFl的非變性表達純化； (1.2.2) HSFl的體外逆境處理； (1)熱脅迫:取140μ I純化后的HSFl重組蛋白，39°C處理30min ； (2)酸脅迫:琥珀酸0.05M, pH為6.5，處理20min ； (3)堿脅迫=Tris濃度為0.33M，pH為8.8，處理20min ； (4)H2O2脅迫(氧化脅迫):過氧化氫濃度為0.4mM,處理45min ； (5)鹽脅迫=NaCl濃度為1M，處理Ih； (6)滲透脅迫:山梨糖醇濃度為1M，處理Ih； (7)對照:不經過任何逆境處理。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟二中，DTT處理逆境脅迫后擬南芥小苗和純化的蛋白的具體步驟包括: (1)DTT處理逆境脅迫后擬南芥小苗； 將上述各種逆境處理和未處理的小苗，在室溫下浸入交聯緩沖液中，加入50mMDTT在真空下處理Ih ； (2)DTT處理逆境脅迫后純化的蛋白； 取140ul蛋白質分別用熱、酸、堿、H2O2逆境處理后，用DTT處理；將DTT加入至終濃度為5mM，25°C條件下放置30min。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟三中，染色質免疫沉淀的具體步驟為: (1)、封閉和洗滌蛋白A瓊脂糖膠； 在1.5ml Eppendorf管中加入60 μ 150%懸浮的蛋白A瓊脂糖膠,每次以Iml裂解緩沖液 I (50mM HEPES-K0H, ρΗ7.5，140mM NaCl, ImM EDTA, 1% TritonX-100,0.1 %脫氧膽酸鈉，ImM PMSF)洗滌兩次，lOOOrpm，4°C，離心lmin，收集蛋白A瓊脂糖膠，再加ImlI % BSA于上述蛋白A瓊脂糖膠中，4°C共培養6h封閉其非特異性位點； 用Iml裂解緩沖液I洗封閉后的蛋白A瓊脂糖膠，lOOOrpm，4°C，離心lmin，收集沉淀；重復洗滌一次，離心收集沉淀； (2)、抗血清與擬南芥細胞上清液共培養； 加60 μ I抗AHSF的抗血清于上述擬南芥細胞上清液中，4°C共培養4h ;對照實驗中加等體積的PBS緩沖液； (3)、蛋白A瓊脂糖膠和抗體共溫育后的擬南芥細胞共培養； 蛋白A瓊脂糖膠沉淀轉入與抗體共溫育后的擬南芥細胞破碎液中，4 °C冰浴培養30min一 Ih ; lOOOrpm, 4°C,離心 lmin,收集沉淀； (4)、洗滌蛋白A瓊脂糖膠； (5)、洗脫免疫沉淀DNA和蛋白質復合物； (6)、KlenowDNA聚合酶處理免疫沉淀DNA和蛋白質復合物；免疫沉淀?合物90 μ?1mMdNTPsI μ?10 ? buffer10 μ?Klenow(2 U/μΙ)I μ? 在0.5ml的Eppendorf管中依次加入上述試劑和免疫沉淀復合物，混勻后并短暫離心，在 25°C反應 30min，75°C加熱 1min ； (7)、蛋白酶K水解蛋白； 加入等體積(102 μ I) lmg/ml 蛋白酶 K (溶于 50mM Tris, 1mM EDTA, 0.3 %SDS, ρΗ7.5)，60°C水浴過夜； (8)、免疫沉淀DNA的分離純化； 向上述獲得的免疫沉淀DNA洗脫液中加入等體積的苯酚/氯仿(1:1)混合物，渦旋混勻；14000rpm離心3min,將上清轉至新的1.5ml離心管中；加等體積苯酹/氯仿(1:1)，混勻后14000rpm離心3min ;取上清,加等體積氯仿抽提，14000rpm離心3min ;上清轉至1.5ml離心管中；加1/10體積的醋酸鈉，2.5倍體積100%的乙醇及20 μ g糖元，-20°C，靜置過夜；14000rpm離心30min ;去上清,M 70%酒精洗沉淀；14000rpm離心30min ;抽干，加入20 μ ITE緩沖液(或無菌水)溶解沉淀，-20°C保存； (9)、PCR分析免疫沉淀DNA； 根據己發表的擬南芥熱激基因及非熱激基因的全基因序列分別設計啟動子區引物18.2P、70P和編碼區的引物18.2C ； 用以下體系進行PCR檢測；10 X PCR buffer2μ1
PCR擴增的參數為:94°C預變性5min，然后以94°C 20s為變性參數，49_56°C 20s為退火參數，72°C 1s為延伸參數，循環數為25 ;經10% DNA聚丙烯酰氨凝膠分析PCR產物。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟(9)中，所述啟動子區引物18.2P、70P和編碼區的引物18.2C的序列分別為:啟動子區引物18.2P序列為:
AtHSP 18.2/-229u:5’ -ATT TTT CTT GGC ATT TCA GG-3’
AtHSP 18.2/-243d:5’ -GCA TTT CGG TCT TGT TTC A_3’ (52°C ) 啟動子區引物70P序列為:
AtHSP 70/-304u:5’ -AAA TTG TCA AAT AGT AAC TC-3’
AtHSP 70/-325d:5’ -ATG TTA ATT GGG TGA TGA A -3’ 編碼區的引物18.2C序列為:
AtHSP 18.2/-5014u:5’ -TGA CGT TGT TTA AAT CTG TTC-3，
AtHSP 18.2/-5033d:5’ -CCG TAC GCA TCC TTC TC-3，。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟四利用電泳遷移率變動分析EMSA研究不同逆境在體外對HSFl的激活的具體步驟為: (1)、探針的制備: 采用與保守序列相同的片斷做為探針，用Touch down PCR合成雙鏈；
Perfect-HSE: 5，-GGCTTCAAGAAGCTTCTATG-3，，5，-CATAGAAGCTTCTTGAAGCC-3’(3，生物素標記) (2)、EMSA結合反應: 如下設置EMSA結合反應: 陰性對照反應:其中陰性對照I為未經任何逆境處理；陰性對照2為未加DTT:
樣品反應:加入逆境處理HSFl:
【文檔編號】C12Q1/68GK104198719SQ201410335904
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月15日 優先權日:2014年7月15日
【發明者】郭麗紅, 劉艷芳, 蘇源, 楊曉虹, 陳子牛 申請人:昆明學院